■吳 凌

(福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，福建福州350002)

肌醇學(xué)名環(huán)己六醇，是水溶性B族維生素的一種，作為維持水生動(dòng)物正常生理功能必需的營(yíng)養(yǎng)素之一,被廣泛應(yīng)用于水生動(dòng)物飼料中。當(dāng)飼料中肌醇含量過(guò)低時(shí)會(huì)影響水產(chǎn)動(dòng)物的正常生長(zhǎng),易造成水產(chǎn)動(dòng)物生長(zhǎng)緩慢、厭食、皮膚易受損傷等癥狀[1-2]。研究表明，飼料中適量添加肌醇可提高哲羅鮭、黑鯛、草魚和蝦類等水產(chǎn)動(dòng)物的食欲，提高飼料利用效率，促進(jìn)肝臟和其它組織中脂肪的代謝，提高動(dòng)物的成活率和消化酶活性及生長(zhǎng)性能，提高免疫力[3-5]；與此同時(shí)，由于肌醇價(jià)格較高，與葡萄糖外形相似，故常有摻假情況發(fā)生[6]。因此，如何準(zhǔn)確測(cè)定水產(chǎn)飼料中肌醇的含量是飼料生產(chǎn)過(guò)程中面臨的重要問(wèn)題之一。

目前，肌醇常用的檢測(cè)方法有微生物法、液相色譜法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法和氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、氣相色譜法等[7-13]。由于飼料成分的特殊性和復(fù)雜性，微生物法不適用于飼料中的肌醇檢測(cè)，液相色譜法對(duì)色譜柱要求嚴(yán)格且檢測(cè)限較高，液質(zhì)法、氣質(zhì)法由于所需儀器價(jià)格高，難以大面積推廣使用，而氣相色譜法操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，適合于飼料中的肌醇檢測(cè)。本文建立了衍生氣相色譜法測(cè)定漁用飼料中肌醇的含量的方法，并用該方法對(duì)某些漁用飼料中的肌醇含量進(jìn)行了考察，能滿足大批量樣品的檢測(cè)需求，為準(zhǔn)確評(píng)價(jià)水產(chǎn)飼料中的營(yíng)養(yǎng)成分提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 6890A氣相色譜儀（配FID檢測(cè)器，自動(dòng)進(jìn)樣器和化學(xué)工作站）、BT224S天平(德國(guó)Sartorius公司)、石英毛細(xì)管柱ZB-5（美國(guó)Phenomenex公司）、HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇康健醫(yī)療用品有限公司)、H2050R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）、KQ-800KDE型功率數(shù)控超聲波清洗器(常州諾基儀器有限公司)、EZ-2溶劑蒸發(fā)儀（英國(guó)Genevac公司）、XW-80A渦旋混勻器(上海習(xí)仁科學(xué)儀器有限公司)。

試劑：肌醇標(biāo)準(zhǔn)品(德國(guó)Dr公司，純度≥99.2%)、N,N-二甲基甲酰胺、三甲基氯硅烷、六甲基二硅胺烷、異辛烷(均為色譜純?cè)噭?，?gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，試驗(yàn)用水符合GB/T 6682—2008中二級(jí)用水規(guī)定。

1.2 氣相色譜條件

色譜柱：ZB-5（30 m×0.32 mm×0.25 μm），柱箱溫度：100℃，保持1 min，以10℃/min速率升到220℃，保持6 min；檢測(cè)器溫度：300℃；進(jìn)樣口溫度：270℃；載氣：氮?dú)猓兌炔恍∮?9.999%）；輔助氣：氫氣（純度不小于99.99%），空氣（壓縮空氣）；氣體流量：柱流量2.50 ml/min，氫氣30 ml/min，空氣400 ml/min，尾吹氣30 ml/min；進(jìn)樣量：1 μl；分流比：5∶1。在此色譜條件下，典型的色譜圖見圖1。

1.3 操作步驟

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制

精確稱取已在105℃條件下烘至恒重的肌醇標(biāo)準(zhǔn)品0.10 g（精確至0.000 1 g），用去離子水溶解，并稀釋定容至100 ml，該儲(chǔ)備液為1 000 μg/ml。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)工作液配制

分別移取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.25、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.0 ml置于6個(gè)100 ml容量瓶中，用去離子水定容，搖勻備用，配制成濃度為2.50、10.0、20.0、40.0、60.0、80.0、100.0 μg/ml的肌醇標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.3 衍生劑配制

將三甲基氯硅烷、六甲基二硅胺烷、N,N-二甲基甲酰胺按體積比1∶2∶8混合均勻,裝于細(xì)口瓶中密封，現(xiàn)配現(xiàn)用。

增大截面法是結(jié)合植筋增大受力構(gòu)件截面面積，從而增大截面慣性矩，緩和應(yīng)力梯度、提高抗彎剛度、增強(qiáng)抗震性能，具有概念清晰、施工快速、中斷交通時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，因而常用于鋼筋混凝土梁柱結(jié)構(gòu)加固。目前加固設(shè)計(jì)多采用手算，存在控制截面關(guān)鍵參數(shù)驗(yàn)算繁雜，存在位移、內(nèi)力、應(yīng)力、破壞區(qū)極值、范圍隨加固方案變化等諸多問(wèn)題，本文研究了加固設(shè)計(jì)簡(jiǎn)化計(jì)算方法，以期提高工程加固設(shè)計(jì)效率。

