任陽(yáng)陽(yáng) 張夢(mèng)婷 張嘉麗,2 樊佳佳 張曉存 王 俊,2 劉 霞,2

(1 武漢理工大學(xué)化學(xué)化工與生命科學(xué)學(xué)院，武漢，430070； 2 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京，100700)

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蝦脊蘭屬植物DNA條形碼的確立

任陽(yáng)陽(yáng)1張夢(mèng)婷1張嘉麗1,2樊佳佳1張曉存1王 俊1,2劉 霞1,2

(1 武漢理工大學(xué)化學(xué)化工與生命科學(xué)學(xué)院，武漢，430070； 2 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京，100700)

目的：結(jié)合ITS2、psbA-trnH和matk序列對(duì)蘭科蝦脊蘭屬植物進(jìn)行物種區(qū)分鑒定研究，并確立能準(zhǔn)確鑒別蝦脊蘭屬植物的序列或者序列組合。方法：采用試劑盒法對(duì)已收集的6種蝦脊蘭屬植物進(jìn)行總DNA的提取，通過(guò)擴(kuò)增及測(cè)序，運(yùn)用codencodeV4.2軟件對(duì)所得序列進(jìn)行拼接與剪切，使用MEGA5.0對(duì)ITS2、psbA-trnH和matk序列3種序列分別進(jìn)行比對(duì)分析，計(jì)算種內(nèi)及種間Kimura 2-parameter(K2P)遺傳距離，構(gòu)建Neighbor-joining(NJ)系統(tǒng)聚類(lèi)樹(shù)。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)共得到序列56條(包含GenBank序列17條)，ITS2序列和matK序列其種內(nèi)最大遺傳距離小于種間最小遺傳距離，而該屬psbA-trnH序列種內(nèi)遺傳距離范圍和種間遺傳距離范圍有重合。結(jié)論：ITS2序列和matK序列可以作為蝦脊蘭屬部分植物的鑒定序列，而psbA-trnH序列不能用于蝦脊蘭屬植物的鑒定。

DNA條形碼；ITS2；psbA-trnH；matK；蝦脊蘭屬

蝦脊蘭屬(CalantheR.Br.)為蘭科地生草本植物，據(jù)《中國(guó)植物志》中記載，蝦脊蘭屬植物全屬約150種，分布于亞洲熱帶和亞熱帶地區(qū)、新幾內(nèi)亞島、澳大利亞、熱帶非洲以及中美洲等地。蝦脊蘭屬植物有“蘭中西施”的美稱(chēng)，可見(jiàn)其具有極高的觀賞價(jià)值，而該屬植物不僅外表絢麗還頗有藥用價(jià)值，在民間多做藥用，據(jù)文獻(xiàn)記載，蝦脊蘭屬植物具有活血止痛、清熱解毒等功效[1]，據(jù)報(bào)道，蝦脊蘭的酶水解產(chǎn)物為tryptanthrin，indirudin和isatin，這些水解產(chǎn)物在原植物中也存在，它們均具有抗白血病的作用。從蝦脊蘭乙醇提取物中可提取到1個(gè)具有抗菌活性的二氫菲；同時(shí)，在蝦脊蘭屬植物中還發(fā)現(xiàn)吲哚苷以及具有生理活性的生物堿，這些生物堿的存在使蝦脊蘭在傳統(tǒng)中藥中有抗炎、抗菌、抗毒素等作用[2]。然而蝦脊蘭屬植物分類(lèi)復(fù)雜，因?yàn)椴煌N類(lèi)植物特征性狀不明顯，所以給蝦脊蘭屬植物的鑒定帶來(lái)很大的困難，且蘭科植物也是生物多樣性保護(hù)的旗艦類(lèi)群之一，蝦脊蘭屬作為蘭科植物的一種，在中國(guó)物種紅色名錄第一卷將其全部物種列為珍惜瀕危物種[3]。因此，尋找一種快速有效鑒別蝦脊蘭屬植物的方法對(duì)于蝦脊蘭屬植物具有長(zhǎng)遠(yuǎn)意義。迄今為止，對(duì)于蝦脊蘭屬植物的鑒定研究較少，一般只有傳統(tǒng)的鑒別方法，而傳統(tǒng)的鑒別對(duì)于蝦脊蘭屬資源短缺現(xiàn)狀來(lái)說(shuō)是非常不利的。DNA條形碼技術(shù)為直接利用DNA序列進(jìn)行物種的鑒定,具有獨(dú)一無(wú)二的可重復(fù)性,為藥用植物鑒定帶來(lái)了新的機(jī)遇。

