■ 侯少巖 袁亞莉 杜朋飛 田紅靜 王 敬 吳國(guó)江*

（1.南華大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖南衡陽(yáng)421000；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定071000）

腐植酸（Humic Acid，HA）是由微生物以自然界 中植物殘?bào)w為原料，分解合成的一類富含羧基、酚羥基、醌基、甲氧基等多種活性基團(tuán)的天然有機(jī)大分子聚合物，按照分子量和在不同溶劑中的溶解度不同可分為黑腐酸、棕腐酸和黃腐酸（Fulvic Acid，F(xiàn)A）。其中，黃腐酸具有調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)和內(nèi)分泌活動(dòng)、刺激免疫反應(yīng)、參與蛋白合成，提高微生物活性和數(shù)量，促進(jìn)消化吸收等功能。

黃連解毒散（Coptic chinensis antidote）是由黃連（Coptis Chinensis）、黃芩（Scutellaria Baicalensis）、黃柏（Cork）和梔子（Gardenia）四種成分組成，可解實(shí)熱火毒、三焦熱盛之證?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)其具有抗菌、抗?jié)?、解熱降壓、減少過氧化脂質(zhì)、增加腦血流量、保護(hù)胃黏膜、鎮(zhèn)靜和止血等作用，這為兩者的聯(lián)合應(yīng)用提供了科學(xué)的理論依據(jù)。

胃腸道是機(jī)體最大的免疫器官，也是機(jī)體營(yíng)養(yǎng)消化吸收主要場(chǎng)所，所以腸道菌群的平衡不僅能防御病原微生物的侵襲，保護(hù)機(jī)體不受外界微生物的損傷，同時(shí)還可以保護(hù)腸道結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，滿足機(jī)體營(yíng)養(yǎng)成分的供給。如果腸道菌群失衡，勢(shì)必造成腸道免疫機(jī)能下降，腸道結(jié)構(gòu)損傷，進(jìn)而造成機(jī)體免疫下降，引發(fā)一系列疾病，因此維護(hù)腸道菌群平衡，保護(hù)腸道結(jié)構(gòu)不受損傷，是避免或減少腸道疾病發(fā)生、促進(jìn)正常生長(zhǎng)發(fā)育、增強(qiáng)機(jī)體抗病能力的重要保障。

本試驗(yàn)利用黃連解毒散腸道菌群調(diào)節(jié)作用和黃腐酸免疫機(jī)能作用，將其有機(jī)聯(lián)合，旨在強(qiáng)化腸道菌群平衡，增強(qiáng)腸道消化酶活力，改善腸道pH值和腸道結(jié)構(gòu)，為保護(hù)腸道結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)腸道功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

黃腐酸（由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院制藥工程系提供）、黃連解毒散（黃連∶黃岑∶黃柏：梔子=3∶2∶2∶3）均購(gòu)自安國(guó)市場(chǎng)、雛雞飼料（徐水縣大午公司）、氨芐西林鈉（由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院制藥工程系提供）、BBL培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、EMB培養(yǎng)基、22.33 g/ml原碘液、0.089 g/ml稀碘液、3.320 g/l可溶性淀粉溶液、pH值6.0磷酸緩沖液、pH值7.5磷酸緩沖液、0.4 mol/l碳酸鈉溶液、0.4 mol/l的三氯醋酸液、0.5 mol/l的NaOH、10.00 mg/ml酪素溶液、100 μg/ml酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液、聚乙烯醇溶液、10 g/l酚酞指示液、Bouin氏固定液、二甲苯與石蠟混合液（1∶1）。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物及飼料

1日齡非免疫肉仔雞150只，購(gòu)自河北某孵化廠；肉雞配合料購(gòu)自河北某飼料廠。

1.1.3 主要儀器

恒溫水浴鍋（金壇市杰瑞爾電器有限公司）、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9240A型,上海飛越實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）、分光光度計(jì)（721型，上海光譜儀器有限公司制造）、臺(tái)式低速離心機(jī)（TD5A-WS型，賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司）、電子天平（上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 測(cè)定方法