1.3.4 試樣溶液制備

提?。悍Q取已粉碎好的飼料樣品2 g（精確至0.000 1 g），置于100 ml容量瓶中，加水約70 ml，然后超聲20 min，冷卻至室溫，用水定容、搖勻，取10 ml轉(zhuǎn)移至20 ml離心管，4 000 r/min離心5 min，吸取1 ml溶液于20 ml頂空瓶中，于溶劑蒸發(fā)儀中真空濃縮至干。

衍生化：在濃縮至干的樣品中加入1 ml上述配制好的衍生劑，渦旋1 min，封蓋，80℃水浴反應(yīng)20 min，取出，冷卻至室溫；加入5 ml去離子水和3 ml異辛烷，渦旋1 min后靜置分層，吸取上層異辛烷層，加入少量無(wú)水硫酸鈉，振搖后，取適量上清液上機(jī)測(cè)定。

1.3.5 測(cè)定

在上述選定的色譜條件下，待儀器穩(wěn)定后，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)溶液和試樣溶液氣相色譜分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 系統(tǒng)適用性

分別取空白基質(zhì)樣品、標(biāo)準(zhǔn)品和漁用預(yù)混料樣品按上述前處理方法制備的溶液，按所述色譜條件測(cè)定。測(cè)定結(jié)果表明，空白基質(zhì)樣品在肌醇保留時(shí)間處無(wú)雜質(zhì)峰干擾(見圖1A)，表明樣品中其他成分不干擾測(cè)定，方法特異性強(qiáng)，適用于漁用預(yù)混料中肌醇含量測(cè)定。

2.2 線性關(guān)系考察

將肌醇標(biāo)準(zhǔn)系列溶液在上述的氣相色譜條件下進(jìn)樣分析，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=1.065 2X+0.362 91，相關(guān)系數(shù)r=0.999 8；結(jié)果表明，肌醇濃度在2.50～100.0 μg/ml范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.3 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取同一樣品6份，按上述的前處理方法制備供試品溶液，按前述方法測(cè)定含量，結(jié)果見表1，6份樣品含量平行測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為2.3%，試驗(yàn)結(jié)果表明方法重現(xiàn)性好。

表1 重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果

2.4 回收率試驗(yàn)

在2 g空白樣品基質(zhì)中加入一定量的肌醇標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行回收率試驗(yàn)，用上述試樣制備方法提取、衍生、萃取后，進(jìn)行GC分析檢測(cè)，結(jié)果表明方法回收率理想，不同加標(biāo)水平的回收率在93.4%～102.7%之間，具體結(jié)果見表2。

表2 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

2.5 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

按1.3.4中的前處理方法制備樣品溶液，按1.2中儀器條件方法測(cè)定肌醇含量，樣品溶液密封保存在冰箱冷藏環(huán)境中，隔4、8、24、48 h測(cè)定含量，結(jié)果見表3，表明樣品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

表3 樣品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.6 實(shí)際樣品測(cè)定

對(duì)3個(gè)漁用預(yù)混料試樣品，分別精確稱樣后，用上述試樣制備方法提取、衍生后，上GC分析。漁用預(yù)混料中肌醇含量測(cè)定結(jié)果如表4所示，測(cè)定結(jié)果與理論值相符。

表4 漁用預(yù)混料中肌醇含量測(cè)定結(jié)果

2.7 譜圖

空白樣品基質(zhì)譜圖見圖1A，肌醇標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品見圖1B，空白樣品基質(zhì)加肌醇標(biāo)樣見圖1C，漁用預(yù)混料樣品見圖1D。

2.8 色譜柱選擇

漁用預(yù)混料成分較為復(fù)雜，一般由魚粉、麥麩、豆粕、礦物鹽等多種成分組成，要得到良好的分離效果，色譜柱的選擇極為重要。本文考察了3種不同極性的色譜柱，ZB-5、DB-35及ZB-WAX毛細(xì)管色譜柱，綜合考慮分離效果、峰形、樣品基質(zhì)中其他組分出峰情況以及整體分析時(shí)間，ZB-5毛細(xì)管色譜柱效果最好，因此以ZB-5毛細(xì)管色譜柱作為本研究試驗(yàn)用色譜柱。

2.9 柱溫優(yōu)化確定

柱溫是氣相色譜分離的重要參數(shù)，在色譜條件的摸索過(guò)程中，曾參照有關(guān)文獻(xiàn)[8-11]，考慮到漁用預(yù)混料中組分較多，組分間性質(zhì)、沸點(diǎn)差異大，采用等溫檢測(cè)時(shí)各組分間分離不理想，故采用程序升溫法。比較60、100、120、150℃等初溫和多種程序升溫速率，在滿足系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)要求下,盡可能避免組分殘留和縮短分析時(shí)間；通過(guò)試驗(yàn)摸索出最優(yōu)升溫程序，即100℃保持1 min后以10℃/min速率升到220℃并保持6 min，此條件下樣品中的肌醇成分與其他組分完全分離，滿足分離要求。

