■王冰冰 耿 爽 耿春銀 徐 暢 龐 喆 夏廣軍

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延吉133000)

膨化全脂大豆是大豆在高溫、高壓、高剪切力作用下的膨化產(chǎn)物，具有適口性好、油脂和營養(yǎng)利用率高等特點(diǎn)。經(jīng)過膨化加工后最大限度地保存了大豆中的脂肪，具有濃郁的油香味，大大地提高了家畜的采食量，其在養(yǎng)殖業(yè)中得到了廣泛的應(yīng)用。脂肪酸是脂肪的重要組成成分，按其飽和程度可分為飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸[1]。硬脂酰輔酶A去飽和酶(stearoy l-CoA desatu-rase,SCD)是合成單不飽和脂肪酸的限速酶，主要作用是在飽和脂肪酸第9和10碳原子間導(dǎo)入氫鍵，形成單不飽和脂肪酸，使牛肉富含更多有益人體健康的不飽和脂肪酸[2]。SCD作為催化飽和脂肪酸去飽和化的關(guān)鍵酶對牛脂肪組織中脂肪酸的組成以及肌肉間脂肪沉積有著重要影響[3-4]。SCD首選底物是棕櫚酰(C16∶0)和硬脂酰(C18∶0)，可分別將它們轉(zhuǎn)換為棕櫚油酰CoA(C16∶1)和油?；鵆oA(C18∶1)，trans-11異油酸(C18∶1)也能被SCD去飽和化為相應(yīng)的c9t11共軛亞油酸[5]。

延邊黃牛作為我國的優(yōu)良地方品種之一，其肉質(zhì)優(yōu)良，是不可多得的具有我國特色的肉牛品種。研究表明，日糧中添加膨化全脂大豆可以增加延邊黃牛牛肉中的脂肪沉積[6]。目前研究熱點(diǎn)為飼料的營養(yǎng)成分與牛肉脂肪酸含量和組成，而就脂肪酸合成相關(guān)基因與牛肉脂肪酸含量和組成相關(guān)性的研究甚少[7]。本研究通過在延邊黃牛育肥期飼喂膨化全脂大豆，探討SCD基因在延邊黃牛肝臟、肌肉、脂肪組織中的表達(dá)差異及其與肌肉脂肪酸組成的相關(guān)性，為通過飼料營養(yǎng)調(diào)控改善牛肉品質(zhì)提供了新的理論依據(jù)和方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

選取體重相近、健康無疾病、育肥后期的延邊黃牛閹牛8頭，采用單因子隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，將試驗(yàn)牛分為試驗(yàn)組和對照組，每組4頭，試驗(yàn)組用膨化全脂大豆粉替代對照組日糧中的豆粕。

1.1.2 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)用日糧及營養(yǎng)水平見表1。在整個(gè)試驗(yàn)過程中，試驗(yàn)動(dòng)物在同一牛舍中飼喂，自由采食，自由飲水，并按牛場的常規(guī)方法進(jìn)行管理。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA的提取

采用Trizol法提取總RNA。

表1 日糧組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干物質(zhì)）

1.2.2 反轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)

參考TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說明（盡量在低溫下操作）10 μl體系（見表2、表3）。

表2 反轉(zhuǎn)錄混合液

表3 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液

1.2.3 引物設(shè)計(jì)

利用 Premier Primer 5.0軟件，根據(jù)GenBank NM173959序列設(shè)計(jì)SCD基因熒光定量PCR引物，根據(jù)GenBank X00182的序列設(shè)計(jì)內(nèi)參基因GAPDH引物，引物序列及擴(kuò)增片段長度（見表4）。

1.2.4 熒光定量PCR試驗(yàn)

按照SYBR Premix Ex Taq?Ⅱ試劑盒說明書操作。熒光定量PCR總體系為20 μl，SYBR?Premix Ex TaqTM10 μl，上、下游引物（5 μmol/l）各 0.8 μl，模板 cDNA 2 μl，ddH2O 6.4 μl，每個(gè)樣本設(shè)兩個(gè)重復(fù)。熒光定量PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性1 min；95℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸34 s，共 40個(gè)循環(huán)[8]。

