汪皖君， 于長申， 王雅靜， 管雅琳， 呂鳳瓊， 劉首峰， 王 博， 王新平

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骨髓間充質(zhì)干細胞立體定向移植治療大鼠腦缺血損傷的實驗研究

汪皖君1， 于長申1， 王雅靜1， 管雅琳2， 呂鳳瓊4， 劉首峰1， 王 博3， 王新平1

目的 觀察立體定向移植骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSC)治療MCAO大鼠的效果并探討其可能機制。方法 用改良線拴法制作大腦中動脈閉塞(MCAO)模型。60只模型大鼠隨機分為移植組(A組)、磷酸鹽緩沖液溶液組(B組)與假手術(shù)組(C組)。在模型建立后7 d，通過立體定向方式將1×106個BMSCs移植入A組大鼠損傷側(cè)紋狀體，B組大鼠以同樣方式在同樣部位移植等體積的磷酸鹽緩沖液，C組完成立體定向過程，但無液體注入。應用改良大鼠神經(jīng)功能缺損評分(mNSS評分)、水迷宮測試觀察大鼠神經(jīng)功能恢復狀況,并取大鼠腦組織行免疫組織化學染色。結(jié)果 A組mNSS評分優(yōu)于B組、C組(P<0.05)；A組逃避潛伏期明顯縮短(P< 0.05)；跨越平臺次數(shù)明顯增多(P<0.05)。A組大鼠在腦損傷中心及周圍區(qū)，可見Brdu單染陽性細胞及Brdu+BDNF、Brdu+GFAP、Brdu+vWF、Brdu+VEGF雙染陽性細胞。結(jié)論 立體定向移植BMSCs可以顯著改善MCAO大鼠神經(jīng)功能恢復。

骨髓間充質(zhì)干細胞； 腦缺血損傷; 治 療

腦梗死是危害人類健康的重要疾病之一，具有發(fā)病率高、死亡率高、致殘率高等特點，給個人、家庭、社會帶來嚴重的負擔。腦梗死患者經(jīng)過臨床治療后仍有50%～70%的存活者遺留癱瘓、失語等嚴重殘疾，因此尋找能夠從組織結(jié)構(gòu)功能上修復缺血區(qū)神經(jīng)元及神經(jīng)元再生的方法意義重大。骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)在一定誘導條件下可分化成肝細胞、成軟骨細胞、骨細胞、成肌細胞、肌腱細胞、脂肪細胞等細胞群，還可以向神經(jīng)系細胞分化[1]，是當前再生醫(yī)學最有潛力的種子細胞。本實驗通過立體定向移植BMSCs治療大腦中動脈閉塞(MCAO)腦梗死模型大鼠，觀察BMSCs治療效果,并探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD(Sprague-Dawley)雄性大鼠100只，體重250～300 g，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院動物中心提供[動物質(zhì)量合格證號：SCXK-(軍)-2012-004]。

1.2 主要試劑及設(shè)備 5-溴脫氧尿嘧啶核昔(BrdU，MP Med Biochemicals生產(chǎn))；兔抗人膠原纖維酸性蛋白多克隆抗體(GFAP，北京中杉金橋生物技術(shù)公司)；兔抗人堿性成纖維細胞生長因子多克隆抗體(bFGF，北京中杉金橋生物技術(shù)公司)；兔抗人腦源性神經(jīng)生長因子多克隆抗體(BDNF，北京中杉金橋生物技術(shù)公司)；Polymer雙染檢測試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)公司)；Morris水迷宮(中國醫(yī)學科學院藥物所制造)。

1.3 方法

1.3.1 BMSCs的分離、培養(yǎng)、標記 10%水合氯醛腹腔注射麻醉SD大鼠，用頸椎脫臼法急性處死，無菌條件下取其股骨及脛骨。采用密度梯度離心結(jié)合全骨髓貼壁法進行原代BMSCs分離、培養(yǎng)，胰酶消化傳代[2]。取第3代BMSCs(見圖1)，經(jīng)流式細胞儀檢測。細胞移植前24 h摻入10 mg/L的BrdU進行標記。

1.3.2 MCAO模型制作及分組 10%水合氯醛0.33～0.36 ml/100 g麻醉大鼠，按照文獻中的手術(shù)方式建立大鼠大腦中動脈栓塞(MCAO)缺血1 h再灌注模型[3]。MCAO后7 d將Zea Longa法評分2～3分的60只大鼠隨機分為移植組(A組)、磷酸鹽緩沖液溶液組(B組)與假手術(shù)組(C組)。A組：腹腔麻醉后無菌條件下暴露前囟，以立體定向儀定位移植部位表面位置，粗針頭標記，以高速電鉆勻速穿透硬腦膜。將微量注射器垂直固定于定向儀注射槽孔架內(nèi)，調(diào)整位置，準確插至大鼠損傷側(cè)紋狀體區(qū)。以1 μl/min的速度勻速注射5 μl BMSCs懸液，移植細胞數(shù)量約為1×106,n=20。B組：立體定向注射5 μl磷酸鹽緩沖液溶液(PBS)至大鼠損傷側(cè)紋狀體區(qū)，n=20。C組：在大鼠損傷側(cè)紋狀體區(qū)完成立體定向操作，無液體注入，n=20。

