■ 鄧永平 劉曉蘭* 魯 頌 波麗特 郭建華 艾瑞波

(1.齊齊哈爾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾161006；2.黑龍江省普通高校農(nóng)產(chǎn)品深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江齊齊哈爾161006；3.齊齊哈爾大學(xué)理學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾161006）

α-半乳糖苷酶（α-D-galactoside galactohydro?lase，EC 3.2.1.22）是一種外切糖苷酶，可專一性地催化α-半乳糖苷鍵的水解，棉籽糖、水蘇糖、蜜二糖、毛蕊花糖以及刺槐豆、瓜爾膠等多糖均可作為其底物[1-4]。α-半乳糖苷酶在食品、飼料和醫(yī)藥等領(lǐng)域有重要應(yīng)用，如用于降解大豆產(chǎn)品中存在的不可消化的低聚糖，可有效改善機(jī)體因缺乏該酶引起的腸胃不適、脹氣等食物不耐受問(wèn)題[5-7]；用于除去甜菜和糖漿中棉籽糖以及轉(zhuǎn)糖基[8-9]；可有效降解飼料中存在的半乳糖苷等抗?fàn)I養(yǎng)因子，提高飼料的利用率，增加動(dòng)物采食量[10]；可用于治療法布里病[11]。因此，α-半乳糖苷酶成為目前的研究熱點(diǎn)。

研究人員對(duì)多種微生物來(lái)源的α-半乳糖苷酶的發(fā)酵條件和酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，如米根霉變種（Rhizopus oryzae strain）SUK、嗜酸乳桿菌（Lactobacil?lus acidophilus）、籃 狀 菌（Talaromyces leycettanus）JCM12802、米赫根毛霉菌（Rhizomucor miehei）等菌株經(jīng)固體發(fā)酵或液體發(fā)酵均可產(chǎn)α-半乳糖苷酶[12-15]。固體發(fā)酵（SSF）生產(chǎn)設(shè)備簡(jiǎn)單，水分含量低，不易污染雜菌，還可以使用廉價(jià)的農(nóng)業(yè)工業(yè)廢物作為底物，由于使用較少的溶劑萃取產(chǎn)物，所以產(chǎn)物濃度較高，純化過(guò)程成本較低，是生產(chǎn)酶的重要技術(shù)[16]。

蛹蟲草(Cordyceps militaris)又名北冬蟲夏草，是蟲草屬的模式種，與中華冬蟲夏草同屬于真菌門(Eu?mycota)、子囊菌亞門(Ascomycotina)、核菌綱(Pyrenomy?cetes)、球殼目(Sphaeriales)、麥角菌科(Clavicipitaceae)、蟲草屬(Cordyceps)[17]。蛹蟲草在我國(guó)的黑龍江、吉林、遼寧等省份均有野生分布，是名貴的食藥兼用大型真菌，具有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤等多種生理活性[18-20]。蛹蟲草經(jīng)發(fā)酵可產(chǎn)多種生物活性成分，但到目前為止，未見有蛹蟲草發(fā)酵產(chǎn)α-半乳糖苷酶的報(bào)道。

在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)在蛹蟲草菌固體發(fā)酵產(chǎn)物中含有α-半乳糖苷酶活力。本文對(duì)蛹蟲草菌固體發(fā)酵工農(nóng)業(yè)廢物產(chǎn)α-半乳糖苷酶的培養(yǎng)條件進(jìn)行了探索，以期為來(lái)源安全菌株的α-半乳糖苷酶的生產(chǎn)提供新思路，為利用工農(nóng)業(yè)廢棄物產(chǎn)高附加值產(chǎn)物提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 菌種

蛹蟲草菌(Cordyceps militaris)，CGMCC No.1836。

1.2 試劑和儀器

pNPG購(gòu)自Sigma公司；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?。CF15RXII高速冷凍離心機(jī)(Hitachi)；高速萬(wàn)能粉碎機(jī)FW80(天津市泰斯特儀器有限公司)；分光光度計(jì)TU-1810(北京普析通用儀器有限公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)基