1.2.1 動(dòng)物試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕ⅲㄒ姳?）

表1 試驗(yàn)動(dòng)物模型處理

選擇相同品種、品系、體重、健康狀態(tài)相近的雛雞共150只。采用雛雞飼養(yǎng)管理標(biāo)準(zhǔn)飼喂，每日9：00、15：00將藥物混入日糧中飼喂42 d。試驗(yàn)結(jié)束后，將雛雞斷椎處死，固定于解剖板上，常規(guī)消毒，取雛雞腸道1 g。于正式開始試驗(yàn)當(dāng)天、第3周末、第6周末清晨空腹稱體質(zhì)量，以重復(fù)為單位記錄2個(gè)階段的體增重，計(jì)算各期平均日增重。

平均日增重（ADG）=（末重-初重)）/試驗(yàn)天數(shù)。

1.2.2 腸道菌群統(tǒng)計(jì)

分別取各組相應(yīng)腸段的腸道，稱取1 g，放入試管中剪碎，加入9 ml無菌水，于渦旋振蕩器上200次/min振蕩15 min至腸道內(nèi)容物均質(zhì)化，此為10倍稀釋，即制成10-1溶液。依次分別稀釋成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7溶液，取80 μl溶液在相應(yīng)培養(yǎng)基上涂布，將乳酸桿菌及雙歧桿菌培養(yǎng)基于37℃厭氧培養(yǎng)24 h，大腸桿菌培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)24 h后分別統(tǒng)計(jì)各培養(yǎng)基菌落總數(shù)并記錄，菌落數(shù)量在30～300為宜，每個(gè)稀釋倍數(shù)重復(fù)3次，并按下列公式換算成每克內(nèi)容物所含菌落數(shù)，取其對(duì)數(shù)。

每克內(nèi)容物中菌落形成單位(CFU)＝同一稀釋度三次重復(fù)的平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×12.5。

1.2.3 腸道酶活力的測(cè)定

分別取各組相應(yīng)腸段的腸道，稱取1 g，放入試管中剪碎，加入9 ml無菌水，于離心機(jī)上3 000 r/min振蕩5 min，上清液即為待測(cè)酶液。

1.2.3.1 蛋白酶活力測(cè)定

①標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)表2配制的各種濃度酪氨酸溶液各取1.00 ml(需做平行)，分別加0.4 mol/l Na2CO3溶液5.00 ml，稀福林酚試劑1.00 ml，置(40±0.2)℃水浴中顯色20 min，以分光光度計(jì)在波長(zhǎng)660 nm測(cè)定OD值，比色，以不含酪氨酸的0管為空白管調(diào)零點(diǎn)，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，酪氨酸的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。此曲線應(yīng)是通過零點(diǎn)的直線，然后計(jì)算吸光常數(shù)K值[標(biāo)準(zhǔn)曲線中OD為1時(shí)的酪氨酸濃度(μg/ml)]，K值一般應(yīng)在95～100范圍內(nèi)。

表2 不同濃度的酪氨酸的配制

②樣品測(cè)定

蛋白酶活力的測(cè)定采用福林-酚法。37℃、每1 min水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸的酶量為1個(gè)酶活力單位。

1.2.3.2 脂肪酶活力的測(cè)定

脂肪酶活力的測(cè)定采用滴定法。37℃、脂肪酶水解脂肪每1 min產(chǎn)生1 μmol脂肪酸的酶量為1個(gè)活性單位。

1.2.3.3 淀粉酶活力的測(cè)定

淀粉酶活力的測(cè)定采用比色法。37℃、30 min水解10 mg淀粉的酶量為1個(gè)活性單位。

1.2.4 腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)

屠宰試驗(yàn)時(shí)，剖開腹腔，分離出十二指腸，在其中段截取1 cm左右的腸段，用生理鹽水輕輕沖洗腸段內(nèi)容物，放入準(zhǔn)備好的Bouins液中固定。固定好的腸段經(jīng)脫水，包埋制作石蠟切片，進(jìn)行HE染色。