DNA條形碼是指生物體內(nèi)能夠代表該物種的，標(biāo)準(zhǔn)的、有足夠變異的、易擴(kuò)增且相對(duì)較短的DNA片段；DNA條形碼技術(shù)是2003年由加拿大動(dòng)物學(xué)家Hebert首次提出，即利用基因組中一段公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)短序列鑒定物種的分子診斷新技術(shù)[4-6]。其在生物分類(lèi)和鑒定方面發(fā)展迅速，它能夠不受本身性狀和外界因素影響，從基因水平上提供一種鑒別依據(jù)。該技術(shù)不需要形態(tài)分類(lèi)基礎(chǔ)，具有操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性高、樣品用量少等特點(diǎn)，因此該技術(shù)在生物物種鑒定與分類(lèi)、珍稀瀕危和貴重生物資源保護(hù)、海關(guān)貿(mào)易監(jiān)控、生物多樣性保護(hù)和中藥鑒定等領(lǐng)域得到廣泛運(yùn)用。尤其在中藥鑒定中，陳士林課題組通過(guò)大量樣本實(shí)驗(yàn)研究提出ITS2+psbA-trnH為主體的植物類(lèi)DNA條形碼鑒定體系[7-10]，該體系具有良好的準(zhǔn)確性與穩(wěn)定性，但對(duì)于少數(shù)中藥ITS2+psbA-trnH序列還不足以對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定，因此需要結(jié)合其他片段來(lái)進(jìn)行鑒定。matK序列是編碼成熟酶K蛋白的基因，是國(guó)際生物條形碼聯(lián)盟(CBOL)推薦的植物DNA條形碼核心序列[11-13]。我們利用3種不同的引物ITS2、psbA-trnH、matK對(duì)6種蝦脊蘭屬的植物進(jìn)行DNA提取、擴(kuò)增、測(cè)序通過(guò)比較其種間和種內(nèi)遺傳距離從而確立能鑒別蝦脊蘭屬植物的序列或者序列組合，為蝦脊蘭屬植物的鑒別提供準(zhǔn)確可靠的生物學(xué)方法，保障其用藥安全，同時(shí)也為保護(hù)蝦脊蘭屬瀕危藥用植物資源提供了新的鑒定技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料 6種蝦脊蘭屬植物：棒距蝦脊蘭(Calantheclavata)、腎唇蝦脊蘭(Calanthebrevicornu)、蝦脊蘭(Calanthediscolor)、劍葉蝦脊蘭(Calanthedavidii)、鉤距蝦脊蘭(Calanthegraciliflora)、三褶蝦脊蘭(Calanthetriplicata)分別來(lái)自利川、廣西、廣州等不同地區(qū)，共計(jì)25份樣品，材料信息詳表見(jiàn)表1。

1.2 方法

1.2.1 樣品DNA的提取 將實(shí)驗(yàn)樣品用75%乙醇擦拭表面后，稱(chēng)量每個(gè)樣品約20 mg，加入鋼珠，研磨粉碎。用DNA提取研磨儀(Retsch MM400，Germany)研磨2 min后，利用植物DNA提取試劑盒(Tiangen Biotech Co.，China)提取總DNA。

1.2.2 PCR擴(kuò)增及測(cè)序 PCR擴(kuò)增引物見(jiàn)表2。matK分析序列全部從GenBank上下載，其詳細(xì)信息見(jiàn)表3。PCR反應(yīng)體系為25，體系內(nèi)包含2×Tag PCR Mix 12.5(Tiangen Biotech公司，China)，引物(2.5/L)各1.0(TaKa Ra Biotech公司，China)，模板DNA2，雙蒸水8.5。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃ 4 min，(94 ℃ 30 s，55 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s)循環(huán)35次，72 ℃延伸10 min。將擴(kuò)增后的樣品使用ABI3730XL測(cè)序儀(Applied Biosystems Co，USA)進(jìn)行雙向測(cè)序。

