陳 奔 黃金蘭 郭茜茜 馮曉桃 郭爾楚 張晟瑞 陳文雅 何育爐 鐘振國

(1 廣西中醫(yī)藥大學廣西中醫(yī)藥科學實驗中心，南寧，530001； 2 徐州醫(yī)科大學藥學院，徐州，221004； 3 廣西中醫(yī)藥大學新藥研究開發(fā)中心，南寧，530001)

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不同劑量角叉菜膠誘導血瘀證樹鼩模型的研究

陳 奔1黃金蘭2郭茜茜3馮曉桃1郭爾楚3張晟瑞3陳文雅3何育爐3鐘振國3

(1 廣西中醫(yī)藥大學廣西中醫(yī)藥科學實驗中心，南寧，530001； 2 徐州醫(yī)科大學藥學院，徐州，221004； 3 廣西中醫(yī)藥大學新藥研究開發(fā)中心，南寧，530001)

目的：通過對不同劑量的角叉菜膠誘導建立血瘀證樹鼩模型表征及血液學觀察，探索由角叉菜膠誘導的血瘀證樹鼩模型的最佳劑量。方法：32只樹鼩隨機分為對照組、低劑量組(25 mg/kg)、中劑量組(50 mg/kg)、高劑量組(75 mg/kg)，8只/組，腹腔注射角叉菜膠3 d，造模24 h后肉眼結(jié)合體征采集分析系統(tǒng)定性定量觀察表征，全自動血流變快測儀檢測血液流變學指標，全自動凝血分析儀檢測凝血4項。結(jié)果：造模24 h后，造模動物精神萎靡、舌底脈絡增粗增長，隨著劑量增加，固定性疼痛概率增多、舌質(zhì)、爪部和鼻唇部皮膚顏色變深變暗。血液流變學指標中，高劑量組全血黏度、紅細胞壓積、紅細胞聚集指數(shù)、卡松屈服應力和血漿黏度明顯升高(P<0.05或P<0.01)，紅細胞電泳時間顯著延長(P<0.01)，而紅細胞變形指數(shù)降低(P<0.01)；中、高劑量組的APTT、PT、TT明顯降低(P<0.05或P<0.01)，而FIB含量增加(P<0.01)。結(jié)論：高劑量的角叉菜膠所誘導的血瘀樹鼩模型成立。

角叉菜膠；血瘀證；樹鼩模型

血瘀證動物模型是研究血瘀證生物學基礎的重要技術(shù)平臺，目前主要采用家兔、大鼠和小鼠來建立各種血瘀證型動物模型。盡管學者們在各型血瘀證候模型研究上做了大量探索性工作，但證候動物模型是否能真正或更接近表達人體證候的表現(xiàn)特征仍需加以關(guān)注。樹鼩是一種外形酷似松鼠的小型哺乳動物，基因分析揭示，樹鼩在免疫及神經(jīng)系統(tǒng)等方面與人類具有較為高度的同源性，在很多方面具有可用來替代獼猴等大型靈長類實驗動物的遺傳基礎[1]，樹鼩正在成為一種新型主流實驗動物用于免疫學、神經(jīng)生物學及代謝等生物學問題和疾病機制研究。然而，在中醫(yī)證型方面，應用樹鼩作為證候模型的研究還處于空白狀態(tài)，是否能夠采用樹鼩模擬中醫(yī)證型也就成為了感興趣的話題。本研究以樹鼩為實驗對象，腹腔注射不同劑量的角叉菜膠，通過觀察分析藥后樹鼩所呈現(xiàn)表征與血液相關(guān)指標的變化，探索由角叉菜膠誘導的血瘀證樹鼩模型的最佳劑量。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組與模型制備 10～12個月齡中緬樹鼩滇西亞種32只，雄性，體重120～140 g，由昆明醫(yī)科大學實驗動物學部提供，動物質(zhì)量合格證號：SCXK(滇)K2013-0002。32只樹鼩隨機分為4組：對照組、低劑量組(25 mg/kg)、中劑量組(50 mg/kg)、高劑量組(75 mg/kg)，8只/組。藥物組按設定劑量腹腔注射角叉菜膠3 d，對照組腹腔注射等體積生理鹽水。

1.2 主要試劑及預處理 精確稱取角叉菜膠(Sigma公司，批號：CAS9000-07-1)156.25 mg(低劑量)、312.5 mg(中劑量)、468.75 mg(高劑量)3份，分別溶于煮沸的25 mL雙蒸水中，攪拌至均勻膠狀，室溫冷卻，冰箱冷藏，使用前沸水浴加熱至均勻膠狀。