1.3.3 行為學評價mNSS評分評估移植前 移植后7 d、移植后14 d、移植后60 d大鼠神經(jīng)功能缺損程度。Morris水迷宮定向航行實驗評價移植5 d后學習記憶功能。

1.3.4 組織學檢查 移植后60 d，所有大鼠以4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液心臟灌注固定。腦標本在4%多聚甲醛液中固定24 h后進行腦組織切片，厚約4 μm，進行蘇木精-伊紅(HE)染色、免疫組織化學染色，包括BrdU、Nestin、GFAP、BDNF單染和Brdu+Nestin、Brdu+MAP-2、Brdu+GFAP、Brdu+VWF雙染。

2 實驗結(jié)果

2.1 行為學研究結(jié)果 改良神經(jīng)功能缺損評分(mNSS)是目前國際上公認的大鼠腦缺血后神經(jīng)

功能缺失評判標準，總分18分，分數(shù)越高表示神經(jīng)功能缺損越嚴重[4]。移植前，3組大鼠mNSS評分沒有統(tǒng)計學差異(P>0.05)。移植后7 d，3組評分無統(tǒng)計學差異(P<0.05)；移植后14 d，A組mNSS評分與B、C兩組比較顯著下降(P<0.05)；移植后60 d，A組與B、C兩組mNSS評分仍有顯著差異(見表1)。Morris水迷宮廣泛用于嚙齒類動物的視覺相關(guān)的空間記憶和工作記憶的測量[5]。本研究顯示各組大鼠移植第5天后尋找平臺的訓練中，逃避潛伏期隨著時間推移都有縮短，表明大鼠空間學習記憶能力改善。其中，A組平均潛伏期較B、C兩組明顯縮短(P<0.05)，B組與C組比較無統(tǒng)計學差異(見表2)。各組大鼠跨越平臺次數(shù)比較:A組:3.80±1.87;B組:2.4±1.14;C組:2.60±1.52,空間探索試驗顯示A組大鼠與B、C組大鼠比較，跨越平臺次數(shù)明顯增多(P<0.05)。

2.2 移植細胞存活與分化 移植后60 d，A組大鼠腦損傷中心可見BrdU陽性細胞，主要位于缺血側(cè)大腦皮質(zhì)、海馬和紋狀體區(qū)(見圖1)。B組和C組未見BrdU陽性細胞。組鏡下可見廣泛分布的GFAP、vWF、BDNF、VEGF染色陽性細胞，其中A組明顯多于B組和C組(見圖2)。A組可見Brdu+GFAP、Brdu+vWF、Brdu+BDNF、Brdu+VEGF雙染陽性細胞，B組和C組未見雙染陽性細胞(見圖3)。

圖1 移植后60 d A組大鼠腦損傷中心可見BrdU陽性細胞(細胞核呈紅色，免疫組織化學染色(×400)

表1 各組大鼠mNSS評分比較

A組，BMSCs移植組；B組，PBS對照組；C組，假手術(shù)組,*組間比較具有統(tǒng)計學差異

表2 各組大鼠逃避潛伏期比較

A組，BMSCs移植組；B組，PBS對照組；C組，假手術(shù)組,*代表組間比較具有統(tǒng)計學差異

圖2 移植后60 d，組鏡下可見Nestin、GFAP、BDNF、VEGF染色陽性細胞

圖3 移植后60 d A組可見Brdu+Nestin、Brdu+MAP-2、Brdu+GFAP、Brdu+vWF雙染陽性細胞

3 討 論

缺血性腦血管病具有高發(fā)病率、高致殘率及高死亡率等特點，且發(fā)病年齡趨向年輕化，給患者、家庭及社會帶來沉重負擔[6,7]。中國是全世界腦卒中發(fā)病率最高、死亡率次高的國家[8]。目前除急性期溶栓外尚沒有確切有效的治療措施，但多數(shù)患者不能在有效時間窗內(nèi)到達醫(yī)院。干細胞技術(shù)的發(fā)展，為缺血性腦血管病的治療帶來了新的希望，而BMSCs因其具有獲取方便、易于分離培養(yǎng)、遺傳背景穩(wěn)定、可自體移植、無倫理道德和免疫排斥問題等優(yōu)勢[9]，更成為當前醫(yī)學研究的熱點。本研究觀察立體定向移植BMSCs對MCAO大鼠神經(jīng)功能恢復的影響并探討其可能機制，為BMSCs的臨床應用奠定基礎(chǔ)。

