王 佳， 熊 炬， 周文勝

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HT22細(xì)胞氧糖剝奪再灌注及Grasp65過表達(dá)干預(yù)后高爾基體的形態(tài)變化及其可能機(jī)制研究

王 佳1， 熊 炬2， 周文勝2

目的 探討HT22細(xì)胞氧糖剝奪再灌注及Grasp65過表達(dá)干預(yù)后高爾基體的形態(tài)變化及其可能機(jī)制。方法 利用小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系HT22為研究對(duì)象，HT22細(xì)胞經(jīng)氧糖剝奪再灌注損傷及Grasp65過表達(dá)干預(yù)后，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率；Hoechest33258熒光染色法評(píng)估細(xì)胞凋亡；并應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)觀察高爾基體的形態(tài)；應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測(cè)GM130和GAAP蛋白的表達(dá)。結(jié)果 氧糖剝奪再灌注可導(dǎo)致HT22細(xì)胞的活性顯著降低(P<0.05)，凋亡率顯著增高(P<0.05)；并可導(dǎo)致高爾基體形態(tài)的異常，隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，高爾基體逐漸發(fā)生碎裂，尤其以再灌注12 h和24 h最為明顯；GM130、GAAP的表達(dá)水平在氧糖剝奪再灌注后出現(xiàn)下降，特別是在再灌注12 h、24 h后出現(xiàn)了顯著下降(P<0.05)。過表達(dá)Grasp65后，HT22細(xì)胞在氧糖剝奪再灌注所致高爾基體碎裂出現(xiàn)減少(P<0.05)，碎裂程度減輕，同時(shí)GM130和GAAP的表達(dá)均顯著增加(P<0.05)，HT22細(xì)胞的存活率大大提高(P<0.05)，凋亡率顯著降低(P<0.05)。結(jié)論 缺血再灌注損傷的細(xì)胞模型中，同樣發(fā)生了高爾基體的碎裂；過表達(dá)Grasp65可以減輕氧糖剝奪再灌注損傷所致的高爾基體碎裂，并可以減少HT22細(xì)胞的凋亡，其機(jī)制可能與上調(diào)GM130和GAAP的表達(dá)有關(guān)。

高爾基體碎裂； 凋亡； 小鼠海馬神經(jīng)元系HT22； Grasp65； GM130

腦梗死是臨床上較為常見的疾病，其發(fā)病率、致殘率及死亡率均高，缺血再灌注損傷是造成腦梗死的重要原因。近年來許多研究發(fā)現(xiàn)，在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病如阿爾茨海默病(AD)、帕金森氏病(PD)、肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)等病理神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)了高爾基體形態(tài)的改變，甚至碎裂的現(xiàn)象[1～3]。對(duì)此現(xiàn)象深入研究發(fā)現(xiàn)，高爾基體可能是細(xì)胞內(nèi)死亡信號(hào)途徑的重要感受者與放大者，在細(xì)胞凋亡早期即核染色體DNA還未改變之前，已出現(xiàn)了高爾基體形態(tài)的變化，說明高爾基體在細(xì)胞凋亡過程中起重要的早期啟動(dòng)作用[4]。另外研究表明，在腦缺血再灌注的動(dòng)物模型中也發(fā)現(xiàn)了高爾基體的碎裂[5]。但是在缺血再灌注損傷的細(xì)胞模型中，是否同樣發(fā)生了高爾基體碎裂？通過阻止高爾基體碎裂是否可以減輕神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡，改善神經(jīng)功能尚不清楚。因此，研究高爾基體凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制對(duì)神經(jīng)元凋亡的影響十分重要。

Grasp65是一類重要的高爾基體相關(guān)蛋白，對(duì)維持高爾基體的形態(tài)和功能具有重要作用，如參與細(xì)胞分裂間期高爾基體解聚、裂解以及細(xì)胞凋亡中的高爾基體碎裂[6,7]。既往有多項(xiàng)研究表明轉(zhuǎn)染Grasp65和表達(dá)Grasp65突變體可減少高爾基體碎裂[4,8]。本研究利用小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系HT22建立缺血再灌注損傷的細(xì)胞模型，探討HT22細(xì)胞氧糖剝奪再灌注及Grasp65過表達(dá)干預(yù)后高爾基體的形態(tài)變化及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系HT22(本研究所保存)；胎牛血清(Gemini公司)；高糖DMEM培養(yǎng)基和無糖DMEM培養(yǎng)基(Kccell公司)；Hoechest33258(Sigma公司)；MTT(Sigma公司)；pcDNA3.1-Grasp65 過表達(dá)載體(本研究所構(gòu)建與保存)；Lipofectamin3000轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen公司)；GM130抗體(Abcam公司)；GAAP抗體(Santa cruz公司)；β-tubulin抗體(聯(lián)科生物)；β-actin抗體(Proteintech公司)；二抗和熒光二抗(Proteintech公司)；ECL超敏發(fā)光液和PVDF膜(Millipore公司)；DAPI(碧云天生物有限公司)。

