盧孟召 王世偉 徐濟(jì)責(zé)

(吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，吉林省·吉林市，132101) (長(zhǎng)白山動(dòng)植物資源利用與保護(hù)吉林省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

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野生大孔多孔菌的分離鑒定及生物學(xué)特性1)

盧孟召 王世偉 徐濟(jì)責(zé)

(吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，吉林省·吉林市，132101) (長(zhǎng)白山動(dòng)植物資源利用與保護(hù)吉林省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

為充分開(kāi)發(fā)利用大孔多孔菌資源，通過(guò)對(duì)左家保護(hù)區(qū)的野生大孔多孔菌進(jìn)行傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)鑒定相結(jié)合的方法，并對(duì)其菌絲體的生物學(xué)特性從pH值、單色光(晝夜交替)、氮源、無(wú)機(jī)鹽、碳源、溫度等影響因素進(jìn)行了單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)。系統(tǒng)研究結(jié)果表明：該種與大孔多孔菌相似度100%；菌絲體最適培養(yǎng)條件在藍(lán)光(晝夜交替)、30 ℃下培養(yǎng)，最適無(wú)機(jī)鹽為硫酸鎂、最適氮源為牛肉膏、最適碳源為淀粉、pH為5.0。

白腐菌；ITS鑒定；形態(tài)學(xué)鑒定

Journal of Northeast Forestry University，2016,44(12)：76-79.

For the exploitation and utilization the resource ofPolyporusalveoaris, traditional morphological and molecular biological method were used to identify the wildP.alveoariswhich was collected from Zuojia Protection Zone. The biological characteristics of its vegetative mycelium was investigated by single factor test and orthogonal test, including the optimal pH, light, nitrogen source, inorganic salt, carbon source and temperature. The results showed that this wild strain 100% similarity as recordsP.alveoaris. The optimal growth conditions are blue light (day and night alternating), 30 ℃, MgSO4as inorganic salt, beef extract as the nitrogen source, starch as the carbon source, and pH of 5.

大孔多孔菌[Polyporusalveolaris(DC.:Fr.) Bond. & Sing.]隸屬擔(dān)子菌亞門(mén)(Basidiomycotina)、層菌綱(Hymenomycetes)、非褶菌目(Aphyllophorales)、多孔菌科(Polyporaceae)、多孔菌屬(Polyporus)。引起木材白色腐朽[1-2]是一種重要的森林病原真菌[3]。但其子實(shí)體內(nèi)含有的多糖、多肽類等物質(zhì)具有一定的抗細(xì)菌生長(zhǎng)能力。Wang H et al[4]，從大孔多孔菌子實(shí)體中提取一種新型抗真菌多肽(alveolarin)，對(duì)灰葡萄孢菌、尖孢鐮刀菌、花生球腔菌等的菌絲生長(zhǎng)表現(xiàn)出抑制作用。郭永霞等[5]，研究表明大孔多孔菌的抗真菌蛋白alveolarin由兩個(gè)分子量為14 kDa的亞基組成。Barrasa et al[6]，發(fā)現(xiàn)大孔多孔菌對(duì)染料具有一定的脫色作用。當(dāng)前關(guān)于大孔多孔菌的相關(guān)研究所材料均為其子實(shí)體，其子實(shí)體主要來(lái)源為野外采集，但此方式獲取的生物量難以滿足更多科學(xué)研究需要。且關(guān)于大孔多孔菌菌絲體相關(guān)研究又欠缺。因此，本研究從大孔多孔菌菌絲體的生物學(xué)特性及其鑒定等相關(guān)方面開(kāi)展研究，為其森林病害的防治、子實(shí)體的栽培馴化、菌絲體的充分開(kāi)發(fā)和利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為探索大孔多孔菌的遺傳多樣性及真菌區(qū)系多樣性研究提供參考。

1 材料與方法

供試菌株采集于左家自然保護(hù)區(qū)(菌株編號(hào)為4659)。

PDA加富培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨4 g，磷酸二氫鉀3 g，硫酸鎂1.5 g，純凈水1 000 mL，pH自然。

子實(shí)體形態(tài)鑒定與菌種制備：根據(jù)采集到的子實(shí)體，進(jìn)行宏觀和微觀形態(tài)學(xué)特征描述與鑒定。菌種制備采用組織分離法，得到的純菌種在恒溫培養(yǎng)箱中25 ℃培養(yǎng)至5 d后，4 ℃保藏備用。