表1 樣品信息表

表2 PCR擴(kuò)增引物

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 應(yīng)用CodonCode Aligner V4.2(CodonCode公司，USA)對(duì)測(cè)序峰圖進(jìn)行校對(duì)拼接，除去載體及引物區(qū)獲得相應(yīng)序列。利用MEGA5.0對(duì)所有序列進(jìn)行分析對(duì)比，并基于K2P模型對(duì)蝦脊蘭屬植物進(jìn)行種內(nèi)和種間遺傳距離分析，用鄰接(NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)聚類(lèi)樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蝦脊蘭屬植物不同序列種內(nèi)變異分析

2.1.1 蝦脊蘭屬植物ITS2序列種內(nèi)變異分析 棒距蝦脊蘭共6條序列，長(zhǎng)度263 bp。鉤距蝦脊蘭共3條序列，長(zhǎng)度為258 bp，無(wú)變異位點(diǎn)。劍葉蝦脊蘭共3條序列，長(zhǎng)度265 bp，無(wú)變異位點(diǎn)。腎唇蝦脊蘭共6條序列，長(zhǎng)度為258 bp，無(wú)變異位點(diǎn)。

表3 GenBank所下載序列

2.1.2 蝦脊蘭屬植物psbA-trnH序列種內(nèi)變異分析

棒距蝦脊蘭、鉤距蝦脊蘭、劍葉蝦脊蘭、腎唇蝦脊蘭、三褶蝦脊蘭、蝦脊蘭psbA序列長(zhǎng)度、種內(nèi)變異位點(diǎn)數(shù)等信息見(jiàn)表5。棒距蝦脊蘭共5條序列，長(zhǎng)度為746 bp，以LRGZ111-1為主導(dǎo)單倍型，在3位點(diǎn)存在A-C變異。鉤距蝦脊蘭共3條序列，長(zhǎng)度為780 bp，以GZ032-1為主導(dǎo)單倍型序列，存在20個(gè)種內(nèi)變異位點(diǎn)。劍葉蝦脊蘭共3條序列，長(zhǎng)度為683 bp，以LC1025-1為主導(dǎo)單倍型序列，存在12個(gè)種內(nèi)變異位點(diǎn)。腎唇蝦脊蘭共6條序列，長(zhǎng)度為858 bp，以LC922-1為主導(dǎo)單倍型序列，存在58個(gè)種內(nèi)變異位點(diǎn)。三褶蝦脊蘭共4條序列，長(zhǎng)度為598 bp，以GX1005-1為主導(dǎo)單倍型序列，在596位存在A-C變異、597位存在C-T變異。蝦脊蘭有來(lái)自GenBank的3條序列(序列號(hào)見(jiàn)表3)，長(zhǎng)度為757 bp，以KC704336為主導(dǎo)單倍型序列，存在33個(gè)種內(nèi)變異位點(diǎn)。

2.1.3 蝦脊蘭屬植物matK序列種內(nèi)變異分析 此處所用的matK序列全部從GenBank上下載得到(序列號(hào)見(jiàn)表3)，棒距蝦脊蘭共2條序列，長(zhǎng)度為1 662 bp，以KF67379為主導(dǎo)單倍型，存在6個(gè)種內(nèi)變異位點(diǎn)。鉤距蝦脊蘭共3條序列，長(zhǎng)度為1 690 bp，以KF673800為主導(dǎo)單倍型序列，在481位點(diǎn)存在A-G變異。劍葉蝦脊蘭共3條序列，長(zhǎng)度為1 692 bp，以KF673796為主導(dǎo)單倍型序列，存在8個(gè)種內(nèi)變異位點(diǎn)。三褶蝦脊蘭共3條序列，長(zhǎng)度為1 690 bp，以KF673822為主導(dǎo)單倍型序列，存在101個(gè)種內(nèi)變異位點(diǎn)。蝦脊蘭共2條序列，長(zhǎng)度為666 bp，無(wú)變異位點(diǎn)。

2.2 蝦脊蘭屬植物不同序列種間變異分析 棒距蝦脊蘭、鉤距蝦脊蘭、劍葉蝦脊蘭、腎唇蝦脊蘭、三褶蝦脊蘭、蝦脊蘭3種不同序列長(zhǎng)度范圍、種間變異位點(diǎn)數(shù)等信息見(jiàn)表4。

