張靜波 趙磊 岳亮 劉海嘯 李霞 林艷 屈延

(第四軍醫(yī)大學(xué): 1唐都醫(yī)院神經(jīng)外科; 2學(xué)員旅; 3科研部，陜西 西安 710038)

·綜述·

Toll樣受體在腦缺血預(yù)處理中的作用

張靜波1,2趙磊1岳亮1劉海嘯1李霞1林艷3屈延1*

(第四軍醫(yī)大學(xué):1唐都醫(yī)院神經(jīng)外科;2學(xué)員旅;3科研部，陜西 西安 710038)

TOLL樣受體; 缺血預(yù)處理; 血腦屏障

腦損傷分為腦缺血與腦出血兩種類型，相對于出血性腦損傷多種多樣的治療方法，缺血性腦損傷顯得十分棘手，目前來講，血栓溶解療法是缺血性腦損傷的唯一治療途徑。因此，缺血性腦損傷的治療仍是一大難題[1]。

最新研究發(fā)現(xiàn)，預(yù)處理作用是一種能夠?qū)谷毖阅X損傷的方式，其依賴于機體對閾下?lián)p傷、刺激的反應(yīng)，這類反應(yīng)將會有助于對抗隨后更為嚴(yán)重的損傷。而能夠促進預(yù)處理作用發(fā)生的因素包括：麻醉、藥物、炎性因子、短暫的缺血等[2]。

最近部分研究表明，Toll樣受體(Toll-like receptor, TLR)在腦損傷中的活動極為復(fù)雜。盡管TLR能夠使缺血性損傷惡化，但是缺血性損傷前，TLR的短暫激活卻能夠降低繼發(fā)損傷[3-4]。這說明TLR活化作用的利弊取決于受體刺激的時間與強度，因此，TLR的神經(jīng)保護功能在預(yù)防性治療中擁有巨大潛力。

一、TLR受體簡介

從結(jié)構(gòu)上看，TLR的胞外段由大量的亮氨酸重復(fù)序列組成，胞內(nèi)段是toll/白介素-1受體(Toll/interleukin-1 receptor, TIR)結(jié)構(gòu)域，用以激活下游信號通路。TLR主要分布在單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、淋巴細胞以及自然殺傷細胞表面，而在神經(jīng)系統(tǒng)中，則主要表達于小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞中。

從功能上看，源自(異質(zhì))二聚體的TLR能夠與其同源配體結(jié)合(有些需要協(xié)同分子或其他輔助分子的共同參與)，進而激活信號通路，表達炎性介質(zhì)因子以及抗菌效應(yīng)分子[5-8]。TLR還能與包含TIR結(jié)構(gòu)域的接頭分子結(jié)合，從而激活細胞內(nèi)的信號通路。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)4種接頭分子：分別是髓樣分化蛋白88 (myeloid differentiation primary response gene88, MyD88)、包含TIR結(jié)構(gòu)域的接頭蛋白(Toll/lL-1R domain-containing adaptor protein, TIRAP)、誘導(dǎo)干擾素-β的含有TIR結(jié)構(gòu)域的接頭蛋白(TIR domain-containing adaptor inducing INF-β, TRIF)和TIR依賴的接頭分子(TIR-related adaptor molecule, TRAM)。

二、TLR的神經(jīng)保護作用

研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠模型中，其中腦動脈會由于短暫缺血的預(yù)處理作用(ischemic preconditioning, IP)而閉塞10～15 min，這將會減輕小鼠在1 d后發(fā)生的中腦動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)中受到的損傷。而在TLR4基因缺陷的小鼠體內(nèi)，短暫缺血誘導(dǎo)的預(yù)處理保護作用比之野生型小鼠顯著降低，這一研究結(jié)果說明TLR4在短暫缺血誘導(dǎo)的預(yù)處理作用中有著至關(guān)重要的作用[9]。另有研究表明，在小鼠模型中，低劑量的TLR2-4、TLR7以及TLR9的配體均能縮小腦卒中梗死面積[10-14]。這種TLR預(yù)處理作用誘導(dǎo)的神經(jīng)保護作用十分依賴于時間和劑量的選取，例如，由TLR4的配體脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)、TLR7受體激動劑(gardiquimod)以及TLR9的配體胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸(cytosine-phosphate-guanine, CpG)誘導(dǎo)的預(yù)處理作用需要1 d生成，持續(xù)大約7 d，在14 d時消失[11]。因此，TLR預(yù)處理誘導(dǎo)的保護作用通路對于明確內(nèi)源性神經(jīng)保護作用的機制至關(guān)重要，而這一過程將有助于腦卒中治療新靶點的發(fā)現(xiàn)。

