張慧君， 薛敬禮， 劉紅春， 趙曉玉， 劉 楠， 朱 琳

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苦參素對實驗性自身免疫性腦脊髓炎大鼠腦內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞增值的影響

張慧君1， 薛敬禮2， 劉紅春3， 趙曉玉1， 劉 楠1， 朱 琳1

目的 觀察苦參素對實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)大鼠的治療作用及對腦內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物-巢蛋白Nestin、轉(zhuǎn)錄因子Sox-2表達(dá)的影響，探討苦參素對EAE大鼠的治療機(jī)制。方法 將60只雌性Wistar大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組和治療組，每組20只。用新鮮豚鼠全脊髓勻漿免疫誘導(dǎo)建立EAE模型，自免疫后第11天(發(fā)病初期)起，治療組大鼠每日腹腔注射苦參素6.70 ml/kg(250 mg/kg)，同時正常組與模型組注射等量生理鹽水。每天觀察并記錄大鼠的體重變化及神經(jīng)功能學(xué)評分。給藥1 w后將大鼠處死，取脊髓和大腦，免疫組織化學(xué)法檢測腦內(nèi)Nestin的表達(dá)，RT-PCR法測定腦內(nèi)SOX-2含量的變化。結(jié)果 與模型組相比，治療組大鼠神經(jīng)功能評分明顯降低，Nestin陽性細(xì)胞數(shù)和SOX-2的表達(dá)均顯著增加(P<0.05)。結(jié)論 苦參素對EAE大鼠有治療作用，其機(jī)制可能與增加中樞神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)干細(xì)胞的數(shù)量有關(guān)。

苦參素； 實驗性自身免疫性腦脊髓炎； 神經(jīng)干細(xì)胞； 巢蛋白(Nestin)； SOX-2

多發(fā)性硬化癥(multiple sclerosis,MS)是一種慢性的退行性疾病，病變部位主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)，該病常伴隨有炎癥、免疫細(xì)胞浸潤、髓鞘脫失以及軸索損傷等病理變化。實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)是研究MS的經(jīng)典動物模型[1]。苦參素(C15H24N2O2·H2O， 分子量282.38)是從苦參、廣豆根等豆科植物中提取出來的四環(huán)喹嗪啶類生物堿，其具有抗肝炎病毒、抗炎抗變態(tài)反應(yīng)和抗腫瘤等作用[2]。神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cell，NSC)是一種具有自我更新能力的細(xì)胞，可增殖分化為中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的3種基本細(xì)胞：神經(jīng)元細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞[3]。巢蛋白(nestin)是神經(jīng)上皮前體細(xì)胞中的一種中間絲蛋白，目前被廣泛用作NSCs的標(biāo)志物[4]。Sox-2是轉(zhuǎn)錄因子的一種，其表達(dá)發(fā)生在整個成年期的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)發(fā)生區(qū)域，被看作是NSCs的另一個標(biāo)志物[5]。本實驗通過測定EAE大鼠腦內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞Nestin和Sox-2的表達(dá)，探究苦參素對EAE防治作用機(jī)制。

1 實驗動物及試劑

1.1 實驗動物 清潔級雌性Wistar大鼠60只，6～8周齡， 體重180～220 g，動物批號：37009200001109； 健康豚鼠14只，體重300～350 g，批號：SCXK魯20130001，均由濟(jì)南朋悅實驗動物繁殖有限公司提供。

1.2 實驗藥品和試劑 苦參素注射液，0.6 g/2 ml，江蘇正大天晴藥業(yè)有限公司，批號：國藥準(zhǔn)字H20057480；卡介苗，60 mg/支，北京生物制品研究所；完全弗氏佐劑，美國 Sigma 公司；Trizol，Transgene公司；RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，F(xiàn)ermentas MBI；SOX-2引物由北京博大泰克公司合成；兔抗大鼠Nestin多克隆抗體,Santa cruz公司；濃縮DAB試劑盒，北京中杉生物工程有限公司。