表4 蝦脊蘭屬種間不同序列特征

2.3 蝦脊蘭屬植物不同序列種內(nèi)、種間遺傳距離分析 基于K2P遺傳距離，對(duì)蝦脊蘭屬3條不同的DNA條形碼候選序列的種內(nèi)變異和種間變異結(jié)果進(jìn)行分析。見(jiàn)表5。蝦脊蘭屬I(mǎi)TS2序列種間變異(0.032～0.166)大于其種內(nèi)遺傳距離(0)，但是鉤距蝦脊蘭和腎唇蝦脊蘭其種間遺傳距離過(guò)小，表示此2種植物利用ITS2序列不能分開(kāi)，但是通過(guò)分析其matK種間距離結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過(guò)matK序列是可以將其分開(kāi)。蝦脊蘭屬matK序列種間變異(0.009～0.430)大于其種內(nèi)遺傳距離(0～0.004)，但是蝦脊蘭和棒距蝦脊蘭以及蝦脊蘭和劍葉蝦脊蘭遺傳距離過(guò)小表示2種植物利用matK序列不能分開(kāi)，但是通過(guò)分析其ITS2種間距離結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過(guò)ITS2序列是可以將其分開(kāi)。因此，綜上所述，ITS2序列和matK序列可以作為鑒別蝦脊蘭屬植物分子鑒定的序列組合。蝦脊蘭屬psbA-trnH序列種間遺傳距離(0.002～0.148)和種內(nèi)遺傳距離(0～0.055)有重疊區(qū)，所以psbA-trnH序列不適用于蝦脊蘭屬植物的鑒定。

表5 蝦脊蘭屬不同基因序列種內(nèi)和種間K2P遺傳距離匯總

注：*：平均值

2.4 蝦脊蘭屬植物不同序列的NJ樹(shù)的建立

2.4.1 本研究基于ITS2序列構(gòu)建蝦脊蘭屬各個(gè)種間的NJ樹(shù)(圖1)結(jié)果表明，除了鉤距蝦脊蘭和腎唇蝦脊蘭被分在一枝，其他各個(gè)種都能通過(guò)ITS2序列被很好的區(qū)分開(kāi)來(lái)。

圖1 基于ITS2序列構(gòu)建蝦脊蘭屬各個(gè)種間的NJ樹(shù)

注：Bootstrap1000次重復(fù)，支上數(shù)值僅顯示自展支持率≥50%。

圖2 基于matK序列構(gòu)建蝦脊蘭屬各個(gè)種間的NJ樹(shù)

注：Bootstrap1000次重復(fù)，支上數(shù)值僅顯示自展支持率≥50%。

2.4.2本研究基于matK序列構(gòu)建蝦脊蘭屬各個(gè)種間的NJ樹(shù)(圖2)結(jié)果表明除了鉤距蝦脊蘭和腎唇蝦脊蘭外其他物種都能通過(guò)matK序列被很好的區(qū)分開(kāi)。但是在前面種間遺傳距離的分析中得知，鉤距蝦脊蘭和腎唇蝦脊蘭種間遺傳距離是大于其種內(nèi)遺傳距離的，而在NJ樹(shù)上其卻合為一枝，但是腎唇蝦脊蘭的matK序列網(wǎng)上只有一條，所以在此并不具有說(shuō)服力，綜上可以得出，將matK序列作為ITS2序列的互補(bǔ)序列用來(lái)鑒別蝦脊蘭屬植物，其鑒別效率具有很高參考價(jià)值。

2.4.3本研究基于psbA-trnH序列構(gòu)建蝦脊蘭屬各個(gè)種間的NJ樹(shù)(圖3)結(jié)果表明，大多數(shù)蝦脊蘭屬植物的psbA-trnH NJ樹(shù)都匯到一起，其分離效率很差，所以psbA-trnH序列不適用于蝦脊蘭屬植物的鑒定。

圖3 基于psbA-trnH序列構(gòu)建蝦脊蘭屬各個(gè)種間的NJ樹(shù)