切片制作完成后，在光學(xué)顯微鏡下觀察比較十二指腸腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的情況，并測(cè)量絨毛高度（游離于腸腔內(nèi)的部分，絨毛頂端至絨毛基部）、隱窩深度（腸腺底部至兩絨毛之間基部開口處的距離）和腸腺厚度（腸黏膜中的腺體）。

1.2.5 十二指腸pH值測(cè)定

取腸道內(nèi)容物，按1∶10比例加入去離子水稀釋，用小型振蕩器振蕩混合5 min，混合均勻后用PHS-3B型酸度計(jì)測(cè)定pH值。依次測(cè)定嗉囊、雞胗、十二指腸的pH值。

2 結(jié)果

2.1 黃腐酸聯(lián)合黃連解毒散對(duì)肉雞平均日增重的影響(見表3)

表3 不同組別的平均日增重變化（g）

由表3可知，1～21 d混合組Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3組之間平均日增重?zé)o顯著性差異（P＞0.05）；22～42 d，混合組Ⅰ與空白組相比平均日增重增加了20.89%（P＜0.01），混合組Ⅲ與空白組相比增加了20.03%（P＜0.01)。

2.2 黃腐酸聯(lián)合黃連解毒散對(duì)肉雞腸道內(nèi)菌群變化趨勢(shì)的影響

2.2.1 黃腐酸聯(lián)合黃連解毒散對(duì)肉雞腸道內(nèi)雙歧桿菌數(shù)變化的影響(見表4)

表4 雙歧桿菌數(shù)量的變化（lgCFU/g）

由表4可知，14 d混合組Ⅰ與空白組相比雙歧桿菌數(shù)量增加了7.97%；28 d時(shí)，黃腐酸組與空白組、中藥組、混合組Ⅰ、混合組Ⅱ相比雙歧桿菌數(shù)量分別增加 了 17.76%(P＜0.05)、13.58%(P＞0.05)、12.54%(P＞0.05)、10.84%(P＞0.05)。

2.2.2 黃腐酸聯(lián)合黃連解毒散對(duì)肉雞腸道內(nèi)乳酸桿菌數(shù)量變化的影響(見表5)

由表5可知，14 d混合組Ⅱ與空白組相比乳酸桿菌數(shù)量增加14.50%(P＜0.01)；28 d混合組Ⅲ與空白組、抗生素組、中藥組相比分別增加了11.76%(P＜0.05)、11.33%(P＜0.05)、10.47%(P＜0.05)；42 d混合組Ⅱ與空白組相比增加了6.83%(P＜0.05)。

表5 乳酸桿菌數(shù)量的變化（lgCFU/g）

2.2.3 黃腐酸聯(lián)合黃連解毒散對(duì)肉雞腸道內(nèi)大腸桿菌數(shù)變化的影響(見表6)

由表6可知，14 d中藥組與抗生素組相比，大腸桿菌的數(shù)量減少15.62%（P＜0.05）。42 d混合組Ⅲ與抗生素組、黃腐酸組、混合組Ⅰ相比，大腸桿菌數(shù)量分別降低18.84%（P＜0.05）、21.24%（P＜0.05）、20.79%（P＜0.05）。

表6 大腸桿菌數(shù)量的變化（lgCFU/g）

2.3 黃腐酸聯(lián)合黃連解毒散對(duì)肉雞腸道消化酶活力的影響

2.3.1 黃腐酸聯(lián)合黃連解毒散對(duì)肉雞蛋白酶活力變化趨勢(shì)的影響(見表7)

表7 蛋白酶活力的變化趨勢(shì)（U/ml）

由表7可知，28 d混合組Ⅰ與空白組、抗生素組相比，蛋白酶活力分別增加了64.12%（P＜0.01）、67.08%（P＜0.01）；42 d混合組Ⅰ與空白組、抗生素組、黃腐酸組、中藥組相比，蛋白酶活力分別增加了77.94%（P＜0.01）、102.70%（P＜0.01）、30.89%（P＜0.01）、41.51%（P＜0.01）；42 d混合組Ⅰ與混合組Ⅱ及混合組Ⅲ相比，蛋白酶活力分別升高18.95%（P＜0.01）、93.55%（P＜0.01）。

