黃 宏， 王如娟， 朱慧芬， 楊道鋒

1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院呼吸與危重癥學(xué)科，武漢 4300302華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系，武漢 4300303華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院感染科，武漢 430030

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TGF-β在香煙煙霧提取物誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的作用

黃 宏1， 王如娟1， 朱慧芬2， 楊道鋒3△

1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院呼吸與危重癥學(xué)科，武漢 430030
2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系，武漢 4300303華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院感染科，武漢 430030

目的 探討TGF-β在香煙煙霧提取物(cigarette smoke extract，CSE)誘導(dǎo)的正常人外周血中性粒細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ER stress)中的作用。方法 實驗分3組：正常對照組、CSE刺激組、CSE刺激+內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-苯基丁酸(4-phenylbutyrate，4-PBA)組。培養(yǎng)正常人外周血中性粒細(xì)胞，給予不同濃度的CSE刺激16 h，流式細(xì)胞術(shù)檢測中性粒細(xì)胞GRP78、TGF-β、NF-κB、ERK、p38-MAPK的表達(dá)，ELISA法檢測CXCL-8蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 CSE增強(qiáng)中性粒細(xì)胞GRP78及TGF-β的表達(dá)，并在一定范圍內(nèi)呈濃度依賴性；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-PBA減少CXCL-8的分泌(P<0.05)和TGF-β的表達(dá)(P<0.05)。CSE對中性粒細(xì)胞表面NF-κB、ERK、p38-MAPK的表達(dá)無明顯作用。結(jié)論 CSE誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，并上調(diào)CXCL-8和TGF-β水平；4-PBA減少中性粒細(xì)胞分泌CXCL-8，可能與下調(diào)TGF-β表達(dá)有關(guān)。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激； 香煙煙霧提取物； 中性粒細(xì)胞； 轉(zhuǎn)化生長因子-β

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是以持續(xù)氣流受限為特征的氣道、肺實質(zhì)和肺血管的慢性炎癥，而氣道中性粒細(xì)胞的募集和激活是重要的環(huán)節(jié)之一[1]。中性粒細(xì)胞在多種刺激因子例如脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)和嗜酸性粒細(xì)胞主要堿基蛋白等的作用下進(jìn)一步分泌白細(xì)胞介素-8(IL-8/CXCL-8)。CXCL-8是重要的中性粒細(xì)胞趨化因子，內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞均能合成和分泌CXCL-8。吸煙是COPD最主要的致病因素[2],研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)吸煙導(dǎo)致COPD肺組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ER stress)標(biāo)志物糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein 78，GRP78)表達(dá)上調(diào)[3-4]。最近，有研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可通過非折疊蛋白反應(yīng)(unfold protein response，UPR)偶聯(lián)NF-κB、JNK/AP1等炎癥通路調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)的表達(dá)[5]，而NF-κB是中性粒細(xì)胞趨化因子CXCL-8重要的轉(zhuǎn)錄因子，因此我們推測香煙煙霧提取物(cigarette smoke extract，CSE)可以通過UPR信號途徑參與中性粒細(xì)胞的趨化作用。本實驗采用CSE刺激正常人外周血中性粒細(xì)胞，并檢測不同炎癥通路蛋白的表達(dá)，同時觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-苯基丁酸(4-phenylbutyrate，4-PBA)對中性粒細(xì)胞分泌CXCL-8的影響，初步探討不同信號通路在CSE誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的作用。

1 材料與方法

1.1 CSE制備

參照Nakamura等[6]的方法制備CSE。用2支去過濾嘴香煙(紅金龍牌，武漢卷煙廠，含焦油15 mg、煙堿1.1 mg)由負(fù)壓驅(qū)動裝置連續(xù)抽吸而燃燒，10 min內(nèi)燃燒完。吸入的煙霧經(jīng)另一出口進(jìn)入并溶于50 mL RPMI 1640培養(yǎng)液中，搖晃使其完全溶解。制成的懸液密閉搖勻后用NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.4，經(jīng)0.22 μm微孔濾器過濾除菌，即為CSE原液，制備后30 min內(nèi)用于實驗。