1.2 方 法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、分組及氧糖剝奪再灌注(OGD/R)損傷模型建立 用含有10%胎牛血清的高糖DMEM完全培養(yǎng)基，在5%CO2、37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)HT22細(xì)胞。待細(xì)胞融合至80%～90%即可傳代，取細(xì)胞形態(tài)良好、對(duì)數(shù)增殖期培養(yǎng)的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為模型組(OGD/R組)、空載模型組(pcDNA3.1+OGD/R組)、Grasp65過表達(dá)干預(yù)組(Grasp65+OGD/R組)，每組再按再灌注時(shí)間點(diǎn)不同分為6 h、12 h、24 h 3個(gè)亞組。參照文獻(xiàn)[9]建立HT22細(xì)胞OGD/R損傷模型：首先用無糖DMEM培養(yǎng)基沖洗細(xì)胞3次，替換掉完全培養(yǎng)基，放置于含1%O2、5%CO2、94%N2的三氣培養(yǎng)箱中缺氧缺糖培養(yǎng)6 h，然后將培養(yǎng)基替換為完全培養(yǎng)基，放置于37 ℃、5%CO2常規(guī)培養(yǎng)箱中復(fù)氧培養(yǎng)，分別繼續(xù)培養(yǎng)6 h、12 h、24 h。

1.2.2 MTT檢測(cè)細(xì)胞存活率 各組HT22細(xì)胞加入100 L溶解于DMEM的MTT溶液(0.5 mg/ml)，在培養(yǎng)箱中孵育4 h，棄掉培養(yǎng)液，加入100 L DMSO溶液，37 ℃振蕩10 min，用酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞在490 nm處的吸光度(A)值。用每組A值與空白對(duì)照組A值的比值來計(jì)算細(xì)胞存活率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次，最后取平均值。

1.2.3 Hoechst 33258檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 各組HT22細(xì)胞加入Hoechest 33258溶液(5 μg/ml)，37 ℃孵育10 min。抗熒光淬滅劑封片，避光，熒光顯微鏡觀察拍片。隨機(jī)選取3個(gè)高倍視野，計(jì)算每個(gè)視野細(xì)胞凋亡率(凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%)。

1.2.4 Western blot檢測(cè)GM130、GAAP的蛋白表達(dá) 收集各組HT22細(xì)胞，使用蛋白提取試劑盒提取總蛋白，測(cè)量其蛋白濃度。蛋白變性后進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，用半干轉(zhuǎn)移法將凝膠電泳分離的蛋白分子轉(zhuǎn)移到 PVDF膜上。5%牛血清白蛋白室溫封閉1 h，加入相應(yīng)一抗，抗GM130(1∶1000)、GAAP(1∶100)、β-actin(1∶4000)，4 ℃孵育過夜。用TBST洗3次，每次10 min。加入相應(yīng)二抗37 ℃孵育1 h，TBST漂洗4次，ECL顯影和采圖。Quantity one軟件分析各條帶吸光度值，計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.5 細(xì)胞免疫熒光觀察高爾基體(用GM130標(biāo)記)的形態(tài)變化 各組HT22細(xì)胞經(jīng)4%多聚甲醛室溫固定后，經(jīng)0.5% tritonX-100通透30 min，用兔源GM130單抗(1∶100)和小鼠源β-tubulin單抗(1∶200)4 ℃孵育過夜，PBS洗，F(xiàn)ITC山羊抗兔和Alex Fuor 595山羊抗小鼠熒光二抗室溫孵育1 h，PBS洗，用含DAPI的封片劑封片，奧林巴斯熒光倒置顯微鏡電腦采像。

2 結(jié) 果

2.1 氧糖剝奪再灌注及Grasp65過表達(dá)干預(yù)對(duì)HT22細(xì)胞活性的影響 模型組、空載模型組和Grasp65過表達(dá)干預(yù)組HT22細(xì)胞經(jīng)氧糖剝奪6 h再灌注6 h、12 h、24 h后，HT22細(xì)胞活性顯著降低，與正常組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；Grasp65過表達(dá)干預(yù)組與模型組相比，HT22細(xì)胞存活率有所上升，其中再灌注6 h、12 h細(xì)胞活性有顯著差異(P<0.05)，24 h細(xì)胞活性無明顯差異(P>0.05)；空載模型組與模型組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表1)。