注：Bootstrap1000次重復(fù)，支上數(shù)值僅顯示自展支持率≥50%。

3 結(jié)論

近年來(lái)，DNA條形碼技術(shù)在生物分類(lèi)和鑒定方面發(fā)展迅速，它能夠不受本身性狀和外界因素影響，從基因水平上提供一種鑒別依據(jù)。我們?cè)诒疚氖峭ㄟ^(guò)對(duì)蝦脊蘭屬6個(gè)樣品3種不同DNA序列進(jìn)行對(duì)比分析，從而確定能鑒定蝦脊蘭屬植物的序列或序列組合，為保證其用藥安全以及保護(hù)瀕危物種提供一種快速簡(jiǎn)便的鑒定方法。

本研究收集了來(lái)自廣州、廣西、利川等地的6個(gè)蝦脊蘭屬樣品，選用ITS2序列、psbA-trnH序列和matK序列，對(duì)其變異位點(diǎn)進(jìn)行分析，應(yīng)用基于K2P計(jì)算的遺傳距離分別對(duì)3種序列的種內(nèi)和種間距離進(jìn)行比較分析結(jié)果表明，ITS2序列和matK序列其種內(nèi)遺傳距離小于種間遺傳距離，可以將其作為基因組序列用于蝦脊蘭屬植物的鑒定，而psbA-trnH序列種內(nèi)遺傳距離范圍和種間遺傳距離范圍有重合，所以psbA-trnH序列不能用作蝦脊蘭屬植物的鑒定。之后利用3種片段分別構(gòu)建NJ樹(shù)可以看出，ITS2和matK序列除了鉤距蝦脊蘭和腎唇蝦脊蘭聚為一枝外，其他各個(gè)物種都能很明顯的區(qū)別開(kāi)來(lái)，表現(xiàn)出很好的單系性，而腎唇蝦脊蘭的matK序列只有網(wǎng)上一條，在此并不能否定matK序列對(duì)蝦脊蘭屬植物的鑒定效率，所以利用ITS2+matK基因組序列能夠?qū)ξr脊蘭屬植物進(jìn)行快速鑒別。而psbA-trnH序列NJ樹(shù)的表明，蝦脊蘭屬大部分植物不能被區(qū)分，其鑒定準(zhǔn)確率太低，不適于蝦脊蘭屬植物的鑒定。

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(2016-03-31收稿 責(zé)任編輯：洪志強(qiáng))

Establishment of DNA barcode for the calanthe

Ren Yangyang1,Zhang Mengting1,Zhang Jiali1,2,Fan Jiajia1,Zhang Xiaocun1,Wang Jun1,2,Liu Xia1,2

(1SchoolofChemistry,ChemicalEngineeringandLifeSciences,WuhanUniversityofTechnology,Wuhan430070,China; 2ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,InstituteofChineseMateriaMedica,Beijing100700,China)

Objective:Combined with the ITS2 and psbA-trnH and matK sequence to identify the medicinal plant-calanthe，and establish genus sequences which can accurately identify the calanthe.Methods:Extracting total DNA from 6 species of calanthe，which had been collected by the kit method，Then the sequences were amplified and sequenced，Using codencodeV4.2 software to of splic and shear the sequences，Comparing of all sequences of 6 species of the genus using MEGA5.0 software,The variable sites,the Kimura 2-Paramter(K2P)genetic distances and the Neighbor-joining(NJ)phylogenetic tree were computed by MEGA5.0.Results:56 sequences(including 17 GenBank sequences)were obtained f.By analysis，ITS2 sequence and matK sequence of the intraspecific genetic distance is less than the inter species genetic distance，the intraspecific genetic distance and inter species genetic distance of psbA-trnH sequence was coincident.Conclusion:ITS2 sequence and matK sequence can be used as the identification sequence of the partial plants of the calanthe,however psbA-trnH sequence could not be used for the identification of the calanthe.

DNA barcode; ITS2；psbA-trnH；matK；Calanthe

國(guó)家重大科技專(zhuān)項(xiàng)子課題“中藥新藥安全性檢測(cè)技術(shù)與標(biāo)準(zhǔn)研究”——中藥原料藥混偽品分子基因鑒定技術(shù)與標(biāo)準(zhǔn)(編號(hào)：2014ZX09304-307-001-020)

任陽(yáng)陽(yáng)(1992.09—)，女，碩士研究生，研究方向：中藥資源鑒定

劉霞(1973.02—)，女，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要研究方向：中藥資源與鑒定，E-mail:lrx1125@126.com

R282.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.11.058