改良PDA培養(yǎng)基（%）[21]：葡萄糖1、蛋白胨0.5、馬鈴薯汁20、磷酸二氫鉀0.1、硫酸鎂0.05、瓊脂2.0，pH值自然。

種子培養(yǎng)基（%）：葡萄糖2、蛋白胨0.5、馬鈴薯汁20、磷酸二氫鉀0.1、硫酸鎂0.05，pH值自然。

固體發(fā)酵培養(yǎng)基：在250 ml三角瓶中裝入12 g物料，物料種類及物料配比根據(jù)試驗(yàn)確定。

1.3.2 培養(yǎng)方法

將蛹蟲草菌株挑取至改良PDA斜面上，在23℃培養(yǎng)7 d后，挑取斜面培養(yǎng)物，接入改良PDA平板中，在23℃培養(yǎng)15 d，用無(wú)菌打孔器在生長(zhǎng)良好的平板培養(yǎng)物上取出1.5 cm的菌塊，接種到裝有100 ml種子培養(yǎng)基的250 ml三角瓶中，23℃振蕩培養(yǎng)5 d，搖床轉(zhuǎn)速180 r/min。將液體種子接入固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在23℃培養(yǎng)一定時(shí)間。

1.3.3 粗酶液的制備

培養(yǎng)結(jié)束后，向固體發(fā)酵培養(yǎng)物中加入100 ml生理鹽水，在180 r/min浸提酶2 h。浸提結(jié)束后，過(guò)濾除濾渣，在4℃、10 000 r/min離心10 min，得到粗酶液。

1.3.4 酶活力的測(cè)定

采用pNPG比色法，參考莫海飛等[22]進(jìn)行。

酶活力定義：在37℃條件下，每分鐘分解底物生成1.0 μg硝基酚所需酶量為一個(gè)酶活力單位，用U/g表示。

1.3.5 碳、氮源對(duì)α-半乳糖苷酶活力的影響

以麩皮為碳源，分別以花生粕、豆粕、棉籽粕、菜籽粕和豆餅粉作為氮源，碳、氮源比例為2∶1，培養(yǎng)基含水量為1∶1，接種后于23℃培養(yǎng)72 h，通過(guò)測(cè)定酶活力確定合適的氮源；以菜籽粕為氮源，分別以燕麥、玉米皮、稻殼、麩皮為碳源，碳、氮源比例為2∶1，培養(yǎng)基含水量為1∶1，接種后于23℃培養(yǎng)72 h，通過(guò)測(cè)定酶活力確定合適的碳源；調(diào)節(jié)麩皮與菜籽粕比例為6∶1、5∶1、4∶1、3∶1和2∶1，培養(yǎng)基含水量為1∶1，接種后于23℃培養(yǎng)72 h，通過(guò)測(cè)定酶活力確定合適的碳氮源比例。

1.3.6 誘導(dǎo)物對(duì)α-半乳糖苷酶活力的影響

以瓜爾豆膠、刺槐豆膠、棉籽糖、水蘇糖和乳糖為待選誘導(dǎo)物，以麩皮和菜籽粕為原料，物料比為3∶1，培養(yǎng)基含水量為1∶1，待選誘導(dǎo)物的加量為1%，接種后于23℃培養(yǎng)72 h，通過(guò)測(cè)定酶活力確定合適的誘導(dǎo)物。

1.3.7 培養(yǎng)條件對(duì)α-半乳糖苷酶活力的影響

以α-半乳糖苷酶的活力為指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)對(duì)影響蛹蟲草菌固體發(fā)酵產(chǎn)α-半乳糖苷酶的培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，包括培養(yǎng)基初始pH值（以0.1 mol/l的HCl或NaOH溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的初始pH值分別為4、5、6、7、8、9）、含水量（調(diào)節(jié)培養(yǎng)基含水量分別為1∶0.4、1∶0.6、1∶0.8、1∶1和1∶1.2）和培養(yǎng)時(shí)間（72、84、96、108 h和120 h），并且在后續(xù)的試驗(yàn)中使用最佳條件，平行試驗(yàn)三次。

2 結(jié)果與討論

2.1 碳、氮源對(duì)α-半乳糖苷酶活力的影響

2.1.1 氮源對(duì)α-半乳糖苷酶活力的影響

水蘇糖和棉籽糖對(duì)黑曲霉（Aspergillus nige）zju-Y1、羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri）產(chǎn)α-半乳糖苷酶均有誘導(dǎo)作用[23-24]。選擇含水蘇糖和棉籽糖量較高的氮源，如花生粕、豆粕、棉籽粕、菜籽粕和豆餅粉作為蛹蟲草固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)α-半乳糖苷酶的培養(yǎng)基氮源?？紤]到蛹蟲草是嚴(yán)格好氧菌，故選擇疏松、保水能力較強(qiáng)并能提供碳水化合物、蛋白質(zhì)和多種微量元素的麩皮作為碳源。產(chǎn)α-半乳糖苷酶情況如圖1所示。