2.2 氧糖剝奪再灌注及Grasp65過表達(dá)干預(yù)對(duì)HT22細(xì)胞凋亡的影響 正常組細(xì)胞核形狀正常，呈圓形，顯淡藍(lán)色熒光，其核內(nèi)染色質(zhì)均勻分布，無明顯凋亡細(xì)胞；模型組細(xì)胞隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，逐漸可見部分細(xì)胞胞體縮小，胞漿濃縮，染色質(zhì)分布不均，再灌注12 h、24 h細(xì)胞核致密濃染，顯亮藍(lán)色，細(xì)胞核碎裂呈碎片狀，再灌注24 h可見凋亡細(xì)胞增多，細(xì)胞出現(xiàn)壞死，細(xì)胞輪廓不清，已解體；過表達(dá)Grasp65后，氧糖剝奪再灌注所致凋亡細(xì)胞減少(見圖1A)。模型組、空載模型組和Grasp65過表達(dá)干預(yù)組HT22細(xì)胞經(jīng)氧糖剝奪6 h再灌注6 h、12 h、24 h后，HT22細(xì)胞凋亡率顯著上升，與正常組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；各個(gè)時(shí)間點(diǎn)Grasp65過表達(dá)干預(yù)組與模型組相比，HT22細(xì)胞凋亡率下降顯著(P<0.05)；空載模型組與模型組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見圖1B)。

2.3 氧糖剝奪再灌注及Grasp65過表達(dá)干預(yù)對(duì)HT22細(xì)胞高爾基體形態(tài)的影響 通過GM130標(biāo)記高爾基體，β-Tubulin標(biāo)記細(xì)胞微管結(jié)構(gòu)，以觀察氧糖剝奪再灌注后高爾基體的形態(tài)變化。免疫熒光結(jié)果顯示，在正常組中，HT22細(xì)胞內(nèi)高爾基體結(jié)構(gòu)緊密，聚集于核邊，不分散；氧糖剝奪6 h再灌注6 h后，部分細(xì)胞的高爾基體結(jié)構(gòu)較正常組稍松散，可見少量碎裂片段；再灌注12 h、24 h后，大部分細(xì)胞內(nèi)高爾基體的正常形態(tài)被破壞，囊膜碎裂明顯，可見明顯的碎裂片段或顆粒廣泛散在細(xì)胞內(nèi)(見圖2)。Grasp65過表達(dá)干預(yù)后，未遭受氧糖剝奪的HT22細(xì)胞內(nèi)高爾基體形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)緊湊，不分散；氧糖剝奪6 h再灌注6 h、12 h后，高爾基體形態(tài)基本正常，但結(jié)構(gòu)稍顯松散，稍見條形塊狀碎片，與同期模型組比較，高爾基體碎裂程度有所改善；再灌注24 h后，約一半細(xì)胞內(nèi)高爾基體出現(xiàn)體積擴(kuò)大，囊膜結(jié)構(gòu)碎裂成顆粒狀分散在細(xì)胞中，但與同期模型組比較，高爾基體碎裂程度也有所減輕(見圖3)。我們發(fā)現(xiàn)，空載模型組各時(shí)間點(diǎn)高爾基體的碎裂與同期模型組比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；過表達(dá)Grasp65后HT22細(xì)胞在氧糖剝奪再灌注6 h后的高爾基體的碎裂較同期模型組有所減少，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而在再灌注12 h、24 h后高爾基體的碎裂較同期模型組明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見圖4)。

2.4 氧糖剝奪再灌注及Grasp65過表達(dá)干預(yù)對(duì)HT22細(xì)胞GM130、GAAP蛋白表達(dá)的影響 與正常組比較，HT22細(xì)胞經(jīng)氧糖剝奪6 h再灌注6 h后，細(xì)胞內(nèi)GM130和GAAP的表達(dá)無明顯變化，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，GM130和GAAP在再灌注12 h和24 h的表達(dá)均較正常組出現(xiàn)了顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Grasp65過表達(dá)干預(yù)后，氧糖剝奪再灌注6 h、12 h的GM130的表達(dá)與正常組基本一致(P>0.05)，而24 h的GM130的表達(dá)較正常組顯著下降(P<0.05)；Grasp65過表達(dá)干預(yù)后，氧糖剝奪再灌注6 h的GAAP的表達(dá)與正常組基本一致(P>0.05)，而12 h、24 h的GAAP的表達(dá)較正常組顯著下降(P<0.05)；Grasp65過表達(dá)干預(yù)組各時(shí)間點(diǎn)GM130和GAAP的表達(dá)較同期模型組出現(xiàn)了顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見圖5)。