1.3 儀器 S100 型PCR擴(kuò)增儀； Imagemaster VDS凝膠成像分析儀；DYY-8C型電泳儀，北京市六一儀器廠；OLYM PUS病理圖像采集成像系統(tǒng)。

2 實驗方法

2.1 動物模型 參照文獻(xiàn)[6]提供的方法， 豚鼠用10%水合氯醛麻醉后，心臟灌流注生理鹽水，于無菌條件下取豚鼠脊髓，稱重，加等量生理鹽水，制成 50%(w/v) 豚鼠全脊髓勻漿， 將該勻漿與含有6 mg/ml卡介苗的完全弗氏佐劑等體積混合，于冰上反復(fù)抽推成油包水型乳劑，四肢足墊皮內(nèi)及頸背部皮下注射免疫40只大鼠，每只 0.5 ml，誘導(dǎo)EAE模型。將60只大鼠隨機(jī)分成3組，分別為正常組、EAE模型組和苦參素治療組,苦參素治療組于免疫后第11天起每天一次腹腔注射6.70 ml/kg(250 mg/kg),連續(xù)給藥1 w，同時正常組和EAE模型組每天一次腹腔注射等量生理鹽水。

2.2 神經(jīng)功能學(xué)評分 自免疫當(dāng)日起,每日觀察并記錄大鼠體重變化，臨床癥狀及神經(jīng)功能學(xué)評分。EAE模型評分采用五分評分法：1分：動物尾部無力；2分： 后肢無力；3 分：后肢癱瘓；4分：前、 后肢體均癱瘓；5分：瀕死或死亡。以大鼠達(dá)到或超過1分為臨床EAE發(fā)病。

2.3 免疫組織化學(xué)檢測大腦內(nèi)Nestin蛋白的表達(dá) 實驗大鼠于免疫后第18天，均腹腔注射10%水合氯醛至麻醉，剪開大鼠胸腔，灌注針經(jīng)左心室穿入主動脈，用預(yù)冷生理鹽水進(jìn)行心臟灌流，直至肝臟變白，取脊髓腰膨大處和左腦固定于4%多聚甲醛中，固定24 h后，石蠟包埋制備成5 μm的切片，4 ℃保存?zhèn)溆?；剩余脊髓和右腦置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。取石蠟切片，采用生物素蛋?過氧化物酶(SP)法進(jìn)行檢測。切片常規(guī)脫蠟水化，PBS漂洗3遍，檸檬酸抗原修復(fù)10 min，自然冷卻，PBS漂洗3遍，3% H2O2去離子水室溫孵育20 min， PBS漂洗3遍，滴加封閉用正常山羊血清工作液，37 ℃孵育40 min，甩去多余液體滴加1∶150 比例稀釋的一抗，4 ℃ 過夜后，PBS漂洗3遍，滴加山羊抗小鼠二抗工作液，37 ℃孵育30 min，PBS漂洗3遍，滴加辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液，37 ℃孵育30 min， PBS漂洗3遍，DAB顯色，顯微鏡下控制顯色時間(2～3 min)，蘇木素復(fù)染5 min，鹽酸乙醇分化， 自來水充分沖洗， 脫水、 透明、 封片、 鏡檢。以胞漿呈棕黃色為細(xì)胞陽性表達(dá)，用病理圖像分析軟件分析每個高倍視野下陽性染色細(xì)胞數(shù)。

