李 霞， 何攀文， 吳建紅， 朱清靜， 蔡艷萍， 韓曉群

1武漢市醫(yī)療救治中心肝病科，武漢 4300232華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，武漢 4300143宜春學(xué)院醫(yī)學(xué)院微生物與免疫學(xué)教研室，宜春 336000

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#同為第一作者

siRNA干擾血管生成素2基因表達(dá)抑制小鼠肝癌移植瘤生長

李 霞1#， 何攀文2#， 吳建紅1， 朱清靜1， 蔡艷萍1， 韓曉群3△

1武漢市醫(yī)療救治中心肝病科，武漢 4300232華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，武漢 430014
3宜春學(xué)院醫(yī)學(xué)院微生物與免疫學(xué)教研室，宜春 336000

目的 探討siRNA干擾血管生成素2(Ang-2)基因表達(dá)對小鼠肝癌移植瘤生長的抑制作用。方法 分別以轉(zhuǎn)染pLVX-shRNA-Ang-2、pLVX-Ang-2的人肝癌HepG2細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞為來源，建立裸鼠皮下移植瘤模型。實(shí)驗(yàn)分3組：pLVX-shRNA-Ang-2組、pLVX-Ang-2組和對照組，每組10只。觀察并測量瘤體體積，各組腫瘤組織分別行蘇木精-伊紅染色及透射電子顯微鏡下觀察，對比病理改變。分別采用Real-timePCR和Westernblot檢測腫瘤組織中Ang-2基因和蛋白表達(dá)，采用免疫熒光染色檢測CD34表達(dá)。結(jié)果 與pLVX-Ang-2組和對照組比較，pLVX-shRNA-Ang-2組瘤體體積小，組織壞死不明顯，腫瘤細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)基本正常，Ang-2基因及蛋白表達(dá)明顯下降(均P<0.05)，CD34表達(dá)明顯下降。結(jié)論 采用siRNA干擾技術(shù)敲除Ang-2基因，能夠減少肝癌組織新生血管的生成，抑制腫瘤的生長。

RNA干擾； 血管生成素2； 肝癌

原發(fā)性肝癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，我國每年約22萬人死于該病。目前認(rèn)為，對于不可切除的中、晚期肝癌，經(jīng)肝動脈化療栓塞(TACE)和經(jīng)動脈灌注化療(TAI)等介入治療是主要治療手段，在抑制腫瘤生長，提高患者生存率等方面取得了明顯效果。TACE是通過栓塞腫瘤的供血動脈使得腫瘤缺血壞死，同時抗腫瘤藥物可在腫瘤局部緩慢釋放起到化療作用。但現(xiàn)在已有研究表明：TACE后腫瘤和正常組織缺血、缺氧可使腫瘤細(xì)胞及瘤周正常細(xì)胞分泌促血管生成物質(zhì)，如成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor,FGF)和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等，使腫瘤血管側(cè)支循環(huán)形成，增加了再次TACE治療的難度，是肝癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移及肝癌患者預(yù)后不良的主要影響因素。

新近發(fā)現(xiàn)血管生成素(angiopoietin，Ang)在血管新生中作用顯著，尤其是血管生成素2(angiopoietin-2，Ang-2)，特異表達(dá)于腫瘤邊緣的血管重建區(qū)，參與腫瘤血管新生的起始及延續(xù)過程，影響腫瘤生長及轉(zhuǎn)移，有望成為一種新的抗腫瘤血管新生的靶向因子。大量研究顯示，通過阻斷angiopoietin-Tie-2途徑治療腫瘤是可行的，例如Oliner等[1]的研究顯示Ang-2抑制劑可以抑制裸鼠表皮腫瘤的內(nèi)皮細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞的增殖，抑制新血管的形成，抑制腫瘤生長，促進(jìn)腫瘤消退。Ang-2抗體還可抑制雞胚胎結(jié)腸癌移植模型的新生血管生成[2]。但抑制Ang-2是否也可以延緩肝癌組織新生血管的生成從而抑制肝癌細(xì)胞的生長，尚未見報道。