通過基因技術(shù)的分析，研究人員已經(jīng)發(fā)現(xiàn)基因組的改變與預(yù)處理導(dǎo)致的神經(jīng)保護作用之間存在聯(lián)系。研究人員通過比較TLR4配體脂多糖、TLR9配體CpG、IP引起的三種預(yù)處理模型的基因改變，發(fā)現(xiàn)基因中的一個序列特異性的誘導(dǎo)缺血性損傷之后的反應(yīng)，而這一段序列僅出現(xiàn)于這三個預(yù)處理模型中，在未經(jīng)預(yù)處理的腦卒中模型中并沒有這段基因出現(xiàn)。通過分析這段基因的啟動子區(qū)，研究人員發(fā)現(xiàn)其包含一個需要干擾素調(diào)節(jié)因子(interferon regulatory factor, IRF)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的序列[12]。為了更加明確IRF與預(yù)處理誘導(dǎo)的保護作用之間的關(guān)聯(lián)性，研究人員使用Lps、CpG以及IP預(yù)處理了IRF-3或IRF-7缺陷小鼠，之后人為造成腦卒中，由于LPS和CpG的預(yù)處理作用均需要IRF轉(zhuǎn)錄因子的參與，因此只有IP預(yù)處理組產(chǎn)生保護作用[12]。這些數(shù)據(jù)均表明TLR4、TLR9預(yù)處理通過IRF3、IRF7通路誘導(dǎo)神經(jīng)保護作用。在上一實驗中，IP組的保護作用只是減弱而未消失，說明IP預(yù)處理作用只部分依賴于IRF3、IRF7通路，這一結(jié)果與Pradillo等[5]的研究結(jié)果一致。同時這些數(shù)據(jù)都說明這三種預(yù)處理激活的IFN關(guān)聯(lián)性反應(yīng)對于神經(jīng)保護作用至關(guān)重要。

發(fā)生腦缺血后，與未經(jīng)預(yù)處理的動物相比，經(jīng)過LPS預(yù)處理的動物中干擾素-β (interferon-β, IFN-β)水平會明顯升高，這一研究結(jié)果證明了干擾素(interferon, IFN)在預(yù)處理誘導(dǎo)的保護作用中十分重要[13-15]，而更為重要的是，腦室內(nèi)的外源性IFN-β能夠在腦缺血后立即減輕其損傷的程度[13]。體外培養(yǎng)實驗中，IFN能夠提高神經(jīng)元在興奮毒性物質(zhì)下的存活率，說明IFN能夠在興奮毒性損傷時直接保護神經(jīng)元[16]。腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)也是TLR預(yù)處理作用中的重要因子。盡管在腦卒中后TNF起到促進損傷的作用，然而LPS和CpG預(yù)處理作用仍需要TNF來誘導(dǎo)保護作用。TNF缺陷小鼠的LPS、CpG預(yù)處理作用會明顯降低，這證明了TNF在預(yù)處理中的重要性[8,11]。在注射LPS引起預(yù)處理作用的數(shù)小時內(nèi)，中樞系統(tǒng)中的TNF會明顯上升[11]。因此可以認為LPS誘導(dǎo)的TNF上升是一種早期信號，這種信號通過限制隨后的TNF信號傳導(dǎo)使大腦能夠應(yīng)對隨后的缺血性損傷[11]。

綜上所述，TLR4配體LPS、TLR9配體CpG誘導(dǎo)的預(yù)處理作用均需要TNF、IRF3和IRF7的參與，卻都不需要干擾素α受體(IFN-α receptor, IFNAR)的參與[11]，這說明TLR信號通路能夠直接激活I(lǐng)RF轉(zhuǎn)錄因子而不需要IFNAR的參與。與之相反，TLR7與TLR3配體所引導(dǎo)的預(yù)處理作用則需要IFNAR的參與[6,17]。因此，保護作用的特異性機制取決于配體的不同。