1.2 中性粒細(xì)胞分離

取健康供血者外周血5 mL，加至淋巴細(xì)胞分層液上，2 000 r/min×20 min離心，分離單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，去除PBMC、分離液和血漿。紅細(xì)胞和粒細(xì)胞用5 mL PBS重懸，加入等體積的6% Dextran T500混勻，靜置20 min后，吸取上層白細(xì)胞至另一干凈離心管中，離心1 200 r/min×5 min，去上清。再加入10 mL紅細(xì)胞裂解液，室溫裂解7 min，離心1 000 r/min×5 min，去上清后，加入10 mL PBS，混勻計數(shù)，用10% FCS RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為3×106/mL，加入48孔板中，500 μL/孔。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測信號蛋白的表達(dá)

實驗分3組：①正常對照組，加入PBS；②CSE刺激組，CSE終濃度分別為5%、10%和20%；③CSE刺激組+內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激阻斷劑4-PBA組，根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果選擇20%CSE，并于CSE刺激前1 h加入4-PBA，4-PBA終濃度為5 mmol/L。37℃培養(yǎng)16 h。采用流式細(xì)胞儀(FACSCalibur流式細(xì)胞儀，美國BD公司)檢測中性粒細(xì)胞表面TGF-β、胞內(nèi)GRP78、核內(nèi)NF-κB、ERK、p38-MAPK的平均熒光強(qiáng)度(mean fluorescence intensity，MFI)。TGF-β、ERK、p38-MAPK檢測試劑盒為eBioscience公司產(chǎn)品，GRP78、NF-κB檢測試劑盒為Biolegend公司產(chǎn)品。

1.4 ELISA法檢測CXCL-8表達(dá)水平

實驗具體分組同上。刺激24 h后收取培養(yǎng)上清。ELISA法測CXCL-8蛋白表達(dá)水平，操作步驟嚴(yán)格按照北京達(dá)科為生物技術(shù)公司人CXCL-8預(yù)包被試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

本實驗采用GraphPad Prism 6.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，多組間差異比較采用單因素方差分析，兩組間差異比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CSE刺激中性粒細(xì)胞表達(dá)GRP78、TGF-β及4-PBA對TGF-β表達(dá)的影響

CSE刺激下，正常人外周血中中性粒細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物GRP78的表達(dá)水平逐漸升高，且呈濃度依賴性；TGF-β表達(dá)也明顯增強(qiáng)，亦呈濃度依賴性，而且4-PBA可明顯減弱TGF-β的表達(dá)。見圖1。

2.2 CSE刺激中性粒細(xì)胞NF-κB、p38-MAPK、ERK的表達(dá)

圖2可見，隨著CSE刺激濃度增加，NF-κB、p38-MAPK、ERK的表達(dá)水平亦有逐漸升高趨勢，但與正常對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。

1：正常對照；2：5%CSE；3：10%CSE；4：20%CSE；5：20%CSE+5 mmol/L 4-PBA；與正常對照組比較，*P<0.05；與10%CSE組比較，#P<0.05；與20%CSE組比較，△P<0.05圖1 CSE刺激中性粒細(xì)胞表達(dá)GRP78、TGF-β及4-PBA對TGF-β表達(dá)的影響(n=4)Fig.1 MFI of GRP-78 and TGF-β on neutrophils stimulated with CSE and effect of 4-PBA on expression of TGF-β (n=4)

1：正常對照；2：5%CSE；3：10%CSE；4：20%CSE圖2 CSE刺激中性粒細(xì)胞NF-κB、p38-MAPK、ERK的表達(dá)(n=3)Fig.2 MFI of NF-κB，p38-MAPK and ERK on neutrophils stimulated with CSE (n=3)