本研究擬通過小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)干擾Ang-2基因表達(dá)，觀察其對腫瘤抑制的體內(nèi)效果，為臨床抗腫瘤血管生成治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物及Ang-2基因沉默載體質(zhì)粒的設(shè)計、合成和定量 雌性裸鼠(約5周齡，體重18～20 g)購于武漢大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心。siRNA分子設(shè)計、合成及Ang-2基因沉默載體質(zhì)粒構(gòu)建由武漢巴菲爾生物公司完成，干擾Ang-2基因的體外效應(yīng)由本課題組前期完成，并經(jīng)過基因測序鑒定。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 實(shí)時熒光定量PCR儀購自ABI公司；PCR儀購自東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；水平電泳儀和紫外分析儀購自北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；Ang-2購自Santa Cruz公司；Trizol購自Invitrogen公司；cDNA第1鏈合成試劑盒和SYBR Green/Flourescein qPCR Master Mix(2×)購自Fermentas公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司；β-actin抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；顯影定影試劑盒購自武漢巴菲爾生物技術(shù)有限公司；CD34(種屬：兔)購自Abcam公司。由金斯瑞公司完成引物合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取細(xì)胞瓶內(nèi)融合度達(dá)80%的HepG2細(xì)胞；用含EDTA的0.25%胰酶消化細(xì)胞，終止消化后收集，1 200 r/min離心5 min，去上清，加RPMI 1640培養(yǎng)液重懸，稀釋至1×106/mL，每孔2 mL接種于6孔板，正常培養(yǎng)24 h；取6孔板更換新鮮培養(yǎng)液，每孔加入20 μL慢病毒，正常培養(yǎng)24 h；轉(zhuǎn)染后熒光鏡下照相，并收集細(xì)胞。

1.2.2 動物分組及模型制作 健康雌性裸鼠30只，分為3組，分別以轉(zhuǎn)染pLVX-shRNA-Ang-2的HepG2細(xì)胞(pLVX-shRNA-Ang-2組)、轉(zhuǎn)染pLVX-Ang-2的HepG2細(xì)胞(pLVX-Ang-2組)及未轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞(對照組)注射接種，每組10只。將提前收集好的3種細(xì)胞，濃度約為2×108/mL，在背部皮下處接種，接種劑量為0.1 mL。在接種后12 d左右，裸鼠注射接種處出現(xiàn)可見腫瘤，每隔7 d裸鼠稱重記錄體重，并測量腫瘤大小。待移植瘤清晰可見(接種后42 d左右)，麻醉處死裸鼠，剝?nèi)∧[瘤，照相并測量腫瘤直徑。

1.2.3 腫瘤組織蘇木精-伊紅染色觀察 將腫瘤組織以4%甲醛溶液固定，繼之通過脫水、透明、包埋，制成組織蠟塊。4 μm切片后，組織切片脫蠟及水化，置于蘇木精染液中染色，光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理學(xué)改變。

1.2.4 腫瘤組織透射電子顯微鏡下觀察 將大小約為1 mm3的腫瘤組織在0～4℃下固定于2.5%戊二醛磷酸鈉緩沖液(pH 7.2～7.3)中，PBS緩沖液漂洗，再以四氧化鋨固定。隨后進(jìn)行脫水、浸透包埋，制成超薄切片(60 nm)。染色后，在透射電子顯微鏡下觀察肝組織超微結(jié)構(gòu)變化。

1.2.5 Real-time PCR檢測腫瘤組織Ang-2基因表達(dá) 用Trizol試劑提取組織總RNA。用高效RNA-cDNA試劑盒合成第1條互補(bǔ)DNA鏈，方法按說明書進(jìn)行。Real-time PCR檢測Ang-2的基因表達(dá)。引物設(shè)計：β-actin上游引物5′-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3′，下游引物5′-GC-AACAGTGGGGTCCTTAGAG-3′；Ang-2上游引物5′-AGTGACTGCCACGGTGAATAA-3′，下游引物5′-GCAACAGTGGGGTCCTTAGAG-3′。mRNA水平用與β-actin表達(dá)的相對量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，結(jié)果用2-ΔΔCt方法分析。