2.3.2 黃腐酸聯(lián)合黃連解毒散對(duì)肉雞脂肪酶活力趨勢(shì)的影響(見表8)

由表8可知，14 d混合組Ⅲ與空白組、抗生素組相比，脂肪酶活力分別提高了43.88%（P＜0.01）、53.85%（P＜0.01）；28 d，混合組Ⅲ與空白組、抗生素組相比，脂肪酶活力分別提高了30.86%（P＜0.01）、83.20%（P＜0.01）。

2.3.3 黃腐酸聯(lián)合黃連解毒散對(duì)肉雞淀粉酶活力變化的影響(見表9)

由表9可知，28 d混合組Ⅱ與空白組、抗生素組相比，淀粉酶活力分別增加了14.38%（P＜0.05）、11.89%（P＜0.05）；42 d，混合組Ⅱ與空白組、黃腐酸組相比，淀粉酶活力分別增加了15.23%（P＜0.05）、11.00%（P＜0.05）。

表8 脂肪酶活力的變化趨勢(shì)（U/g）

表9 淀粉酶活力的變化（U/dl）

2.4 黃腐酸聯(lián)合黃連解毒散對(duì)肉雞腸道黏膜結(jié)構(gòu)的影響(見表10)

由表10可知，42 d混合組Ⅰ與抗生素組、黃腐酸組、中藥組相比，腸絨毛高度分別提高了32.74%(P＜0.01)、16.21%(P＜0.01)、10.84%（P＜0.01）；混合組Ⅰ與混合組Ⅱ、混合組Ⅲ相比，腸絨毛高度分別提高了17.06%（P＜0.01）、18.55%（P＜0.01）。42 d混合組Ⅰ與空白組、抗生素組、黃腐酸組、中藥組相比，隱窩深度分 別 提 高 了 15.84%（P＜0.01）、13.21%（P＜0.01）、32.29%（P＜0.01）、33.85%（P＜0.01），混合組Ⅰ與混合組Ⅱ相比，隱窩深度升高32.14%（P＜0.01）。中藥組的腸絨毛高度與隱窩深度比值（V/C）與抗生素組相比，高41.48%（P＜0.01），混合組Ⅱ與混合組Ⅲ相比，V/C值升高33.06%（P＜0.01）。

表10 腸絨毛高度、隱窩深度的比較

2.5 黃腐酸聯(lián)合黃連解毒散對(duì)肉雞十二指腸pH值的影響(見表11)

表11 十二指腸pH值的比較

由表11可知，抗生素組、中藥組最接近中性pH值7.0?；旌辖MⅡ與空白組、抗生素組、中藥組相比，pH 值分別降低 5.19%（P＜0.05）、3.98%（P＜0.05）、4.52%（P＜0.05）。

3 討論

3.1 黃腐酸聯(lián)合黃連解毒散對(duì)肉雞平均日增重的影響

黃腐酸富含活性物質(zhì)，能夠促進(jìn)動(dòng)物體內(nèi)多種酶的活性和激素的釋放，并可減少病原菌毒素對(duì)家禽消化吸收的不良影響，使腸道正常菌群、pH值及各種酶的活性更加穩(wěn)定，有利于飼料養(yǎng)分的消化吸收。黃連解毒散具有抗菌、抗?jié)?、解熱降壓、減少過氧化脂質(zhì)、增加腦血流量、保護(hù)胃黏膜、鎮(zhèn)靜和止血等作用。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，黃腐酸聯(lián)合黃連解毒散對(duì)于提高肉雞生長(zhǎng)性能有明顯效果，22～42 d混合組相比空白組肉雞平均日增重有不同程度的提高，其原因可能在于黃腐酸聯(lián)合黃連解毒散的混合制劑中不僅能為肉雞生長(zhǎng)提供必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還能改善起生理代謝，促進(jìn)消化吸收，從而促進(jìn)了肉雞的生長(zhǎng)與發(fā)育。