2.4 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法(RT-PCR)檢測腦內(nèi)Sox-2的表達(dá) 將凍存管中的脊髓投入液氮中研碎， 按Trizol 提取試劑盒提取總RNA， 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：8 μl總RNA、 1 μl oligo(dT)、10 μl 2ES及1 μl ES， 輕輕混勻，42 ℃孵育30 min， 85 ℃加熱 5 min。取2 μl進(jìn)行后續(xù)擴(kuò)增， 其余-80 ℃保存。PCR擴(kuò)增：SOX-2的引物序列：Sense：5’-GGCCTGGGTGCGGGCGTGAA-3’；Antisense:5’-GAGTGGGAGGAAGAGGTAACCACGG-3’；片段大小為346 bp。內(nèi)參為GAPDH，內(nèi)參引物序列：Sense：5’-ACAAGATGGTGAAGGTCGGTGTGAA -3’；Antisene：5’-TTCACACCGACCTTCACCATCTTGT-3’；片段大小為571 bp。反應(yīng)體系：cDNA 2 μl，SOX-2前后引物各1 μl 或GAPDH前后引物各1 μl，10×Buffer 5 μl， dNTP 4 μl， DNA Polymerase 1 μl， DEPC 36 μl，總反應(yīng)體系為50 μl ，SOX-2及內(nèi)參循環(huán)條件均為94 ℃預(yù)變性2 min，一個循環(huán)；94 ℃變性30 s，58 ℃(及52 ℃)退火30 s，72 ℃延伸2 min，35 個循環(huán)；72 ℃終末延伸6 min。取 5 μl PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳， 圖像使用Quantity One分析軟件進(jìn)行灰度掃描分析，目的基因Sox-2 mRNA 的表達(dá)量是目的基因Sox-2與β-actin的PCR 條帶灰度值之比。

3 結(jié) 果

3.1 苦參素對于EAE大鼠神經(jīng)功能評分的影響 在本次實驗中，自免疫后第9天起，大鼠開始陸續(xù)出現(xiàn)臨床指癥，具體表現(xiàn)為毛色晦暗松亂，活動減少，尾部無力，相繼出現(xiàn)后肢癱瘓，體重迅速下降，易激怒，繼而全身癱瘓，個別處于瀕死狀態(tài)。 與正常組比較， 模型組大鼠神經(jīng)功能學(xué)評分顯著增加。自免疫后第11天起，苦參素組大鼠開始接受藥物治療，藥物治療組大鼠的神經(jīng)功能學(xué)評分均低于模型組，且第16天起兩組評分間呈現(xiàn)顯著性差異(P<0.05,見圖1)。

3.2 大鼠腦內(nèi)Nestin陽性細(xì)胞表達(dá)量 與正常組比較，模型組大鼠腦內(nèi)Nestin陽性細(xì)胞數(shù)顯著增加,有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與EAE模型組相比，苦參素治療組腦內(nèi)Nestin陽性細(xì)胞數(shù)也顯著增加(P<0.05)(見圖2)。

3.3 大鼠腦內(nèi)Sox-2 mRNA 表達(dá) 與Nestin陽性細(xì)胞數(shù)變化一致，模型組大鼠腦內(nèi)Sox-2表達(dá)量較正常組顯著增加(P<0.01)，而苦參素能顯著增加EAE大鼠腦內(nèi)Sox-2表達(dá)(P<0.01)(見圖3)。

與治療組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義*P<0.05

與正常組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義**P<0.01；與模型組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義#P<0.05

圖2 免疫組化染色檢測腦中Nestin表達(dá) A：免疫組化染色圖片，×400；B：Nestin陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)

與正常組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義**P<0.01；與模型組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義##P<0.01

圖3 RT-PCR檢測腦中Sox-2含量 A：PCR結(jié)果圖示；B：Sox-2相對灰度值分析

4 討 論

中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘和軸突損傷是MS的主要病理改變，也是MS患者永久殘疾的重要病理決定因素[1]。長期以來，人們普遍認(rèn)為哺乳動物CNS受損后不能產(chǎn)生新的神經(jīng)元，也不能大量產(chǎn)生有功能的軸突，修復(fù)能力十分微弱。近年來許多研究發(fā)現(xiàn)，成年個體海馬和管室膜下層細(xì)胞具有分裂產(chǎn)生新神經(jīng)元的能力，并成功分離出了能不斷增值且具有多種分化潛能的細(xì)胞群，即神經(jīng)干細(xì)胞。其通過神經(jīng)修復(fù)作用在治療MS等神經(jīng)系統(tǒng)疾病中顯示了巨大的應(yīng)用前景[7]。NSCs分為外源性和內(nèi)源性兩種，但外源性NSCs難以向功能性神經(jīng)元定向分化而多分化成神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。因此，通過激活內(nèi)源性NSCs增殖、分化，使受損的CNS進(jìn)行自我修復(fù)成為MS等腦損傷疾病的研究熱點[8]。在之前的研究中我們發(fā)現(xiàn)，苦參素在預(yù)防MS的過程中可抑制T細(xì)胞、B細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞的免疫功能活性[9]，但對于其能否促進(jìn)內(nèi)源性內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖尚未可知。