1.2.6 Western blot檢測腫瘤組織中Ang-2蛋白表達(dá) 按文獻(xiàn)[3]提取腫瘤組織勻漿蛋白，使用10×Tris-HCl SDS-PAGE提取總蛋白并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。先后加入一抗及由辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗進(jìn)行孵育。蛋白條帶通過化學(xué)發(fā)光試劑顯影。BandScan分析膠片吸光度值，目標(biāo)蛋白表達(dá)量以Ang-2/β-actin吸光度比值表示。

1.2.7 免疫熒光染色檢測腫瘤組織CD34表達(dá) 將脫蠟水化后的組織切片用微波進(jìn)行抗原修復(fù)，用山羊血清封閉切片。加一抗后于4℃濕盒中孵育過夜。于暗室中加稀釋好的熒光(Cy3)標(biāo)記羊抗兔IgG，濕盒中20～37℃孵育1 h，PBST沖洗切片4次，每次3 min。滴加DAPI避光孵育5 min，對標(biāo)本進(jìn)行染核，PBST 5 min×4次洗去多余的DAPI。用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)或ANOVA方法分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒構(gòu)建及測序鑒定

pLVX-shRNA-Ang-2的4個單菌落用XhoⅠ行酶切鑒定，如圖1所示，4個克隆均可酶切到1 320 bp的條帶，為陽性克隆。并與設(shè)計序列Ang2比對，比對結(jié)果表明測序結(jié)果與設(shè)計序列一致，證明干擾載體構(gòu)建成功。

A：pLVX-shRNA-Ang-2酶切鑒定；B：pLVX-shRNA-Ang-2測序結(jié)果與設(shè)計序列Ang-2比對圖圖1 pLVX-shRNA-Ang-2的酶切鑒定及基因測序比對Fig.1 Enzymatic detectior of pLVX-shRNA-Ang-2 and geme sequencing

2.2 腫瘤大體形態(tài)比較

在相同的干預(yù)條件和相同的生長時間下，對照組、pLVX-Ang-2組、pLVX-shRNA-Ang-2組腫瘤體積分別為(0.32±0.02)cm3、(0.19±0.01)cm3、(0.06±0.02)cm3，重量分別為(0.24±0.03)g、(0.14±0.02)g、(0.04±0.01)g(圖2)。pLVX-shRNA-Ang-2組腫瘤體積和重量明顯低于其他兩組(P<0.05)。

2.3 干擾質(zhì)粒對腫瘤組織學(xué)影響

在光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，3組均為惡性腫瘤組織學(xué)表現(xiàn)，pLVX-Ang-2組和對照組表現(xiàn)為大面積出血、壞死和廣泛的氣球樣變，而pLVX-shRNA-Ang-2組細(xì)胞壞死不明顯(圖3)。

2.4 干擾質(zhì)粒對腫瘤組織超微結(jié)構(gòu)影響

pLVX-shRNA-Ang-2組腫瘤細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)基本正常。對照組和pLVX-Ang-2組細(xì)胞質(zhì)中糖原顆粒減少，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膨脹及線粒體腫脹，染色質(zhì)分布不均勻，細(xì)胞質(zhì)廣泛空泡化，凋亡小體形成(圖4)。

A：對照組；B：pLVX-Ang-2組；C：pLVX-shRNA-Ang-2組圖2 3組腫瘤大體形態(tài)比較Fig.2 Comparison of gross tumor morphology in 3 groups

A：pLVX-shRNA-Ang-2組；B：對照組；C：pLVX-Ang-2組圖3 干擾質(zhì)粒對腫瘤組織學(xué)影響(蘇木精-伊紅染色，×200)Fig.3 The effect of interference plasmid on tumor histology(HE staining，×200)

A：pLVX-shRNA-Ang-2組；B：對照組；C：pLVX-Ang-2組圖4 干擾質(zhì)粒對腫瘤組織超微結(jié)構(gòu)影響(×4 000)Fig.4 The effect of interference plasmid on the ultrastructure of tumor(×4 000)