2.10 提取溶劑的選擇

根據(jù)文獻(xiàn)，肌醇易溶于水，在25℃時(shí)水中溶解度為14 g/100 ml，且相關(guān)肌醇含量測(cè)定的多數(shù)文獻(xiàn)也采用水為提取溶劑，水與其他溶劑相比無(wú)毒，價(jià)格便宜，所以選擇水作為提取溶劑，試驗(yàn)證明結(jié)果良好。

2.11 除水步驟的控制

本試驗(yàn)衍生反應(yīng)是通過(guò)硅烷化試劑的硅烷化作用將硅氧基引入肌醇分子中，取代其結(jié)構(gòu)中的六個(gè)活性氫鍵，從而降低其極性，增強(qiáng)其揮發(fā)性同時(shí)提高其熱穩(wěn)定性；也正因?yàn)楣柰榛噭?duì)活潑氫敏感，可與其發(fā)生反應(yīng)，所以硅烷化試劑同樣對(duì)水非常敏感，在有水的環(huán)境中會(huì)自行分解失效，從而影響衍生效率。由于水的沸點(diǎn)較高，采用傳統(tǒng)的水浴蒸除法和旋轉(zhuǎn)濃縮法去除，不易去除完全，如果試驗(yàn)人員的經(jīng)驗(yàn)不足，容易導(dǎo)致衍生不完全，重現(xiàn)性差、結(jié)果偏低；本試驗(yàn)采用EZ-2型自動(dòng)平行溶劑蒸發(fā)儀，通過(guò)控制真空度、紅外加熱溫度、蒸發(fā)時(shí)間等參數(shù)可以較好地達(dá)到去除水分的目的，重現(xiàn)性好且效率高。

2.12 硅烷化條件的優(yōu)化確定

2.12.1 衍生溫度的選擇

肌醇的衍生化反應(yīng)需要在一定的溫度下進(jìn)行，因此溫度高低決定其衍生反應(yīng)是否能夠進(jìn)行完全。選擇加標(biāo)量為5 000 mg/kg的空白預(yù)混料樣品作為試驗(yàn)對(duì)象，對(duì)不同衍生溫度60、65、70、75、80、85、90 ℃進(jìn)行考察，以肌醇衍生物的峰面積大小作為評(píng)價(jià)衍生效果的參數(shù)。由試驗(yàn)結(jié)果得知，目標(biāo)化合物的峰面積隨溫度升高逐漸變大，到80℃后開始逐漸減小，原因是在大于80℃時(shí)，肌醇才能與硅烷化試劑結(jié)合生成結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的六(三甲硅氧基)環(huán)己烷，硅烷化反應(yīng)完全，但是水浴溫度過(guò)高時(shí)，生成的產(chǎn)物由于水浴溫度太高而易揮發(fā)，導(dǎo)致其測(cè)定值降低。故本試驗(yàn)選擇80℃作為肌醇衍生反應(yīng)的最優(yōu)水浴溫度。

2.12.2 衍生時(shí)間的選擇

以加標(biāo)量為5 000 mg/kg的空白預(yù)混料樣品作為試驗(yàn)對(duì)象，在80 ℃條件下對(duì)10、15、20、25、30 min和35 min的衍生時(shí)間對(duì)硅烷化反應(yīng)的影響進(jìn)行了考察。結(jié)果顯示，從20 min開始隨著衍生時(shí)間的增加，衍生物的峰面積不再明顯增加，表明該反應(yīng)在20 min時(shí)已反應(yīng)完全。故本試驗(yàn)選擇衍生時(shí)間20 min為最優(yōu)衍生時(shí)間。

3 結(jié)論

本文通過(guò)大量試驗(yàn)對(duì)漁用飼料中肌醇的測(cè)定進(jìn)行了探索，最終選擇出最適用于漁用飼料樣品的前處理?xiàng)l件，并采取衍生氣相色譜法對(duì)肌醇進(jìn)行測(cè)定，且通過(guò)平行測(cè)定、加標(biāo)回收以及對(duì)已知添加值的實(shí)際樣品的測(cè)定等手段對(duì)該方法的準(zhǔn)確性和精密度進(jìn)行了考察。試驗(yàn)結(jié)果表明,由于方法選用得當(dāng)，檢測(cè)結(jié)果能真實(shí)反映漁用飼料樣品中肌醇的含量。與傳統(tǒng)國(guó)標(biāo)方法相比，該方法操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好，同時(shí)可以滿足實(shí)際檢測(cè)工作中大批量樣品檢測(cè)的需求，是一種更為準(zhǔn)確、高效的分析方法。另外，本文通過(guò)對(duì)漁用飼料樣品肌醇的定量分析，為漁用預(yù)混料的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)，為準(zhǔn)確評(píng)價(jià)水產(chǎn)飼料中的營(yíng)養(yǎng)成分提供了有力的參考。