總而言之，腦卒中誘導(dǎo)了損傷相關(guān)分子模式(damage associated molecular patterns, DAMP)分子的釋放，進而激活TLR，在未經(jīng)預(yù)處理的動物模型中，TLR的激活引起了炎性反應(yīng)的發(fā)生，導(dǎo)致缺血性損傷的惡化。反之，在經(jīng)過預(yù)處理的動物模型中，TLR配體的預(yù)處理作用延遲了TLR的活化。因此，干擾素調(diào)節(jié)因子IRF/IFN能夠支配TLR反應(yīng)的啟動信號，進而減輕缺血性損傷。

三、TLR預(yù)處理作用的靶點

TLR預(yù)處理誘導(dǎo)的神經(jīng)保護作用的信號通路正在逐漸被揭示，然而該保護作用的活性位點卻尚不清楚。TLR主要表達與抗原提呈細胞中，如B細胞、樹突狀細胞、單核細胞、巨噬細胞、上皮細胞、內(nèi)皮細胞、淋巴組織。而在大腦中，TLR主要表達于小膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞[18-19]。因此，大腦和外圍的細胞是TLR配體激活的靶點，而它們在TLR預(yù)處理誘導(dǎo)的保護作用中至關(guān)重要。在外圍細胞感染病毒的研究中，TLR配體的系統(tǒng)性調(diào)節(jié)會影響到大腦中的基因表達，且這種影響不需要跨過血腦屏障[20]。腹腔內(nèi)注射多聚胞苷酸(polyinosinic-polycytidylic acid, poly I∶C) 3 h后，提取血漿并注射入動物幼體，將引發(fā)后者腦內(nèi)的炎性反應(yīng)，而血漿中只能檢測到微量的poly I∶C。綜上所述，可以推斷poly I∶C能夠跨過血腦屏障并直接影響到腦實質(zhì)的細胞，甚至有可能間接地影響到大腦基因的表達[20]。

為了研究預(yù)處理作用是直接還是間接作用于大腦，研究人員建立了TLR9骨髓嵌合體小鼠模型(這種小鼠只在造血干細胞或內(nèi)皮細胞中表達TLR9，且不會同時在二者中表達)，研究人員發(fā)現(xiàn)CpG預(yù)處理作用誘導(dǎo)的神經(jīng)保護作用在這種小鼠中是缺失的[21]。這些數(shù)據(jù)說明TLR9誘導(dǎo)的神經(jīng)保護作用需要TLR9各種細胞中表達，且內(nèi)皮細胞與造血干細胞之間一定有著重要的相互作用。因為內(nèi)皮細胞與造血干細胞表達TLR，而身體內(nèi)的TLR配體會同時直接接觸循環(huán)中的造血細胞以及內(nèi)皮細胞，潛在的改變這二者之間的相互作用，而這種相互作用極有可能通過激活通向大腦的信號通路，從而引起基因的表達和再編譯[22]。

TLR配體也可能越過血腦屏障(blood brain barrier, BBB)直接作用于腦細胞，實驗發(fā)現(xiàn)，在皮質(zhì)神經(jīng)元中，TLR配體誘導(dǎo)保護作用能夠防止糖氧剝奪的發(fā)生[8-9,11]這說明TLR配體能夠直接保護神經(jīng)元免受損傷。

四、TLR預(yù)處理與血腦屏障

血腦屏障(BBB)是具有選擇性的物理屏障，其介于血管與大腦之間，由大腦內(nèi)皮毛細血管以及內(nèi)皮細胞構(gòu)成。完整血腦屏障中相鄰內(nèi)皮細胞之間的緊密連接蛋白能夠限制血管和大腦之間的分子交換。血腦屏障內(nèi)皮細胞與腦實質(zhì)中的星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞緊密相連，這一復(fù)合體構(gòu)成了神經(jīng)系統(tǒng)微環(huán)境穩(wěn)態(tài)的基礎(chǔ)。因此，血腦屏障中的內(nèi)皮細胞是TLR配體傳遞信號最初經(jīng)過的區(qū)域。

最近一些研究表明，TLR預(yù)處理作用可以直接影響到血腦屏障，研究人員利用試管中的血腦屏障模型(這種模型具有血腦屏障的特有功能)，證實了有著TLR3配體—多聚胞苷酸多聚賴氨酸(polyester-IC-polyester-L-lysine, Poly-ICLC)(主要成份：羧甲基纖維素，聚肌胞苷酸，多聚賴胺酸雙股RNA)、黑素瘤差異化相關(guān)基因5 (melanoma differentiation-associated gene-5, MDA5)和維甲酸誘導(dǎo)基因I (retinoic acid-inducible gene I, RIGI)的腦缺血模型中預(yù)處理作用的效果，poly-ICLC的預(yù)處理作用極大地降低了糖氧剝奪(oxygen glucose deprivation, OGD)對于轉(zhuǎn)移上皮電阻(trans epithellal electric resistance, TEER)的影響，從而保護了血腦屏障的功能[17]。此外poly-ICLC預(yù)處理作用還能夠保護緊密連接蛋白，從而保護血腦屏障的功能[17]。