2.5 干擾質(zhì)粒對HepG2細(xì)胞Ang-2基因表達(dá)的影響

Real-time PCR檢測結(jié)果(圖5)顯示，對照組、pLVX-Ang-2組及pLVX-shRNA-Ang-2組HepG2細(xì)胞的Ang-2 mRNA相對表達(dá)量分別(0.620±0.03)、(0.625±0.02)、(0.213±0.02)，與對照組和pLVX-Ang-2組比較，pLVX-shRNA-Ang-2組HepG2細(xì)胞的Ang-2 mRNA表達(dá)水平明顯下降(P<0.05)。

A：對照組；B：pLVX-Ang-2組；C：pLVX-shRNA-Ang-2組；與pLVX-shRNA-Ang-2組比較，*P<0.05圖5 干擾質(zhì)粒對HepG2細(xì)胞Ang-2基因表達(dá)的影響Fig.5 The effect of interference plasmid on the gene expression of Ang-2 in HepG2

2.6 干擾質(zhì)粒對腫瘤組織中Ang-2蛋白表達(dá)的影響

與pLVX-Ang-2組和對照組相比較，pLVX-shRNA-Ang-2組的腫瘤組織中，Ang-2蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)(圖6)。

A：對照組；B：pLVX-Ang-2組；C：pLVX-shRNA-Ang-2組；與pLVX-shRNA-Ang-2組比較，*P<0.05圖6 干擾質(zhì)粒對腫瘤組織中Ang-2蛋白表達(dá)的影響Fig.6 The effect of interference plasmid on the protein expression of Ang-2 in tumor tissue

2.7 干擾質(zhì)粒對腫瘤組織中CD34表達(dá)的影響

圖7可見，pLVX-Ang-2組和對照組的腫瘤組織中，CD34表達(dá)較密集，而pLVX-shRNA-Ang-2組的腫瘤組織中CD34表達(dá)明顯較少。

A：pLVX-shRNA-Ang-2組；B：對照組；C：pLVX-Ang-2組圖7 免疫熒光染色檢測干擾質(zhì)粒對腫瘤組織中CD34表達(dá)影響(免疫熒光染色，×200)Fig.7 The effect of interference plasmid on the expression of CD34 in tumor tissue(immune fluorescence staining,×200)

3 討論

Ang-2是血管生成素家族4個成員之一，Maisonpierre等[4]于1997年首先從人和小鼠的cDNA文庫內(nèi)克隆出來，其基因的開放閱讀框編碼496個氨基酸。研究表明，血管生成素特別是Ang-2于腫瘤組織的血管重建區(qū)特異表達(dá)，能夠刺激腫瘤性血管新生，從而參與血管形成的初始和激發(fā)階段，影響腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[5]。

楊揚(yáng)等[6]研究發(fā)現(xiàn)，Ang-2和VEGF可能通過協(xié)同作用促進(jìn)新生血管形成，參與直腸癌的發(fā)生、發(fā)展。而通過阻斷Ang-2受體Tie-2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)能夠抑制胰腺癌血管生成[7]。劉新蘭等[8]的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在惡性程度越高的胃癌病例，Ang-2表達(dá)越高，間質(zhì)中的血管也越豐富，說明Ang-2表達(dá)能夠誘導(dǎo)胃癌組織血管生成。Tanaka等[9]將Ang-2基因插入無Ang-2基因表達(dá)的肝細(xì)胞肝癌，然后接種小鼠，腫瘤生長明顯較原腫瘤加快且伴有廣泛出血。也有研究者[10]將Ang-2基因分別導(dǎo)入結(jié)腸癌細(xì)胞系中，以空白載體導(dǎo)入的癌細(xì)胞作對照，分別移植入裸鼠體內(nèi)，結(jié)果顯示Ang-2組腫瘤在體積、重量、細(xì)胞增殖率方面明顯高于對照組。