3.1 移植細胞可在宿主體內(nèi)存活、遷移并促進MCAO大鼠神經(jīng)功能恢復 本研究在移植組大鼠缺血側(cè)大腦皮質(zhì)、海馬和紋狀體區(qū)可見Brdu陽性細胞。大鼠自體不含BrdU，本研究以Brdu標記BMSCs，在移植組大鼠腦內(nèi)發(fā)現(xiàn)BrdU陽性細胞表明移植的BMSCs可在大鼠腦內(nèi)存活并遷移。本研究以mNSS評分評估各組大鼠運動功能，評分越高，神經(jīng)功能缺損越重。移植后14 d及60 d，A組行為學評分顯著優(yōu)于對照組，說明移植的BMSCs已經(jīng)發(fā)揮神經(jīng)修復作用，移植細胞可在大鼠體內(nèi)存活并持續(xù)發(fā)揮促進其神經(jīng)功能缺損修復的作用。Morris水迷宮廣泛用于嚙齒類動物的視覺相關(guān)的空間記憶和工作記憶的測量[5]。我們的研究結(jié)果表明，各組大鼠移植第5天后尋找平臺的訓練中，逃避潛伏期隨著時間推移都有縮短，表明大鼠空間學習記憶能力改善。其中，A組平均潛伏期較B、C兩組明顯縮短(P<0.05)，B組與C組平均潛伏期無統(tǒng)計學差異(見表2)。結(jié)果提示BMSCs移植可以改善大鼠腦缺血后空間學習記憶能力。

3.2 立體定向移植BMSCs可促進MCAO大鼠神經(jīng)功能恢復 目前治療腦損傷的細胞移植途徑主要有立體定向途徑和血管途徑。本研究選擇立體定向方式將BMSCs移植至大鼠損傷側(cè)紋狀體，并取得良好療效。立體定向途徑的優(yōu)點是移植細胞均分布在病灶區(qū)，移植細胞利用率相對較高。缺點是侵入性操作對腦組織造成二次損傷，且移植后增加的液體容量對周圍正常腦組織產(chǎn)生擠壓損傷效應[10]。我們既往也研究了靜脈途徑移植BMSCs對MCAO大鼠的療效[11]。靜脈途徑的優(yōu)點是操作簡單，避免了腦組織的二次損傷。缺點是該途徑移植的干細胞隨血液播散，大多分布到其他器官，而最終進入病灶的細胞數(shù)量非常少，故要求移植細胞的須達到一定數(shù)量。且移植細胞間可能黏連形成微栓子，在臨床應用中有引起肺栓塞的風險。每種移植途徑各有其優(yōu)劣，在實際選擇時應綜合考慮。在腦梗死急性期，機體釋放大量炎癥因子、趨化因子，且血腦屏障遭到嚴重破壞，均有利于靜脈移植的BMSCs進入病灶區(qū)。而慢性期炎癥反應基本消失，血腦屏障逐漸修復，此時立體定向途徑更具優(yōu)勢。因立體定向移植細胞擴散范圍相對小，更適用于較小面積的腦梗死，而大面積腦梗死時靜脈途徑更具優(yōu)勢[12]。

3.3 BMSCs神經(jīng)修復功能可能機制分析

3.3.1 BMSCs移植到腦內(nèi)后替代受損的神經(jīng)細胞 本研究觀察到，BMSCs移植到體內(nèi)后可在宿主腦內(nèi)存活，分化成神經(jīng)元樣細胞，并與其他神經(jīng)元建立突觸聯(lián)系，通過替代受損的神經(jīng)細胞而發(fā)揮神經(jīng)修復作用。我們既往研究[14]也觀察到了移植的BMSCs向神經(jīng)細胞及神經(jīng)膠質(zhì)細胞的分化，但是研究中發(fā)現(xiàn)僅有很少一部分BMSCs可分化成神經(jīng)細胞，可能不足以完成重建神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、修復受損神經(jīng)系統(tǒng)的功能，應該還需要其他機制的參與。

3.3.2 移植的BMSCs可分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子及促進內(nèi)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達而發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng)作用 有研究證實BDNF等營養(yǎng)因子能直接促進腦梗死后的神經(jīng)再生[15]。本研究中，移植組大鼠腦內(nèi)可見的Brdu+BDNF雙染陽性細胞，表明移植的BMSCs不僅可在宿主腦內(nèi)存活、遷移，并可分泌神經(jīng)生長因子。我們既往研究也證實移植的BMSCs可促進神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達[14]，從而有效減少缺血半暗帶細胞的凋亡，促進突觸聯(lián)系重建[16]，發(fā)揮神經(jīng)修復作用。