1.3 主要儀器 體征采集分析系統(tǒng)2010(廣西中醫(yī)藥大學定制，重慶森特科技開發(fā)2010版，型號：M003-110415)；明澈凈水系統(tǒng)(默克理博實驗室設備(上海)有限公司，型號：ZRQSV24CN)；電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司，型號：EL204)；富士T205數(shù)碼相機(1400萬像素，日本富士公司)；冷光源拍攝箱(保麗多攝影器材有限公司)；全自動血流變快測儀(重慶維多科技有限公司，F(xiàn)ASCO系列-2050A)；全自動凝血分析儀(日本希森美康株式會社，型號：Sysmex CA-7000)；高速冷凍離心機(Thermo Fisher Scientific公司，型號：41289651)。

1.4 表征采集 造模結(jié)束24 h后，從精神狀態(tài)，固定性疼痛(抓取有無疼痛抵抗，即網(wǎng)兜罩其上方時，身體翻轉(zhuǎn)，脊背貼地面，四肢朝上，呈躺姿)，舌底、足爪、鼻唇部皮膚顏色(動物置冷光源拍攝箱，固定光源，在相同角度對舌底、足爪、鼻唇部拍照，照片輸入體征分析軟件進行RGB值分析(即RGB色彩模式是一種顏色分析的標準，計算某一圖像區(qū)域R(紅色值)、G(綠色值)、B(藍色值)三分量值，并統(tǒng)計分析R/(R+G+B)、G/(R+G+B)、B/(R+G+B)百分比值的差異)[2]，對樹鼩宏觀表征進行量化觀察比較。

1.5 血液流變學檢測 造模后24 h，動物麻醉，腹主動脈取血5 mL，肝素抗凝，全自動血液流變學快測儀檢測各組樹鼩全血黏度、紅細胞壓積、紅細胞變形指數(shù)、紅細胞電泳時間、紅細胞聚集指數(shù)、卡松黏度、卡松屈服應力、紅細胞沉降率、血漿黏度及纖維蛋白原的變化。

1.6 凝血檢測 造模后24 h腹主動脈取血2 mL，將血液樣本與抗凝劑以一定比例混勻，室溫下以1006.2×g離心10 min，取血漿上清液檢測活化部分凝血活酶時間(APTT)、血漿凝血酶原時間(PT)、凝血酶時間(TT)和血漿纖維蛋白原(FIB)。

1.7 統(tǒng)計學方法 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行處理，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，數(shù)據(jù)采用方差分析和多重比較，P<0.05示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 樹鼩表征觀察 與對照組比較，模型組樹鼩出現(xiàn)明顯“血瘀”表征，表現(xiàn)為自主活動減少、反應遲鈍，皮毛蓬松豎立無光澤，精神萎靡蜷縮，頭部深埋腹部及前肢，呈“抱頭”姿勢，對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組“抱頭”概率依次分別為0%、12.5%、25%和62.5%。舌質(zhì)顏色發(fā)紺、舌底脈絡增粗增長、爪部皮膚紫黑，鼻唇黑藍(圖1)。此外，造模組樹鼩均出現(xiàn)了不同程度的抓捕抵抗，對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組“抓捕抵抗”概率分別為0%、12.5%、62.5%和87.5%。

圖1 各組樹鼩舌底、足爪和鼻唇部皮膚顏色比較

注：A：對照組;B:低劑量組;C:中劑量組;D:高劑量組。

舌底、足爪、鼻唇部皮膚顏色RGB值定量分析：從表1數(shù)據(jù)看出，低劑量組、中劑量組和高劑量組的舌底R%明顯降低(P<0.01)，G%和B%明顯升高(P<0.01)；低劑量組的足爪R%明顯降低(P<0.01)，G%與B%有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義，中劑量組和高劑量組的R%明顯降低(P<0.01)，G%與B%明顯升高(P<0.01)；低、中、高劑量組的鼻唇部皮膚R%明顯降低(P<0.01)，G%與B%明顯升高(P<0.01)，結(jié)果表明隨著藥物劑量增加，舌底顏色由正常的肉紅色向紫色轉(zhuǎn)變，足爪顏色由正常的紅棕色向紫黑色轉(zhuǎn)變，鼻唇部皮膚顏色由正常的肉紅色向深紫色轉(zhuǎn)變。