表1 OGD/R及Grasp65過表達(dá)干預(yù)對(duì)HT22細(xì)胞活性的影響

與正常組比較*P<0.05；與模型組比較#P<0.05

A：Hoechst33258凋亡染色(×400)；B：各組凋亡率統(tǒng)計(jì)分析,與正常組比較*P<0.05；與OGD/R比較#P<0.05

圖1 OGD/R及Grasp65過表達(dá)干預(yù)對(duì)HT22細(xì)胞凋亡的影響

圖2 OGD/R對(duì)HT22細(xì)胞內(nèi)高爾基體形態(tài)的影響(×400)

圖3 過表達(dá)Grasp65后OGD/R對(duì)HT22細(xì)胞內(nèi)高爾基體形態(tài)的影響(×400)

與正常組比較*P<0.05；與OGD/R比較#P<0.05

圖4 OGD/R及Grasp65過表達(dá)干預(yù)對(duì)HT22細(xì)胞高爾基體碎裂的統(tǒng)計(jì)分析

A：Western blot 檢測(cè)HT22細(xì)胞在OGD/R后各時(shí)間點(diǎn)GM130、GAAP的表達(dá)；B：Western blot 檢測(cè)過表達(dá)Grasp65后HT22細(xì)胞在OGD/R后各時(shí)間點(diǎn)GM130、GAAP的表達(dá)；C：GM130表達(dá)量變化的統(tǒng)計(jì)分析；D：GAAP表達(dá)量變化的統(tǒng)計(jì)分析；與正常組比較*P<0.05；與OGD/R比較#P<0.05

圖5 OGD/R及Grasp65過表達(dá)干預(yù)對(duì)GM130、GAAP表達(dá)的影響

3 討 論

腦缺血后恢復(fù)血液再灌注可以減輕部分缺血神經(jīng)元的損傷，但同時(shí)也會(huì)加重部分缺血細(xì)胞的損傷，甚至導(dǎo)致這些細(xì)胞的死亡，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能產(chǎn)生嚴(yán)重的影響。因此，從全新的角度探索和研發(fā)新的藥物，促進(jìn)腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)系統(tǒng)功能的改善或恢復(fù)，成為近年來研究腦梗死的重點(diǎn)之一。

現(xiàn)在越來越多的研究從細(xì)胞器水平來分析神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病變過程和病理特點(diǎn)，有證據(jù)表明高爾基體涉及到神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制中[10,11]。本研究利用小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系HT22建立缺血再灌注損傷的細(xì)胞模型，通過對(duì)HT22細(xì)胞氧糖剝奪6 h再灌注6 h、12 h、24 h后發(fā)現(xiàn)，氧糖剝奪再灌注可導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞的活性顯著降低，凋亡率顯著上升，且隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，上述損傷表現(xiàn)逐漸加重，這種變化規(guī)則基本符合缺血再灌注損傷的病理生理特點(diǎn)。氧糖剝奪再灌注可導(dǎo)致HT22細(xì)胞高爾基體形態(tài)的異常，隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，高爾基體逐漸發(fā)生碎裂，呈長(zhǎng)條狀或顆粒狀，尤其以再灌注12 h和24 h最為明顯。因此，我們認(rèn)為，與缺血缺氧損傷相比，再灌注損傷對(duì)高爾基體的打擊更大，即高爾基體可能不能耐受再灌注損傷的打擊。GM130是維持高爾基體結(jié)構(gòu)和形態(tài)完整的重要蛋白[12]。我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，GM130的表達(dá)水平在氧糖剝奪再灌注后出現(xiàn)下降，特別是在再灌注12 h、24 h后，GM130出現(xiàn)顯著的下降，并在這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀察到了大量的HT22細(xì)胞內(nèi)高爾基體發(fā)生了嚴(yán)重的碎裂。因此，我們有理由相信，氧糖剝奪再灌注所致HT22細(xì)胞內(nèi)高爾基體的碎裂可能與GM130表達(dá)水平的下降有關(guān)。GAAP是一種定位于高爾基體的抗凋亡蛋白[13]。