本次實驗中，檢測到EAE組大鼠較正常組大鼠脊髓內(nèi)NSCs數(shù)量顯著增加，其機(jī)制可能是由于NSCs在正常狀態(tài)下并不存在增殖分化活動，當(dāng)腦內(nèi)受到病理損傷等刺激而引起微環(huán)境發(fā)生改變，達(dá)到引起其分裂的閾值時，可刺激NSCs的增殖分化[10]。在MS發(fā)病過程中，炎性因子透過血腦屏障進(jìn)入CNS，引起CNS中微環(huán)境改變，從而激活了其中休眠的NSCs,使其從靜息狀態(tài)轉(zhuǎn)為激活狀態(tài)。給予苦參素治療后，EAE大鼠神經(jīng)功能學(xué)評分得到了顯著改善，同時炎癥浸潤及髓鞘脫失狀況得到有效緩解，同時，治療組EAE大鼠腦內(nèi)Nestin和Sox-2表達(dá)均高于模型組，提示苦參素可能通過促進(jìn)EAE大鼠中樞神經(jīng)內(nèi)NSCs的增殖，從而加速腦損傷的修復(fù)。

綜上所述，苦參素能有效緩解EAE大鼠臨床癥狀，可能與其能促進(jìn)EAE大鼠CNS內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖有關(guān)。

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The effect of Matrine on the endogenous neural stem cells proliferation in the experimental autoimmune encephalomyelitis rat brain

ZHANGHuijun,XUEJingli,LIUHongchun,etal.

(DepartmentofPharmacy,TheFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China)

Objective To observe the effect of matrine on neural stem cells (NSCs) marker (Nestin and SOX-2) in the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) rats brains,and explore the mechanism of matrine on EAE.Methods Sixty female Wistar rats were randomly divided into 3 groups:Normal group (n=20),EAE model group (n=20) and MAT treated group (n=20),EAE model was established by injecting fresh guinea cord homogenate (GPSCH) plus Freund’s adjuvat (CFA).MAT was injected intraperitoneally (i.p.) at 6.70 ml/kg(250 mg/kg)daily,starting from day 11 post immunization (p.i.).Immunized rats that received the same volume of normal saline only i.p.Served as the vehicle control group,and nonimmunized naive rats that received the same amount of normal saline i.p.served as the naive control.Rats were monitored and weighed daily from the day one post immunization to evaluate clinical scores of EAE after immunization.On day 18 p.i rats were sacrificed and spinal cords and brains were harvested,then inflammatory infiltration were determined by hematoxylin and eosin (H&E) staining and demyelination by Luxol fast blue (LFB) staining,the expression of Nestin and Sox-2 was detected by Immunochemistry and RT-PCR,respectively.Results The neurology scores,inflammatory infiltration and foci of demyelination was significantly inhibited by MAT treatment (P<0.01),and the level of Nestin and Sox-2 was increased notably (P<0.05) in MAT treated group.Conclusion Matrine has therapeutic effect on EAE,which may be related to the increased number of NSCs.

Matrine; Experimental autoimmune encephalomyelitis(EAE); Neural stem cells(NSCs)； Nestin; Sox-2

1003-2754(2016)12-1101-03

2016-08-13；

2016-11-30 基金項目：河南省科技廳(No.152102310044) 作者單位：(1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，河南 鄭州 450000；2.河南省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，河南 鄭州 450000；3.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科，河南 鄭州 450000) 通訊作者：朱 琳，E-mail：zhulin66zhulin@126.com

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