表1 各組舌底、足爪、鼻唇部皮膚RGB平均值的比較

注:與對照組比較*P<0.05，**P<0.01。

2.2 血液流變學的改變 與對照組比較，高劑量組的全血黏度(高、中、低切)顯著升高(P<0.05或P<0.01)，而低劑量組和中劑量組的全血黏度(高、中、低切)差異無統(tǒng)計學意義；高劑量組紅細胞壓積、紅細胞聚集指數(shù)、卡松屈服應力和血漿黏度均明顯升高(P<0.05或P<0.01)、紅細胞電泳時間顯著延長(P<0.01)，而紅細胞變形指數(shù)降低(P<0.01)。見表2～表4。

表2 每組不同切變率下的全血黏度值的比較

注:與對照組比較*P<0.05，**P<0.01。

2.3 凝血檢測 各組樹鼩血液凝血四項的變化見表5。數(shù)據(jù)顯示，與對照組比較，中、高劑量組的APTT、PT、TT明顯降低(P<0.05或P<0.01)，而FIB含量增加(P<0.01)；低劑量組的各項指標差異無統(tǒng)計學意義。

表3 各組紅細胞壓積、紅細胞變形指數(shù)、紅細胞電泳時間、紅細胞聚集指數(shù)的比較

注:與對照組比較*P<0.05。

表4 各組卡松黏度、卡松屈服應力、紅細胞沉降率、血漿黏度值比較

注:與對照組比較*P<0.05，**P<0.01。

表5 各組樹鼩血液凝血四項的比較

注:與對照組比較*P<0.05，**P<0.01。

3 討論

血瘀證是指人體內(nèi)血行不暢、壅阻血脈或血溢脈外、停積為瘀的證候，既往主要是根據(jù)中醫(yī)病因和西醫(yī)病理而建立動物模型。熱毒血瘀證動物模型就是以中醫(yī)病因建立的一種，通過注射內(nèi)毒素或綠膿桿菌可誘導出該模型，也有文獻發(fā)現(xiàn)，脂多糖與角叉菜膠聯(lián)合[3]，干酵母與角叉菜膠聯(lián)合均可誘導瘀熱互結(jié)證模型大鼠[4]，此外，單用角叉菜膠也可引起小鼠尾部血管血瘀模型[5]，本研究單獨采用角叉菜膠誘導血瘀樹鼩模型，尋求最佳給藥劑量。

本研究以杜金行等[6]《血瘀證中西醫(yī)結(jié)合診療指南(修訂稿)》為依據(jù)，結(jié)合樹鼩自身多毛，橄灰色的個體特征，從活動、精神狀態(tài)、固定性疼痛，舌底、足爪、鼻唇部皮膚顏色對樹鼩宏觀表征進行觀察。結(jié)果表明，造模后動物自主活動減少、反應遲鈍；皮毛蓬松豎立無光澤；精神萎靡蜷縮，“抱頭”概率隨劑量增加而增多；舌質(zhì)顏色發(fā)紺、舌底脈絡增粗增長；爪部和鼻唇部皮膚紫黑色；有固定性疼痛，“抓捕抵抗”概率亦隨劑量增加而增多。

顏色光學理論的發(fā)展和測色系統(tǒng)的開發(fā)，為色診客觀化研究提供了可能。目前客觀化研究的顏色模型有Lab模式[7]、RGB模式[8-9]等。本研究采用杜正彩等[2]開發(fā)的“中醫(yī)實驗動物證候表征采集分析系統(tǒng)”，結(jié)合計算機圖像分析技術(shù)，對樹鼩舌底、足爪、鼻唇部皮膚表征指標進行量化(即采用RGB值分離組合測量，通過對體表R(紅)、G(綠)、B(藍)值的分析，反映體表顏色的變化規(guī)律)。實驗結(jié)果表明，隨著劑量的增加，舌底R%逐漸降低，G%和B%逐漸上升，舌底顏色由正常的肉紅色向紫色轉(zhuǎn)變；足爪皮膚和鼻唇部皮膚的R%逐漸下降，G%和B%逐漸上升，足爪顏色由肉紅色向紫黑色轉(zhuǎn)變，鼻唇部皮膚顏色由肉紅色向深紫色轉(zhuǎn)變，這與肉眼所觀察到的現(xiàn)象是一致的。從表征角度上看，高劑量組角叉菜膠所誘導的血瘀樹鼩模型更符合要求。