3.2 黃腐酸聯(lián)合黃連解毒散對(duì)腸道菌群的影響

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，日糧中添加黃腐酸聯(lián)合黃連解毒散可提高乳酸桿菌數(shù)量，降低大腸桿菌的數(shù)量。乳酸菌和雙歧桿菌作為有益菌的代表，能促進(jìn)機(jī)體消化功能，提高雞的生長(zhǎng)性能；而大腸桿菌等有害菌則會(huì)減弱雞的生產(chǎn)表現(xiàn)。很多試驗(yàn)也表明，黃腐酸和黃連解毒散均可以增加雙歧桿菌和乳酸桿菌數(shù)量，降低大腸桿菌數(shù)量。

3.3 黃腐酸聯(lián)合黃連解毒散對(duì)腸道消化酶活力的影響

肉雞日糧中適量添加黃腐酸與黃連解毒散可提高肉雞小腸內(nèi)容物淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶等酶的活力，利于腸道營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收，提高了肉雞生長(zhǎng)性能。其中黃腐酸對(duì)于酶活力的提升作用較為明顯，優(yōu)于黃連解毒散，但二者聯(lián)合效果更佳，綜合考慮各組對(duì)三種酶活力提升效果，以混合組Ⅰ對(duì)于酶活的提升效果最好。

3.4 黃腐酸聯(lián)合黃連解毒散對(duì)腸道黏膜結(jié)構(gòu)的影響

小腸結(jié)構(gòu)與功能的正常是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被充分消化吸收的基本保證。絨毛高度與隱窩深度反映了腸道的功能狀況，其中絨毛高度與成熟細(xì)胞數(shù)量呈顯著相關(guān)，因此絨毛短時(shí)，成熟細(xì)胞少，養(yǎng)分吸收能力低；隱窩深度反映了細(xì)胞的生成率，隱窩變淺表明腸上皮細(xì)胞成熟率上升，分泌功能增強(qiáng)。V/C則綜合反映了小腸的功能狀態(tài)，比值下降，表示黏膜受損，消化吸收功能下降；比值升高，則黏膜改善，消化吸收功能增強(qiáng)，生長(zhǎng)加快。本試驗(yàn)中，混合組Ⅰ與抗生素組相比，腸絨毛高度極顯著增加。由此可見，黃腐酸聯(lián)合黃連解毒散有益于保護(hù)和增加腸絨毛高度、增加絨毛高度與隱窩深度的比值，進(jìn)而提高腸道對(duì)養(yǎng)分的吸收利用效率。

3.5 黃腐酸聯(lián)合黃連解毒散對(duì)腸道pH值的影響

黃腐酸是一種有機(jī)酸制劑，在消化道中可調(diào)節(jié)pH值。本試驗(yàn)顯示，黃腐酸組與混合組相對(duì)其他組pH值均有一定程度下降，可見黃腐酸具有調(diào)節(jié)消化道中pH值的功能；同時(shí)其具有起效快對(duì)生物機(jī)體無毒副作用的特點(diǎn)，在臨床中可以通過控制黃腐酸的加入量調(diào)節(jié)腸道pH值，抑制病原菌的生長(zhǎng)，提高消化酶的酶活力，對(duì)幼齡動(dòng)物早期斷乳后適應(yīng)植物性飼料、促進(jìn)消化和防止腹瀉,促進(jìn)生長(zhǎng)具有重要意義。

4 結(jié)論

通過以上試驗(yàn)證明，黃腐酸同黃連解毒散聯(lián)合使用，可促進(jìn)肉雞的生長(zhǎng)，提高肉雞腸道中有益菌的數(shù)量，平衡菌群比例，同時(shí)也在一定程度上提高了消化酶的活力，強(qiáng)化腸道結(jié)構(gòu)與功能，為黃腐酸與中藥的聯(lián)合應(yīng)用提供了一定的理論基礎(chǔ)。