圖1 氮源對(duì)α-半乳糖苷酶活力的影響

由圖1可知，當(dāng)以菜籽粕為培養(yǎng)基主料時(shí)，菌株產(chǎn)α-半乳糖苷酶的活力明顯高于其他幾種物料。菜籽粕中水蘇糖與棉籽糖含量明顯高于其他幾種物料，其比例接近1∶1，蛹蟲草產(chǎn)生的α-半乳糖苷酶能分解多糖生成α-連接的末端非還原性的D-半乳糖，提供生命活動(dòng)所需的能量，可能對(duì)產(chǎn)酶有較好誘導(dǎo)作用。

2.1.2 碳源對(duì)α-半乳糖苷酶活力的影響

以菜籽粕為氮源，分別以燕麥、玉米皮、稻殼、麩皮為碳源，試驗(yàn)條件同上，確定碳源對(duì)蛹蟲草固體發(fā)酵產(chǎn)α-半乳糖苷酶的影響。結(jié)果見圖2。

圖2 碳源對(duì)α-半乳糖苷酶活力的影響

如圖2所示，當(dāng)麩皮為碳源時(shí)，蛹蟲草固體發(fā)酵產(chǎn)α-半乳糖苷酶的效果最好，與燕麥及玉米皮相比，麩皮賦予培養(yǎng)基更大疏松度，有利于蛹蟲草菌株長(zhǎng)時(shí)間好氧發(fā)酵，故選用麩皮做為碳源。

2.1.3 碳、氮源比例對(duì)α-半乳糖苷酶活力的影響

微生物固體發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源和氮源的比例對(duì)于目標(biāo)物質(zhì)的生產(chǎn)特別重要，如果氮源過(guò)多，則菌體生長(zhǎng)過(guò)于旺盛，不利于代謝產(chǎn)物積累，氮源不足則菌體生長(zhǎng)過(guò)慢。碳源不足，容易引起菌體衰老和自溶。因此，需要對(duì)麩皮與菜籽粕的比例進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)結(jié)果見圖3。

圖3 碳、氮源比例對(duì)α-半乳糖苷酶活力的影響

麩皮使培養(yǎng)基結(jié)構(gòu)疏松，給發(fā)酵提供了所需的氣體交換空間，有利于好氧菌蛹蟲草菌呼吸產(chǎn)能，菜籽粕富含蛋白質(zhì)，為酶的合成提供原料，如圖3所示，當(dāng)麩皮與菜籽粕比例為3∶1時(shí)，產(chǎn)酶活力最高。

2.2 誘導(dǎo)物對(duì)α-半乳糖苷酶活力的影響

α-半乳糖苷酶是一種誘導(dǎo)酶，在培養(yǎng)基中添加酶的底物可以提高酶的表達(dá)量[24]。除了棉籽糖、水蘇糖外，短鏈的α-半乳糖苷類化合物對(duì)α-半乳糖苷酶的誘導(dǎo)也有一定效果。瓜爾豆膠、刺槐豆膠均為一種由配糖鍵結(jié)合的半乳甘露聚糖組成的高分子量水解膠體多糖，含有α-半乳糖苷酶水解位點(diǎn)α-半乳糖苷鍵。選擇瓜爾豆膠、刺槐豆膠、棉籽糖、水蘇糖和乳糖為誘導(dǎo)物進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果見圖4。

圖4 誘導(dǎo)物對(duì)α-半乳糖苷酶活力的影響

如圖4所示，與無(wú)誘導(dǎo)物的對(duì)照組相比，添加誘導(dǎo)物使菌株產(chǎn)酶活力提高，其中添加刺槐豆膠時(shí)菌株產(chǎn)酶活力明顯高于其他幾種物質(zhì)，瓜爾豆膠的誘導(dǎo)效果僅次于刺槐豆膠，這與黑曲霉菌（Aspergillus nige）zju-Y1產(chǎn)α-半乳糖苷酶的誘導(dǎo)物一致[23]。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果選擇刺槐豆膠作為蛹蟲草固體發(fā)酵產(chǎn)α-半乳糖苷酶的誘導(dǎo)物。