在實驗中，poly-ICLC誘導(dǎo)的血腦屏障保護作用依賴于IFNAR信號通路，事實上，研究人員發(fā)現(xiàn)poly-ICLC能夠在發(fā)生糖氧剝奪前誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細胞/小膠質(zhì)細胞的IFN-β保護作用[16]。培養(yǎng)物中IFN-β基因缺陷膠質(zhì)細胞的神經(jīng)保護作用會發(fā)生缺失，說明了poly-ICLC誘導(dǎo)保護作用需要IFNAR信號通路的參與。此外，IFNAR基因缺陷的內(nèi)皮細胞同樣不會產(chǎn)生poly-ICLC預(yù)處理誘導(dǎo)的保護作用?；谶@些結(jié)果，研究人員認為神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的poly-ICLC可以通過血腦屏障的內(nèi)皮細胞，并作用于膠質(zhì)細胞，刺激這些細胞產(chǎn)生IFN-β。隨后，IFN-β能夠與其受體(IFNAR)結(jié)合并傳導(dǎo)信號至BBB另一側(cè)的內(nèi)皮細胞，從而穩(wěn)定內(nèi)皮細胞并提供保護作用。這是首次通過實驗證明了poly-ICLC誘導(dǎo)的保護作用能夠減輕腦缺血引起的血腦屏障功能障礙。更為重要的是，這一機制是TLR介導(dǎo)的神經(jīng)保護作用中重要的一環(huán)，并且它證明了血腦屏障信號通路的靶向治療在防止腦卒中中充滿潛力。

五、總結(jié)

TLR不但在免疫反應(yīng)中扮演重要角色，其在缺血性腦損傷中的作用亦不可忽視。更為重要的是，由于TLR活性調(diào)節(jié)引起的預(yù)處理作用能夠產(chǎn)生神經(jīng)保護作用以耐受缺血性損傷，因此，TLR的預(yù)處理作用將在缺血性腦損傷的預(yù)防治療中大放異彩?？偟膩碚f，TLR的預(yù)處理作用能夠很好地防止大腦損傷。這一概念已經(jīng)被應(yīng)用于臨床治療中，即利用某一器官短暫的缺血再灌注誘導(dǎo)其他器官的缺血耐受性。有一項研究發(fā)現(xiàn)，肢體部位的預(yù)處理作用能夠為心臟外科手術(shù)提供保護，并在接下來的6個月中減輕大腦缺血性損傷，這說明預(yù)處理作用所產(chǎn)生的保護作用已經(jīng)擴散至腦部。由于注射方便，使用TLR激動劑在外科手術(shù)前以及腦卒中的預(yù)防治療中成為一項不錯的選擇。

目前，部分TLR配體已經(jīng)被批準(zhǔn)使用于食物和藥物，卡介苗便是其中一種，它是TLR2和TLR4的激動劑，被廣泛引用于結(jié)核的免疫和膀胱原位癌的免疫療法中[23]。這一進展使得臨床治療更為可靠。

TLR預(yù)處理作用的研究會為人類帶來兩大進展：①對這類物質(zhì)特性的研究將有助于預(yù)防療法的發(fā)展，并為篩選腦卒中和圍手術(shù)期缺血損傷的高?；颊咛峁﹨⒖迹虎诮沂緝?nèi)源性神經(jīng)保護的分子機制。這些研究將會為缺血性損傷的治療提供新的途徑并且在臨床中取得更大的進展。

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1671-2897(2017)16-368-03

國家自然科學(xué)基金資助項目(81222015; 81571215)；教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計劃資助項目(NCET-12-1004)；科技部創(chuàng)新人才推進計劃中青年科技創(chuàng)新領(lǐng)軍人才資助項目(2013RA2181)

張靜波，本科生，E-mail:49554556@qq.com

*通訊作者：屈延，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail:yanqu0123@163.com

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A

2015-10-26；

2016-02-05)