3.3.3 促進血管重建 腦梗死后神經(jīng)功能的修復與受損區(qū)內(nèi)的血管重建密切相關(guān)。本研究中，在移植組大鼠腦內(nèi)亦可觀察到BrdU+vWF雙染陽性細胞，提示移植的BMSCs可在腦內(nèi)分化為血管內(nèi)皮細胞，但是數(shù)量很少，據(jù)此推測，新生的血管并非依賴于移植細胞的自身分化。我們在移植組大鼠腦內(nèi)亦可觀察到Brdu+VEGF雙染陽性細胞，提示移植的BMSCs可能通過促進新生血管形成發(fā)揮治療作用。VEGF在血管新生的過程中發(fā)揮著相當重要的作用[17]，另有研究結(jié)果提示，如BDNF[18]、bFGF[19]等因子亦有存進血管新生的作用，但最終均依賴于VEGF表達的上調(diào)[20]。但是，目前對于血管新生促進腦梗死后神經(jīng)功能恢復的確切機制尚未完全清楚。

3.3.4 安全性分析 本研究未應用免疫抑制劑，在BMSCs同種異體移植后60 d，仍可見BMSCs存活于宿主體內(nèi)。說明BMSCs免疫原性較低，可以與移植宿主較好的相容。BMSCs不表達主要組織相容性復合體Ⅱ類分子及激活T淋巴細胞所必需的協(xié)同刺激分子，故不會激活宿主的T淋巴細胞[21]。同時BMSCs還具有較強的抑制機體免疫反應的作用[22]。這些作用都有助于移植后BMSCs在宿主體內(nèi)長期存活并發(fā)揮功能。干細胞移植的致瘤性也是關(guān)注熱點之一，本實驗中，至移植后60 d，移植組大鼠腦組織未見腫瘤樣結(jié)構(gòu)形成。Wakao等[23]將BMSCs誘導為Schwann細胞后移植入食蟹猴損傷的正中神經(jīng)中，觀察1 y發(fā)現(xiàn)移植細胞可顯著促進神經(jīng)功能的恢復，未觀察到干細胞的病理性集聚以及腫瘤樣物形成。但目前觀察移植后療效的時間最長是1 y，時間延長后是否會出現(xiàn)副作用,甚至出現(xiàn)腫瘤等仍有待進一步研究。

本研究通過立體定向移植BMSCs至MCAO大鼠腦內(nèi)，觀察到移植細胞可在大鼠腦內(nèi)存活、分化及促進神經(jīng)功能恢復，并探討其可能機制，為BMSCs移植治療缺血性腦血管病提供了試驗依據(jù)。但是本研究觀察時間短，移植BMSCs的遠期療效及安全性等尚需進一步觀察論證。

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Bone marrow mesenchymal stem cells transplantation for treatment of cerebral ischemia injury in rats

WANGWanjun，YUChangshen，WANGYajing，etal.

(TianjinHuanHuHospital,Tianjing300000,China)

Objective To observe the effects of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) transplantation for treatment of cerebral ischemia injury in rats.Methods A total of 80 rats were grouped randomly into transplantationgroup (A group),phosphate buffer solution group (B group) and shamoperated group (C group) after MCAO model was formed by suture occluded method.Modified neurological severity scale (mNSS) and morris water maze test were used to evaluate neurological recovery of rats.Results The mNSS score of A group was better than B group or C group (P<0.05).The escape latencies of hidden platform in A group were obviously decreased (P<0.05);numbers of crossing the platform in A group were obviously increased (P<0.05).Conclusion BMSCs transplantation could improve neurological functional recovery after ischemic brain injury.

Bone marrow mesenchymal stem cells; Cerebral ischemia injury; Treatment

1003-2754(2016)12-1076-04

2016-10-08；

2016-11-29 基金項目：天津市科學技術(shù)委員會資助項目(11JCZDJC19400);天津市衛(wèi)生局科技基金(2014KY19) 作者單位：[1.天津市腦系科中心醫(yī)院(環(huán)湖醫(yī)院)神經(jīng)康復科，天津 300000；2.天津市腦系科中心醫(yī)院(環(huán)湖醫(yī)院)神經(jīng)內(nèi)科 300000;3.天津市腦系科中心醫(yī)院(環(huán)湖醫(yī)院)神經(jīng)外科 300000；4.四川省遂寧市中心醫(yī)院內(nèi)科，四川 遂寧,6290005] 通訊作者：王新平，E-mail：wangxinpingtj@sina.com

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