表4 熒光定量PCR特異性引物

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

根據(jù)熒光定量PCR檢測出的內(nèi)參基因和目的基因，采用2-ΔΔCT法計(jì)算SCD基因的相對表達(dá)量，ΔCt目的基因=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，Δ ΔCt= ΔCt試驗(yàn)組-ΔCt對照組。采用SPSS 18.0進(jìn)行方差分析和相關(guān)分析，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P＜0.05為結(jié)果差異顯著，P＜0.01為結(jié)果差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA提取與純化

應(yīng)用TRizol RNA提取法提取延邊黃牛背最長肌組織總RNA，經(jīng)超微量分光光度計(jì)檢測，A260/A280在1.9～2.1之間，由圖1可以看出，RNA分子條帶清晰、完整性好、無降解、無DNA污染，能滿足試驗(yàn)要求。

圖1 RNA完整性檢測結(jié)果

2.2 SCD基因表達(dá)量分析

表5 飼喂膨化全脂大豆對延邊黃牛不同組織SCD基因mRNA表達(dá)量的影響

由表5和圖2可知，飼喂膨化全脂大豆后，SCD基因在肌肉組織中的表達(dá)量，試驗(yàn)組極顯著高于對照組（P＜0.01），而在肝臟和脂肪組織中的表達(dá)量試驗(yàn)組低于對照組，但差異不顯著（P＞0.05）。

圖2 飼喂膨化全脂大豆對延邊黃牛不同組織SCD基因mRNA表達(dá)量的影響

2.3 肌肉組織中SCD mRNA表達(dá)量與脂肪酸組成相關(guān)性分析

表6 SCD基因在肌肉中的表達(dá)水平和脂肪酸含量的相關(guān)性分析

從表6可知，SCD基因雖在肝臟、脂肪、肌肉中均有表達(dá)，但SCD基因在肌肉中表達(dá)量最高。SCD作為催化飽和脂肪酸去飽和化的關(guān)鍵酶，在肌肉組織中的表達(dá)量與棕櫚油酸（C16∶1）、亞油酸（C18∶2）含量呈顯著正相關(guān)，與油酸（C18∶1）含量呈極顯著正相關(guān)。

3 討論

3.1 膨化全脂大豆對延邊黃牛SCD基因表達(dá)的影響

大豆經(jīng)膨化加工后具有特殊的香味，適口性好，同時(shí)膨化加工最大限度地保留了大豆中的脂肪，使膨化大豆的能量價(jià)值高于普通豆粕[6]。本研究結(jié)果表明，飼喂膨化全脂大豆后延邊黃牛肝臟、肌肉、脂肪組織中的SCD基因表達(dá)量均有不同變化，SCD基因在肌肉組織中的表達(dá)量，試驗(yàn)組極顯著高于對照組（P＜0.01），而在肝臟和脂肪組織中的表達(dá)量試驗(yàn)組低于對照組，但差異不顯著（P＞0.05）。卜登攀等（2006）[9]研究發(fā)現(xiàn)，在奶牛日糧添加豆油抑制了奶牛乳腺組織SCD基因mRNA的表達(dá)。王小靜等（2006）在泌乳山羊日糧中添加葵花油顯著降低了乳腺組織中SCD mRNA的表達(dá)水平[10]。Baumgard通過給奶牛真胃灌注trans-10，cis-12共軛亞油酸，使乳腺組織SCD酶基因表達(dá)顯著降低[8]。Nt?ambi證實(shí)給嚙齒動(dòng)物飼喂含有多不飽和脂肪酸的三酰甘油，能夠抑制肝臟SCD基因的表達(dá)[11]。陳雪君研究發(fā)現(xiàn)，在胡羊日糧中添加豆油或玉米油顯著抑制了皮下脂肪、肌肉和肝臟組織的SCD酶基因mRNA的表達(dá)[12]。本研究飼喂膨化全脂大豆使延邊黃牛肝臟、脂肪組織SCD基因表達(dá)量呈下降趨勢，與上述報(bào)道結(jié)果一致。而SCD基因在肌肉組織中的表達(dá)量極顯著提高，可能是由于本研究添加膨化全脂大豆無論是在SCD酶作用底物以及對SCD基因表達(dá)的抑制作用等與直接添加油脂不同，具體原因仍有待于進(jìn)一步的研究。

