童 偉， 張 超， 趙 文， 熊 琴， 褚天運， 杜凱麗

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缺血性腦卒中患者的IL-18表達(dá)水平及其基因105A/C多態(tài)性與肺炎衣原體感染的相關(guān)性研究

童 偉， 張 超， 趙 文， 熊 琴， 褚天運， 杜凱麗

目的 探討缺血性腦卒中患者體內(nèi)IL-18表達(dá)水平的變化及其基因105A/C多態(tài)性與缺血性腦卒中疾病的相關(guān)性。方法 選擇55例缺血性腦卒中患者為實驗組，55例健康體檢人群為對照組，收集全血標(biāo)本后用ELISA檢測試劑盒分別測定標(biāo)本的血漿中CpnIgA、CpnIgG抗體水平及IL-18表達(dá)水平。應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù)對IL-18基因105位點進(jìn)行基因分型。結(jié)果 AIS組CpnIgA陽性率明顯高于健康對照組(χ2=18.18，P<0.05),而CpnIgG陽性率二者無顯著性差異。AIS組的IL-18表達(dá)水平明顯高于健康對照組，且CpnIgA陽性的AIS患者的IL-18表達(dá)水平高于CpnIgA陰性患者，但其基因105A/C基因多態(tài)性比較無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論 缺血性腦卒中的發(fā)生、發(fā)展與肺炎衣原體慢性感染和IL-18水平有關(guān)，和IL-18的105A/C基因多態(tài)性無明顯相關(guān)，但具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

缺血性腦卒中； 肺炎衣原體； IL-18； 基因多態(tài)性

缺血性腦卒中(acute ischemic stroke，AIS )又稱腦梗死,中醫(yī)稱之為卒中。本病系由各種原因所致的局部腦組織區(qū)域血液供應(yīng)障礙，導(dǎo)致腦組織缺血缺氧性病變壞死，進(jìn)而產(chǎn)生臨床上對應(yīng)的神經(jīng)功能缺失表現(xiàn)，嚴(yán)重危害人類的生命健康[1，2]。近年來大量流行病學(xué)調(diào)查研究提示肺炎衣原體感染與缺血性腦卒中密切相關(guān)[3～5]。白細(xì)胞介素-18(interleukin-18，IL-18)是一種重要的的促炎癥細(xì)胞因子，屬于白介素-1家族。大量研究顯示IL-18的水平與冠心病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等相關(guān)[6,7]。但有關(guān)IL-18及其基因105A/C多態(tài)性與缺血性腦卒中關(guān)聯(lián)性的研究報道較少。因此，本研究旨在探討缺血性腦卒中患者IL-18表達(dá)水平及其基因105A/C多態(tài)性與肺炎衣原體感染的相關(guān)性，為缺血性腦卒中疾病的預(yù)防和診治提供參考。

1 材料與方法

1.1 一般資料 缺血性腦卒中組55例,其中男29例，女26例,年齡為51～76歲,均來自湖北省襄陽市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科和康復(fù)科的住院患者，其診斷標(biāo)準(zhǔn)按照中華醫(yī)學(xué)會神經(jīng)病學(xué)分會腦血管病學(xué)組于發(fā)布的《中國缺血性腦血管病血管內(nèi)介入診療指南》。對照組為健康體檢人員55例,其中男28例,女27例，年齡為50～72歲。所有個體均簽署知情同意書。

1.2 檢測方法

1.2.1 標(biāo)本的采集及處理 55例缺血性腦卒中患者在入院次日早上采靜脈血,健康對照組就診當(dāng)日取靜脈血。靜脈血標(biāo)本均用EDTA-K2抗凝管收集3 ml?；靹?，離心(3000 r/min)10 min，分離血漿,-80 ℃保存，供檢測血漿肺炎衣原體抗體及IL-18，血液有形成分提取DNA ,供IL-18基因105位點檢測。