2.3 CSE刺激中性粒細(xì)胞分泌CXCL-8及4-PBA對CXCL-8分泌的影響

圖3可見：與正常對照組比較，CSE刺激組CXCL-8表達(dá)水平均升高，且呈濃度依賴性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-PBA作用下CXCL-8表達(dá)水平較CSE刺激組降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

1：正常對照；2：5%CSE；3：10%CSE；4：20%CSE；5：20%CSE+5 mmol/L 4-PBA；與正常對照組比較，*P<0.05；與5%CSE組比較，▲P<0.05；與10%CSE組比較，#P<0.05；與20%CSE組比較，△P<0.05圖3 ELISA法檢測各組中性粒細(xì)胞CXCL-8分泌水平及4-PBA對其的影響(n=3)Fig.3 Detection of secretion of CXCL-8 from neutrophils by ELISA and effect of 4-PBA on CXCL-8(n=3)

3 討論

COPD的慢性氣道炎癥以中性粒細(xì)胞浸潤為主要特征之一。吸煙是COPD的重要致病因素。研究已證實吸煙者較非吸煙者外周血中性粒細(xì)胞計數(shù)明顯增多，吸煙的COPD患者其肺泡灌洗液、支氣管腺體和痰液中的中性粒細(xì)胞亦顯著增加。香煙煙霧含有4 000多種化合物，其中包括自由基以及多種毒性成分[7]，吸煙導(dǎo)致氣道上皮、血管內(nèi)皮、巨噬細(xì)胞釋放前炎性因子和粘附分子，吸引中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞的遷移并活化，參與氣道炎癥和重構(gòu)。但是，吸煙對外周血中性粒細(xì)胞的直接作用以及相關(guān)的信號通路則少見報道。近來研究表明吸煙COPD動物模型以及吸煙COPD患者肺組織存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，并參與炎癥過程[4，8]，然而，吸煙是否影響中性粒細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，以及相關(guān)的信號途徑尚未見報道。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)是細(xì)胞內(nèi)蛋白合成、加工修飾及鈣離子儲存的主要場所，當(dāng)細(xì)胞受到缺氧、感染、自由基、藥物等刺激時，未折疊或錯誤折疊的蛋白質(zhì)在ER內(nèi)異常堆積，發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。正常情況下，ER膜上的3個跨膜蛋白肌醇需要酶1(inositol requiring protein-1，IRE1)、PKR樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(kinase RNA-like ER kinase，PERK)和活化轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcriptionfactor 6，ATF6)與GRP78結(jié)合形成蛋白復(fù)合物，維持無活性狀態(tài)；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時，GRP78與非折疊或錯誤折疊的蛋白結(jié)合，IRE1、PERK和ATF6與GRP78解離并活化，啟動適應(yīng)性非折疊蛋白反應(yīng)，增強(qiáng)對蛋白的折疊能力，加速非折疊蛋白的降解，從而恢復(fù)和維持ER內(nèi)環(huán)境的相對穩(wěn)態(tài)。然而，過度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可通過非折疊蛋白反應(yīng)偶聯(lián)NF-κB、JNK/AP-1等多種炎癥通路，上調(diào)炎癥因子的表達(dá)[5]。多項研究[9-11]發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與多種因素誘導(dǎo)的肺部炎癥，例如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過NF-κB通路參與了哮喘小鼠肺部炎癥及脂多糖誘導(dǎo)的小鼠肺部炎癥，體外實驗用CSE刺激A549細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)JNK通路參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)節(jié)CXCL-8表達(dá)過程。TGF-β是具有廣泛生物學(xué)活性的多肽生長因子。TGF-β促進(jìn)IL-1、IL-6和CXCL-8等因子的釋放，參與COPD的氣道炎癥和重建。研究表明，TGF-β參與誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[12]。本實驗初步探討了TGF-β、NF-κB、ERK、p38-MAPK信號蛋白在CSE誘導(dǎo)的人外周血中性粒細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的作用，結(jié)果顯示CSE顯著增強(qiáng)TGF-β的表達(dá)，4-PBA則能下調(diào)20%CSE刺激下TGF-β的表達(dá)水平，表明TGF-β信號可能參與CSE誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。我們的結(jié)果亦表明，盡管CSE能上調(diào)中性粒細(xì)胞NF-κB、ERK、p38-MAPK，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