本研究分別以轉(zhuǎn)染pLVX-shRNA-Ang-2、pLVX-Ang-2的HepG2細(xì)胞以及未轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞接種裸鼠制作移植瘤模型，結(jié)果顯示pLVX-shRNA-Ang-2組移植瘤組織中，Ang-2基因和蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，且瘤體體積明顯小于其他兩組，光學(xué)顯微鏡下可見pLVX-Ang-2組和對照組表現(xiàn)為大面積出血、壞死和廣泛的氣球樣變，而pLVX-shRNA-Ang-2組細(xì)胞壞死不明顯。研究結(jié)果與Tanaka等[9]相符，進(jìn)一步證實(shí)了Ang-2與腫瘤的生長有著密切的關(guān)系。

CD34是一種特異度較高的血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物，通過抗體與相應(yīng)的內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合，可以間接反映微血管密度(MVD)。有研究發(fā)現(xiàn)，CD34的表達(dá)與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系，CD34在許多惡性腫瘤中表達(dá)均呈上調(diào)趨勢。王學(xué)軍[11]研究發(fā)現(xiàn)，CD34陽性表達(dá)位于乳腺癌組織間質(zhì)血管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)中，說明乳腺癌癌組織MVD明顯高于乳腺正常組織及癌旁組織。曹方等[12]研究表明，在胃癌組織中CD34陽性表達(dá)率和MVD明顯高于癌旁組織，提示CD34表達(dá)水平與腫瘤血管生成有一定相關(guān)性。我們的研究結(jié)果顯示，HepG2細(xì)胞及pLVX-Ang-2轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞注射接種所形成的腫瘤組織中，CD34表達(dá)較密集，而pLVX-shRNA-Ang-2轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞注射接種后形成的腫瘤組織中CD34表達(dá)明顯較少，從另一個角度證明了Ang-2基因敲除后，腫瘤組織的血管生成明顯減少。

綜上所述，采用siRNA干擾技術(shù)敲除Ang-2基因，通過減少肝癌組織新血管的生成而抑制腫瘤的生長，可為臨床以抑制Ang-2活性為靶點(diǎn)治療肝癌提供依據(jù)。

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(2016-04-18 收稿)

Small Interfering RNA against Angiopoietin-2 Inhibits Growth of Transplanted Hepatocellular Carcinoma in Nude Mice

Li Xia1#，He Panwen2#，Wu Jianhong1etal

1DepartmentofLiverDisease，WuhanMedicalTreatmentCenter，Wuhan430023，China2ClinicalLaboratory，TheCentralHospitalofWuhan，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniverstiyofScienceandTechnology，Wuhan430014，China

Objective To explore the effect of small interfering RNA against angiopoietin-2(Ang-2)on the growth of transplanted hepatocellular carcinoma in nude mice.Methods Nude mice were subcutaneously transplanted with HepG2，HepG2 transfected by pLVX-shRNA-Ang-2 or pLVX-Ang-2，and then the mice were divided into 3 groups：control group，pLVX-shRNA-Ang-2 group and pLVX-Ang-2 group，10 mice in each group.The tumor size was measured.The tumor tissue slices of each group were detected by HE staining and transmission electron microscopy to compare the pathological changes.RNA and protein of Ang-2 was detected by real-time PCR and by Western blotting，respectively.CD34 was detected by immune fluorescence staining.Results As compared with pLVX-Ang-2 group and control group，the tumor size of pLVX-shRNA-Ang-2 group was small and tumor tissue necrosis was not obvious，Ang-2 gene and protein and CD34 expression was decreased significantly(allP<0.05).Conclusion Small interfering RNA against Angiopoietin-2 can reduce the generation of new blood vessels in the liver tissue and inhibit the growth of the tumor.

RNA interference； angiopoietin-2； hepatic carcinoma

R735.7

10.3870/j.issn.1672-0741.2016.06.005

李 霞，女，1980年生，主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，E-mail：316931725@qq.com

何攀文，男，1978年生，主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，E-mail：903155748@qq.com

△通訊作者，Correspondingauthor，E-mail：763633126@qq.com