1.2.2 標(biāo)本測試 (1)肺炎衣原體IgA及IgG檢測:Cpn抗體水平測定：嚴(yán)格按照 ELISA試劑盒操作說明(EUROIMMUN，德國)，半定量試驗，r=測定吸光度/標(biāo)準(zhǔn)吸光度，r≥1.1為陽性，抗體的定量通過標(biāo)準(zhǔn)曲線直方圖獲取。(2)血漿中IL-18含量測定:按照IL-18 ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，酶標(biāo)儀測定吸光度，然后計算IL-18含量。(3)IL-18基因105A/C多態(tài)性檢測:采用酚氯仿法提取DNA，利用PCR-RFLP對IL-18基因105位點進(jìn)行基因分型，105位點上游引物為5’-GTTATTGTAGAAAACCTGGAATT-3’，下游引物為5’-CCTCTAGTCAGAATCAGT-3’。IL-18基因105位點的PCR擴(kuò)增條件95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)34次，末次循環(huán)后，72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物用TaqI進(jìn)行酶切分型，酶切產(chǎn)物在3%瓊脂糖凝膠上電泳，通過凝膠成像系統(tǒng)判斷結(jié)果。AA基因型僅有148 bp一條條帶，AC基因型有148 bp、123 bp、25 bp三條條帶，CC基因型有123 bp、25 bp兩條條帶(見圖1)。25 bp片段在瓊脂糖凝膠電泳后條帶跑出膠外故圖1中無法觀察到。

2 結(jié) 果

2.1 臨床資料分析 缺血性腦卒中組和健康對照組在年齡和性別構(gòu)成差異無統(tǒng)計學(xué)意義，本研究共缺血性腦卒中納入病例55例，其中男性29例，女性26例，年齡為(62.6±10.8)歲；健康對照組55例，其中男性28例，女性27例，年齡為(61.3±9.2)歲。兩組年齡分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 肺炎衣原體抗體IgA及IgG檢測 55例缺血性腦血管病組血漿肺炎衣原體IgA陽性明顯高于健康對照組，用χ2檢驗結(jié)果P<0.05,有統(tǒng)計學(xué)意義(見表1);二者肺炎衣原體抗體IgG比較無統(tǒng)計學(xué)意義(見表2)。

2.3 兩組人員的血漿IL-18含量比較 缺血性腦卒中患者血漿IL-18含量明顯高于健康對照組(見表3)。

2.4 肺炎衣原體抗體IgA陽性與陰性缺血性腦卒中患者血漿的IL-18水平 23例肺炎衣原體抗體IgA陽性缺血性腦卒中患者血漿IL-18含量的平均值為(295.5±58.3)ng/L，明顯高于血漿肺炎衣原體抗體IgA陰性缺血性腦卒中患者(P<0.05，見表4 )，表明肺炎衣原體感染會影響IL-18的表達(dá)水平。

2.5 缺血性腦卒中組和對照組IL-18基因編碼區(qū)105位點多態(tài)性比較 PCR-RFLP電泳圖譜(見圖1)，IL-18基因編碼區(qū)105位點在對照組和缺血性腦卒中患者的基因型分布符合Hardy-Weinbger平(P>0.05，見表5),兩組基因型分布頻率達(dá)到遺傳平衡,具有群體代表性。非條件Logistic回歸參數(shù)估計顯示IL-18基因105A/C基因多態(tài)性比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，見表6)，即IL-18的105A/C基因多態(tài)性與缺血性腦卒中無明顯相關(guān)。

表1 兩組樣本肺炎衣原體感染lgA測定結(jié)果比較

缺血性腦卒中組與健康對照組相比P<0.01

表2 兩組樣本肺炎衣原體感染lgG測定結(jié)果比較

缺血性腦卒中組與健康對照組相比P>0.05

組別IL?18水平(ng/L)P值缺血性腦卒中組健康對照組247．8±56．4?118．3±42．5<0．05

缺血性腦卒中組與健康對照組相比*P<0.05

表4 缺血性腦卒中組Cpn IgA陽性與陰性患者血漿的

與CpnIgA陰性組相比*P<0.05

表5 IL-18基因105位點等位基因頻率的分析及構(gòu)成比(%)

表6 非條件Logistic回歸參數(shù)估計IL- 1 8基因105A/C單倍體基因型頻率與缺血性腦卒中相關(guān)性分析

1為AC基因型;2、4、5為A A基因型;3為CC基因型

3 討 論

缺血性腦卒中是腦血管病中的一種，流行病學(xué)資料顯示，缺血性腦卒中患者逐年上升，且其發(fā)病人群逐漸年輕化，在存活的患者中，約有70%～80%腦血管病患者有不同程度的神經(jīng)功能障礙，嚴(yán)重者失去生活自理能力，給社會和家庭帶來了很大的負(fù)擔(dān)[8]。缺血性腦卒中發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，且治療措施和效果都十分有限，因此積極探索其危險因素，有效地預(yù)防腦血管病的發(fā)生顯得尤為重要。