血液流變學的異常是血瘀證的重要病理基礎之一，大多數(shù)血瘀證可導致血液濃、黏、聚、凝狀態(tài)，通過對血液流變學指標的檢測，可反應血液的流動性和粘滯性以及血液中紅細胞和血小板的聚集性、變形性等。郭淑貞[10]等以血液流變學及超聲評價小型豬冠心病血瘀證模型，趙玲[11]等也從血液流變學的改變分析腎上腺素致大鼠血瘀證的建立，李路丹[12]等以血糖值及血液流變學作為指標研究鬼箭羽對2型糖尿病血瘀證大鼠的影響。血液流變學已普遍作為血瘀證研究的重要指標。研究結(jié)果顯示，高劑量組的全血黏度、紅細胞壓積、紅細胞聚集指數(shù)、卡松屈服應力和血漿黏度均明顯升高(P<0.05或P<0.01)，紅細胞電泳時間顯著延長(P<0.01)，而紅細胞變形指數(shù)降低(P<0.01)，提示高劑量組血液呈高黏、濃稠的狀態(tài)。

凝血四項歸屬于血栓性疾病檢查，亦可作為檢測血瘀證高凝狀態(tài)的生化指標。從實驗結(jié)果我們看出，中、高劑量組的APTT、PT、TT明顯降低(P<0.05或P<0.01)，而FIB含量增加(P<0.01)；低劑量組的各項指標差異無統(tǒng)計學意義，提示中、高劑量組血液的呈高凝狀態(tài)。

綜合上述研究結(jié)果，我們認為高劑量的角叉菜膠75 mg/(kg·d)連續(xù)3 d腹腔注射所誘導的血瘀樹鼩模型更符合中醫(yī)血瘀的要求，本研究將為建立角叉菜膠復制血瘀證樹鼩模型的方法和條件以及今后藥物干預機制的研究提供了實驗依據(jù)。

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(2016-10-17收稿 責任編輯：洪志強)

Study on Tree Shrews Model of Blood Stasis Induced by Different Dose of Carrageen Glue

Chen Ben1, Huang Jinlan2, Guo Xixi3, Feng Xiaotiao1, Guo Erchu3, Zhang Shengrui3, Chen Wenya3, He Yulu3, Zhong Zhenguo3

(1ScienceExperimentCenter,GuangxiUniversityofChineseMedicine，Nanning530001,China; 2DepartmentofPharmacology,XuzhouMedicalUniversity,Xuzhou221004，China; 3CenterofResearch&DevelopmentofNewDrugs,GuangxiUniversityofChineseMedicine，Nanning530001，China)

Objective:To explore the optimum dose in tree shrews model of blood stasis syndrome induced by carrageen glue via observation of representation and hemorheology parameters of tree shrews. Methods: A total of 32 tree shrews were randomly divided into 4 groups: control group, low-dose group (25 mg/kg), middle-dose group (50 mg/kg) and high-dose group(75 mg/kg). Eight tree shrews in each group. The drug groups were intraperitoneal injected with carrageen glue for 3 days. The representation was observed by perusal and signs of collection and analysis system, hemodynamic indexes were detected by hemorrheology fast measuring instrument. The results of activated thromboplatintime(APTT), prothrombin time(PT), thrombin time(TT) and Fibrinogen(FIB) were measured using automated coagulation analyzer. Results: The tree shrews in drug groups were in low spirits. Tongue vein were of enlargement of growth. The Regular probability pain increased and the colors of the tongue, claw and naso-labial area became darker with the dose increasing. Hemorheology results showed that in high-dose group, the whole blood viscosity, packed cell volume, red cell assembling index, casson yield stress and plasma viscosity increased (P<0.05 orP<0.01), erythrocyte electrophoresis time prolonged (P<0.01), but the RBC deformability index decreased (P<0.01). Compared to the other two groups, the APTT, PT and TT in high-dose group remarkably decreased (P<0.05 orP<0.01), but FIB increased (P<0.01). Conclusion: The model of blood stasis syndrome was successfully built in tree shrews with high-dose carrageen glue.

Carrageen glue; Model of blood stasis syndrome; Tree shrews

廣西科學研究與技術(shù)開發(fā)計劃項目(編號：桂科攻1347003-1)；廣西重點實驗室建設項目(編號：15-140-31、14-045-12、13-051-06)；廣西農(nóng)作物廢棄物功能成分研究協(xié)同創(chuàng)新中心建設(編號：CICAR2015-Z1)

陳奔，碩士，助教，研究方向：新藥研究與開發(fā)，E-mail：935527242@qq.com

鐘振國，醫(yī)學博士，教授，博士、碩士研究生導師，E-mail：gxtcmuzzg@163.com

R228

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.11.004