本研究發(fā)現(xiàn)，在氧糖剝奪再灌注初期，GAAP的表達(dá)水平基本沒有變化，而此時(shí)高爾基體的形態(tài)基本保持正常，但是從再灌注12 h開始，GAAP的表達(dá)水平急劇下降，同時(shí)高爾基體發(fā)生了明顯的顆粒狀碎裂。因此，我們推測(cè)GAAP蛋白可能僅在氧糖剝奪再灌注早期發(fā)揮了一定的抗凋亡作用，GAAP蛋白表達(dá)水平的下降可能也是導(dǎo)致高爾基體碎裂的原因之一。

氧糖剝奪再灌注損傷引起高爾基體的碎裂，有可能對(duì)蛋白加工成熟、囊泡運(yùn)輸以及鈣離子穩(wěn)態(tài)產(chǎn)生影響，從而誘導(dǎo)缺血的神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生死亡或凋亡。故若能從抑制高爾基體碎裂的角度來保護(hù)高爾基體，減少缺血神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。因此，為了阻止高爾基體的碎裂，我們過表達(dá)了高爾基體重組和堆疊蛋白Grasp65，它被證實(shí)能在細(xì)胞有絲分裂時(shí)特異的抑制高爾基體的碎裂[4,14]。轉(zhuǎn)染Grasp65后HT22細(xì)胞在氧糖剝奪再灌注所致高爾基體碎裂出現(xiàn)減少，碎裂程度減輕，同時(shí)GM130、GAAP的表達(dá)顯著增加，最后致使HT22細(xì)胞的存活率大大提高，凋亡率顯著降低。提示過表達(dá)Grasp65減輕缺血再灌注損傷所致的高爾基體碎裂，可以減少缺血神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，改善神經(jīng)功能，其機(jī)制可能與上調(diào)GM130、GAAP的表達(dá)有關(guān)。

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Morphological alterations of Golgi apparatus after oxygen-glucose deprivation followed by reperfusion and intervening by over-expressed Grasp65 in HT22 cells and their underlying mechanism

WANGJia,XIONGJu,ZHOUWensheng.

(DepartmentofNeurvousDisease,HunanInstituteofGerontology,HunanProvincialPeople’sHospital,Changsha410016,China)

Objecive To investigate Morphological alterations of Golgi apparatus after oxygen-glucose deprivation followed by reperfusion (OGD/R) and intervening by over-expressed Grasp65 in HT22 cells and their underlying mechanism.Methods Using mouse hippocampal neuronal cell line HT22 as the research object.After OGD/R and intervening by over-expressed Grasp65,using MTT method to detect cell viability and hoechest33258 fluorescence staining method to evaluate cell apoptosis.Morphology of Golgi apparatus were observed with cytochemistry immunofluorescence.The protein expressions of GM130 and GAAP were detected by Western blot.Results HT22 cells activity was significantly decreased (P<0.05) via OGD/R induction and apoptosis rate increased significantly (P<0.05).OGD/R could also lead to abnormal Golgi morphology.Along with the reperfusion time extended,the Golgi apparatus gradually fragmented,it was the most obvious at 12 h and 24 h of reperfusion.The protein expression levels of GM130 and GAAP were decreased significantly at 12 h and 24 h time points after OGD/R (P<0.05).Performing OGD/R treatment after over-expressed Grasp65 in HT22 cells,Golgi fragmentation were significantly decreased (P<0.05) and the degree of fragmentation alleviated.The protein expressions of GM130 and GAAP were significantly increased (P<0.05).HT22 cells survival rate was greatly improved (P<0.05) and apoptosis rate decreased significantly (P<0.05).Conclusions In the cell model of ischemia reperfusion injury,the same happened to fragmentation of the Golgi apparatus.Over-expression of Grasp65 could alleviate OGD/R-induced Golgi fragmentation and reduce HT22 cells apoptosis,possibly related to the up-regulation of the expression of GM130 and GAAP.

Golgi fragmentation; Apoptosis; Mouse hippocampal neuronal cell line HT22; Grasp65; GM130

1003-2754(2016)12-1067-05

2016-08-24；

2016-09-30 基金項(xiàng)目：湖南省自然科學(xué)基金(No.14JJ2143)；湖南省衛(wèi)計(jì)委科研項(xiàng)目(No.B2012-121) 作者單位：(1.湖南省人民醫(yī)院湖南省老年醫(yī)學(xué)研究所神經(jīng)疾病研究室，湖南 長(zhǎng)沙 410016；2.湖南省人民醫(yī)院馬王堆院區(qū)神經(jīng)內(nèi)科，湖南 長(zhǎng)沙 410016) 通訊作者：周文勝，E-mail：zhouwensheng2004@163.com

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