3.2 肌肉組織中SCD mRNA表達(dá)量與脂肪酸組成相關(guān)性分析

SCD酶在脂肪代謝中起著重要作用，是飽和脂肪酸生成單不飽和脂肪酸過程的關(guān)鍵的限速酶，影響著牛肉大理石花紋等級，脂肪柔軟度以及肉的風(fēng)味等[13]。SCD酶主要作用是在飽和脂肪酸第9和10碳原子間導(dǎo)入氫鍵，形成單不飽和脂肪酸，使牛肉更有益于健康[2]。單不飽和脂肪酸具有獨(dú)特的物理化學(xué)特性和特殊生理功能，單不飽和脂肪酸中最有益人體的脂肪酸——油酸(C18∶1)是一種天然物質(zhì)，在食品與醫(yī)藥工業(yè)中廣泛應(yīng)用[14]。研究證明不飽和脂肪酸可以降低一些疾病的發(fā)病幾率，如肥胖、心腦血管疾病，促進(jìn)視覺、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育[15]。

本研究結(jié)果表明，飼喂膨化全脂大豆后SCD基因在延邊黃牛肌肉組織中的表達(dá)量與棕櫚油酸（C16∶1）、亞油酸（C18∶2）含量呈顯著正相關(guān)，與油酸（C18∶1）含量呈極顯著正相關(guān)。反芻動(dòng)物脂肪酸組成受三方面因素影響，首先是日糧脂肪酸的瘤胃加氫，其次是從頭合成，第三是SCD酶的去飽和作用[16]。SCD酶能以棕櫚酰（C16∶0）和硬脂酰（C18∶0）為底物，在第9和10碳原子間引入雙鍵，形成相應(yīng)的單不飽和脂肪酸[17]。石恒波等在原代乳腺上皮細(xì)胞中通過腺病毒介導(dǎo)過表達(dá)了奶山羊SCD基因。與對照組相比，乳腺上皮細(xì)胞中過表達(dá)SCD基因?qū)е嘛柡椭舅嵯鄬Ρ壤陆担伙柡椭舅岷可?，總脂肪酸含量增加，不飽和脂肪酸比例升高，?xì)胞脂肪酸合成能力明顯增強(qiáng)。乳腺上皮細(xì)胞中棕櫚酸和硬脂酸占總脂肪酸含量的百分比下降，C16∶1和油酸占總脂肪酸含量的百分比升高[18]。本研究進(jìn)一步表明，SCD基因影響肌肉組織脂肪酸組成?？梢哉J(rèn)為飼喂膨化全脂大豆能夠提高延邊黃牛肌肉組織中SCD基因的表達(dá)量，進(jìn)而改變牛肉脂肪酸組成，提高牛肉中不飽和脂肪酸的含量。

4 結(jié)論

①飼喂膨化全脂大豆后增加了延邊黃牛肌肉組織中SCD基因的表達(dá)量，對肝臟和脂肪組織中的表達(dá)量影響不顯著。

②SCD基因在肌肉組織中的表達(dá)量與棕櫚油酸（C16∶1）、油酸（C18∶1）、亞油酸（C18∶2）含量呈顯著和極顯著正相關(guān)。在飼糧中用膨化全脂大豆代替豆粕，能改變牛肉脂肪酸組成，提高牛肉營養(yǎng)價(jià)值。