通過本研究顯示，缺血性腦卒中組的血漿肺炎衣原體抗體IgA陽性率明顯高于健康對照組，而二者的肺炎衣原體抗體I gG比較無顯著差異，IgG通常作為再次感染的標(biāo)志物，IgA通常被認(rèn)為慢性、持續(xù)感染的血清標(biāo)志物，表明肺炎衣原體的慢性感染與缺血性腦卒中的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，肺炎衣原體感染

是缺血性腦卒中的危險因素之一。那肺炎衣原體感染又是如何引起缺血性腦卒中的呢？研究表明白細(xì)胞介素18(interleukin，IL-18)具有誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生多種細(xì)胞因子和增強(qiáng)Th1細(xì)胞活性等多種生物學(xué)的功能，在自身免疫性疾病，慢性炎癥性疾病及慢性感染性疾病中充當(dāng)著重要的角色[9,10]。因此我們檢測了IL-18表達(dá)水平，結(jié)果顯示,缺血性腦卒中組的IL-18表達(dá)水平明顯高于對照組，然后我們再次比較了肺炎衣原體抗體IgA陽性與陰性缺血性腦卒中組血漿的IL-18水平，結(jié)果顯示CpnIgA陽性的缺血性腦卒中患者血漿的IL-18水平高于陰性患者，說明肺炎衣原體感染影響腦卒中患者血漿IL-18的表達(dá)水平。綜上表明，肺炎衣原體的慢性感染導(dǎo)致IL-18表達(dá)升高，從而誘發(fā)非特異性的炎癥反應(yīng)，進(jìn)而引起腦血管的病變并促進(jìn)了缺血性腦卒中的發(fā)生發(fā)展。然后我們又從基因水平研究了IL-18基因105A/C多態(tài)性與缺血性腦卒中的相關(guān)性，結(jié)果顯示IL-18基因105A/C多態(tài)性與缺血性腦卒中無明顯相關(guān)。

通過本課題的研究有利于為缺血性腦卒中疾病的預(yù)防和診治提供提供新的思路，然而其具體作用機(jī)制還需更深入的研究。

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Correlation analysis of the infection of chlamydia pneumoniae and the expression levels of interleukin-18 and its gene 105A/C polymorphisms in acute ischemic stroke

TONGWei,ZHANGChao,ZHAOWen,etal.

(TheAffiliatedXiangyangNo.1People’sHospitalofHubeiUniversityofMedicine，Xiangyang441000，China)

Objective To explore the correlation of the infection of Chlamydia pneumoniae and the expression levels of interleukin-18 and its gene Polymorphisms in acute ischemic stroke (AIS) patients.Methods Detect the level of interleukin-18 and Chlamydia pneumoniae antibody CpnlgA and CpnIgG by ELISA in the plasma of the healthy control and AIS patients,then investgate interleukin-18 Gene 105A/C Polymorphisms by the method of restriction fragment length polymorphism (RFLP-PCR).Results The positivity of CpnlgA in patients with AIS was higher than that in healthy control (χ2=18.18).There was no difference in IgG positivity.The level of Interleukin-18 in the acute ischemic stroke patients was higher than that in healthy controls,and which in the AIS patients with CpnlgA positivity was higher than that with CpnlgA negative.There was no significant difference in the interleukin-18 Gene 105A/C Polymorphisms.Conclusion The chronic infection of Chlamydia pneumoniae and the expression levels of Interleukin-18 was related to AIS and might involve in the trigger and development of AIS,but there was no significant correlation between IL-18 gene105A/C polymorphism with AIS.

Acute ischemic stroke； Chlamydia pneumoniae； Interleukin-18； Gene polymorphisms

1003-2754(2016)12-1095-03

2016-08-04；

2016-11-30 基金項目：湖北省襄陽市科技局項目[襄科計(2014)-11號] 作者單位：(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽第一人民醫(yī)院檢驗科，湖北 襄陽 441000) 通訊作者：童 偉，E-mail：tw888@sohu.com

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