本研究用CSE刺激中性粒細(xì)胞，實驗結(jié)果顯示，在CSE刺激作用下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物GRP78表達(dá)升高，且呈濃度依賴性。同時，我們發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激阻斷劑4-PBA能顯著抑制CSE刺激的中性粒細(xì)胞分泌CXCL-8。我們的結(jié)果表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與了吸煙誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞分泌CXCL-8。CXCL-8是重要的中性粒細(xì)胞趨化因子，CXCL-8不僅促進(jìn)中性粒細(xì)胞細(xì)胞粘附，還能促進(jìn)中性粒細(xì)胞跨內(nèi)皮移動和活化[13]。有研究發(fā)現(xiàn)在LPS誘導(dǎo)的小鼠肺部炎癥中，肺泡灌洗液、肺泡腔及支氣管周圍以中性粒細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞明顯增多，4-PBA能明顯減弱上述作用[14]，4-PBA還能減弱卵清白蛋白(OVA)誘導(dǎo)的哮喘小鼠模型肺組織中以嗜酸性粒細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤[15]。我們的結(jié)果表明CSE誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激阻斷劑能明顯減少中性粒細(xì)胞分泌CXCL-8，結(jié)合上述信號通路的研究，提示4-PBA減少CXCL-8的分泌，可能與TGF-β有關(guān)。

綜上所述，CSE可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，并上調(diào)CXCL-8和TGF-β水平。抑制CSE誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，可能是通過下調(diào)TGF-β水平進(jìn)而減少了CXCL-8的分泌所致。

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(2016-06-16 收稿)

Effect of TGF-β in Endoplasmic Reticulum Stress of Neutrophils Induced with Cigarette Smoke Extract

Huang Hong1，Wang Rujuan1，Zhu Huifen2etal

1DepartmentofRespiratoryandCriticalCareMedicine，TongjiHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430030，China2DepartmentofImmunology，SchoolofBasicMedicine，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430030，China

Objective To investigate the effect of TGF-β in endoplasmic reticulum stress (ER stress)of neutrophils induced by cigarette smoke extract (CSE).Methods Neutrophils were cultured and divided into 3 groups：normal control group，CSE-stimulation group，and CSE+4-phenylbutyrate(4-PBA)group.Neutrophils were cultured and stimulated with CSE for 16 h at concentrations of 5%，10% and 20%，respectively.GRP78，TGF-β，NF-κB，ERK and p38-MAPK were detected by flow cytometry.ELISA was performed to test the secretion of CXCL-8.Results The expression of GRP78 and TGF-β was increased in CSE-stimulated neutrophils(P<0.05)，furthermore，it was concentration-dependent in a certain range.4-PBA significantly reduced the expression of CXCL-8 and TGF-β(P<0.05)，in addition，CSE did not significantly affect the expression of NF-κB，ERK and p38-MAPK on neutrophils.Conclusion Cigarette smoke extract induces ER stress in neutrophils and up-regulates CXCL-8 and TGF-β；4-PBA decreases secretion of CXCL-8 in 4-PBA probably through down-regulating the expression of TGF-β.

endoplasmic reticulum stress； cigarette smoke extract； neutrophils； transforming growth factor-β

R329.28

10.3870/j.issn.1672-0741.2016.06.008

黃 宏，女，1967年生，副教授，副主任醫(yī)師，E-mail：huanghong@tjh.tjmu.edu.cn

△通訊作者，Corresponding author，E-mail：yandaofeng@aliyun.com