2.3 培養(yǎng)條件對(duì)α-半乳糖苷酶活力的影響

2.3.1 培養(yǎng)基含水量確定

培養(yǎng)基含水量影響微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用及代謝產(chǎn)物的生成，進(jìn)而影響到微生物的生長(zhǎng)狀態(tài)和產(chǎn)酶量。水分太少不利于菌絲生長(zhǎng)，水分過(guò)多導(dǎo)致通氣減弱。培養(yǎng)基含水量對(duì)產(chǎn)酶的影響結(jié)果見圖5。

如圖5所示，當(dāng)培養(yǎng)基料水比為1∶1時(shí)，α-半乳糖苷酶酶活力最高，當(dāng)培養(yǎng)基料水比大于1∶1時(shí)，微生物代謝速率下降，影響產(chǎn)酶；當(dāng)培養(yǎng)基料水比小于1∶1時(shí)，水分比例高，空氣的流通性減弱，對(duì)于好氧性的蛹蟲草菌來(lái)說(shuō)氧氣不足，生長(zhǎng)受抑制，產(chǎn)α-半乳糖苷酶效率也有所下降，尤其在料水比1∶0.4時(shí)，培養(yǎng)物中完全檢測(cè)不到酶活力。因此，確定蛹蟲草菌株固體發(fā)酵產(chǎn)α-半乳糖苷酶的培養(yǎng)基料水比為1∶1。

2.3.2 培養(yǎng)基初始pH值的確定

培養(yǎng)基初始pH值影響微生物原生質(zhì)膜所帶的電荷以及某些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的分解和電離程度，從而影響微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收。培養(yǎng)基初始pH值對(duì)蛹蟲草固體發(fā)酵產(chǎn)α-半乳糖苷酶活力的影響結(jié)果見圖6。

圖6 培養(yǎng)基初始pH值對(duì)α-半乳糖苷酶活力的影響

如圖6所示，培養(yǎng)基最適初始pH值為6時(shí)適合蛹蟲草菌株產(chǎn)α-半乳糖苷酶，當(dāng)pH值小于或大于6時(shí)，酶活力隨著pH值改變呈下降的趨勢(shì)。確定蛹蟲草固體發(fā)酵產(chǎn)α-半乳糖苷酶的培養(yǎng)基初始pH值為6。

2.3.3 培養(yǎng)時(shí)間的確定

以麩皮和菜籽粕為原料，物料比為3∶1，誘導(dǎo)物為刺槐豆膠，培養(yǎng)基含水量為1∶1，培養(yǎng)時(shí)間分別設(shè)定為72、84、96、108 h和120 h，于23 ℃培養(yǎng)，考察培養(yǎng)時(shí)間對(duì)蛹蟲草固體發(fā)酵產(chǎn)α-半乳糖苷酶的影響，試驗(yàn)結(jié)果見圖7。

圖7 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)蛹蟲草固體發(fā)酵產(chǎn)α-半乳糖苷酶的影響

如圖7所示，培養(yǎng)時(shí)間對(duì)蛹蟲草產(chǎn)α-半乳糖苷酶的活力有顯著的影響，培養(yǎng)96 h時(shí)產(chǎn)酶活力較高，繼續(xù)培養(yǎng)，酶活力逐漸下降，原因可能是培養(yǎng)基中可供蛹蟲草菌利用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)逐漸消耗，供氧不足，微生物生長(zhǎng)進(jìn)入衰退期，故選擇96 h為最佳發(fā)酵時(shí)間。

3 結(jié)論

α-半乳糖苷酶在食品、飼料和醫(yī)藥領(lǐng)域有重要應(yīng)用。本文利用藥食兼用的大型真菌蛹蟲草菌固體發(fā)酵生產(chǎn)α-半乳糖苷酶，通過(guò)單因素試驗(yàn)優(yōu)化了產(chǎn)酶條件。固體發(fā)酵培養(yǎng)基由麩皮和菜籽粕組成，物料比為3∶1，誘導(dǎo)物為1%的刺槐豆膠，培養(yǎng)基初始pH值為6，含水量為1∶1，在23℃培養(yǎng)96 h，優(yōu)化條件下產(chǎn)酶活力為5.03 U/g，較優(yōu)化前產(chǎn)酶活力1.23 U/g提高了約4倍。