提高飲用水“兩蟲”檢測回收率的方法探討
——Filta-Max xpress快速法

金幼平 徐 飛 紹興市水環(huán)境科學(xué)研究院有限公司

本文對免疫磁分離熒光抗體法測定水中隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲過程中3個關(guān)鍵步驟——濃縮、分離和染色過程的加標(biāo)回收率情況分別進(jìn)行比對試驗，對如何提高飲用水中“兩蟲”檢測回收率提出合理化建議。

隱孢子蟲；賈第鞭毛蟲；免疫熒光；回收率

隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲（簡稱“兩蟲”）是嚴(yán)重危害水質(zhì)安全的病原性原生動物，由于其對于通常的氯消毒過程具有較強抗性，因此《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》（GB 5749-2006）中首次將“兩蟲”檢測項目列入其中。由于方法的特殊性，標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定兩蟲檢測回收率合格標(biāo)準(zhǔn)最低僅為10%。為掌握檢測要點，切實提高檢測技能，對“兩蟲”檢測過程中的關(guān)鍵步驟進(jìn)行分步加標(biāo)回收率測試，對影響回收率的因素進(jìn)行探討，并提出穩(wěn)定和提高回收率的合理化建議。

1 材料與方法

1.1 材料

環(huán)城河水，含0.1%活性炭水樣；G-C質(zhì)控標(biāo)樣、免疫磁分離試劑盒（Dynal）；免疫熒光試劑盒（Waterborme）；Fiha-Max xpress快速 淘 洗 設(shè) 備；Hettich Rotanta 460離心機。

1.2 試驗方法

按照《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法微生物指標(biāo)》（GB/T 5750.12-2006）[1]中5.1.4.1.2的方法，分別對離心、掏洗、酸化分離步驟的分步回收情況進(jìn)行測試。

①用高濁度水樣（環(huán)城河水、活性炭混懸液）代替洗脫液測定Hettich Rotanta 460離心機離心效果，并對離心后抽取的上清液進(jìn)行二次離心。②將G-C質(zhì)控樣直接加入到裝有450 mL淘洗緩沖液的離心管中進(jìn)行加標(biāo)回收率的測定。③對加標(biāo)水樣的過濾模塊連續(xù)淘洗兩次，分別測定兩次淘洗的回收率。④測定免疫磁分離階段加酸分離時兩次加酸的分步回收率。⑤測定整個免疫磁分離階段的回收率。⑥測試染色時間對檢測值的影響。

2 試驗結(jié)果

2.1 離心機離心效果的評價

無制動減速后沉淀物在離心管中的分布情況如圖1、圖2所示。離心后沉淀物多集中在離心管的錐形部分，但河水離心后沉淀基本集中在錐尖部分（圖2）而活性炭混懸液的大量沉淀均勻貼在整個錐形部分（圖1）。因此，在檢測過程中為最大限度地避免對管壁沉淀物的擾動，在吸取上清液時，應(yīng)把真空吸液裝置的吸液管管尖盡可能放在離心管的中心部位，不應(yīng)貼到管壁上。

圖1 活性炭混懸液

圖2 環(huán)城河水

二次離心的回收率見表1。從檢測數(shù)據(jù)看，一次離心已能達(dá)到加標(biāo)回收率的要求（10%～100%），增加離心次數(shù)一定程度上能提高回收率，但同時直接成本將提高50%左右。實際工作中必要時建議適當(dāng)增加離心時間，以達(dá)到提升離心效果的目的。

將G-C質(zhì)控標(biāo)樣直接加入到離心管中，測得的隱孢子蟲卵囊和賈第鞭毛蟲孢囊的回收率分別為0%、3%，遠(yuǎn)低于平均加標(biāo)回收率。具體原因不明確，不排除雜質(zhì)過少不利于卵囊和孢囊沉降的可能性。

2.2 壓力淘洗裝置洗脫效果的考證

二次淘洗的檢測結(jié)果見表2。從檢測數(shù)據(jù)看，二次淘洗的效果與二次離心的情況類似。另外，由于該步驟基本是按照設(shè)定程序由儀器自動操作完成的，因此，在回收率能夠滿足標(biāo)準(zhǔn)要求的情況下，不建議輕易改動內(nèi)置參數(shù)。

2.3 免疫磁分離階段影響因素的觀察

2.3.1 酸解離效果的觀察

自來水加標(biāo)樣品免疫磁分離階段兩次酸解的回收率測定結(jié)果見表3。結(jié)果表明，一次酸解分離不能確保分離效果，尤其是賈第鞭毛蟲，第二次加酸回收率遠(yuǎn)高于第二次，可見為提高和穩(wěn)定回收率，樣本進(jìn)行二次加酸分離很有必要。

2.3.2 免疫磁分離過程加標(biāo)回收率的測定

將G-C質(zhì)控標(biāo)樣直接加入到裝有10 mL緩沖液的L形管中，進(jìn)行回收率的測定，測得隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲的分步回收率分別為70%；79%，基本能滿足回收率的要求。

2.4 染色時間對鏡檢效果的影響

對一個由典型加標(biāo)樣本處理后獲得的井形玻片進(jìn)行FITC染色時，控制不同的濕室孵化時間，第一次為37℃、30 min；鏡檢后，37 ℃繼續(xù)染色40 min，再次鏡檢，比較兩次鏡檢的情況，可以明顯感覺到延長染色時間后，卵囊和孢囊的熒光強度均有不同程度的增加，且外形特征更加典型（圖3，圖4），且計數(shù)結(jié)果有了細(xì)微的增加，特別是質(zhì)控標(biāo)樣保存時間偏長時效果更為明顯。

表1 加標(biāo)樣二次離心檢測結(jié)果

表2 加標(biāo)樣兩次淘洗檢測結(jié)果

表3 加標(biāo)樣兩次酸解檢測結(jié)果

3 結(jié)論

圖3 藍(lán)色濾光片

圖4 紫外濾光片

分步試驗結(jié)果及實際檢測經(jīng)驗表明，在熟悉操作技能的基礎(chǔ)上，通過采取一些措施并注意操作要點將有利于提高和穩(wěn)定兩蟲檢測的回收率，包括：①適當(dāng)延長淘洗液的離心時間，并且在吸取上清液時盡量把真空吸液裝置的吸液管管尖放在離心管的中心部位，避免被管壁上偶然堆積的細(xì)小沉淀物的干擾。②在免疫磁分離階段采用兩次酸解分離。從節(jié)約檢測成本角度考慮，可把兩次酸解獲得的酸解液加到同一個井形玻片中進(jìn)行計數(shù)。③在對樣品進(jìn)行FITC染色時，可適當(dāng)延長濕室孵化的時間。經(jīng)驗表明，采用37 ℃，60 min或更長一些的時間，更有利于觀察和提高回收率，尤其是對于保存時間偏長的質(zhì)控樣效果更加明顯。

[1]中華人民共和國衛(wèi)生部.生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法 微生物指標(biāo)(GB 5750.12-2006)[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2006.