菌絲體DNA的提?。翰捎迷噭┖?艾德萊生物科技有限公司)提取菌絲體DNA。

ITS片段的PCR擴(kuò)增：PCR擴(kuò)增的引物為ITS1:5′TCCGTAGGTGAACCTGCGC3′和ITS4:5′TCCTCCGCTTATTGATATGC3′[7]。50 μL反應(yīng)體系，模板10 μL，ITS1引物(10 μmol/L)1 μL，ITS4引物(10 μmol/L)1 μL，10×PCR緩沖液(10 mmol/L)5 μL，Taq聚合酶(5 U/μL)0.5 μL，dNTP 1 μL，剩余體積用ddH2O補(bǔ)足。PCR反應(yīng)參數(shù)為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，53 ℃退火1 min,72 ℃延伸30 s，45個(gè)循環(huán),后延伸72 ℃ 10 min反應(yīng)結(jié)束后取PCR產(chǎn)物5 μL，通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

ITS序列測(cè)定：PCR產(chǎn)物純化后送北京華大基因完成測(cè)序。

構(gòu)建發(fā)育樹(shù)：測(cè)序結(jié)果于GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast比對(duì)，選取代表性序列做進(jìn)一步分析，用MEGA5.0進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，并以鄰接法(neighbor-joining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[8]。

pH試驗(yàn)：用1 mol/L的HCL和1 mol/L的NaOH調(diào)PDA加富培養(yǎng)基的pH值分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 5個(gè)處理。無(wú)菌條件下接種5 mm直徑的菌餅，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)；25 ℃避光培養(yǎng)，觀察并記錄菌絲長(zhǎng)勢(shì)、粗壯程度、疏密程度、菌落邊緣整齊度、菌落顏色等。培養(yǎng)7 d后，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。運(yùn)用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

單色光試驗(yàn)(晝夜交替)：用白光、紫光、藍(lán)光、黃光、紅光、綠光作為單色光因素。接種、培養(yǎng)條件、觀測(cè)指標(biāo)同pH試驗(yàn)。

氮源試驗(yàn)：用蛋白胨、牛肉膏、酵母浸膏、尿素、硝酸銨五種氮源，等量代替PDA加富培養(yǎng)基中的蛋白胨。接種、培養(yǎng)條件、觀測(cè)指標(biāo)同pH試驗(yàn)。

無(wú)機(jī)鹽試驗(yàn)：用硫酸鎂、硫酸錳、硫酸鐵、硫酸銅、硫酸鈣五種無(wú)機(jī)鹽，等量代替PDA加富培養(yǎng)基中的硫酸鎂。接種、培養(yǎng)條件、觀測(cè)指標(biāo)同pH試驗(yàn)。

碳源試驗(yàn)：供試碳源選取葡萄糖、麥芽糖、果糖、蔗糖、玉米粉、淀粉、乳糖7種，等量代替PDA加富培養(yǎng)基中的葡萄糖。接種、培養(yǎng)條件、觀測(cè)指標(biāo)同pH試驗(yàn)。

溫度試驗(yàn)：分別設(shè)置15、20、25、30、35 ℃ 5個(gè)溫度處理培養(yǎng)大孔多孔菌菌絲體。接種、觀測(cè)指標(biāo)同pH試驗(yàn)。

正交試驗(yàn)：在以上6個(gè)試驗(yàn)之后，進(jìn)行六因素兩水平正交試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)L8(26)如表1，篩選pH、單色光(晝夜交替)、氮源、無(wú)機(jī)鹽、碳源、溫度的最優(yōu)組合。

表1 最優(yōu)培養(yǎng)基組合篩選正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2 結(jié)果及分析

2.1 子實(shí)體宏觀和微觀形態(tài)特征描述與鑒定

柄偏生或短側(cè)生，韌肉質(zhì)。菌蓋腎形、扇形、略圓形或近漏斗形，近基部往往下凹，直徑3～6 cm，厚2.5～10.0 mm，表面有纖毛組成的小鱗片，無(wú)環(huán)紋或有不明顯的環(huán)紋；邊緣薄，有時(shí)內(nèi)卷。菌肉近白色，后變淺黃色，土黃色，干后硬而脆，厚1～4 mm。菌管近白色或淺黃色，長(zhǎng)2～5 mm?？酌媾c菌管同色；管口菱形，輻射狀排列，長(zhǎng)1～5 mm，寬0.5～1.5 mm，管口緣有時(shí)呈鋸齒狀。菌柄短小，顏色與菌管相似，質(zhì)地同菌蓋，長(zhǎng)0.5～7.5 cm，粗0.5～1.0 cm。擔(dān)孢子圓柱形，透明，平滑，(8～11)μm×(2.4～4.0)μm。如圖1。

A、B.4659菌株生態(tài)照；C.4659菌絲；D.4659孢子；E.4659擔(dān)子。

2.2 分子鑒定

電泳結(jié)果：凝膠成像儀觀察4659菌株電泳結(jié)果(如圖2)。

圖2 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜(1.4659菌株P(guān)CR產(chǎn)物；M.Marker)

系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)：進(jìn)行序列比對(duì)后，構(gòu)建發(fā)育樹(shù)。如圖3。經(jīng)典的形態(tài)學(xué)鑒定與分子水平鑒定結(jié)合，最終菌株4659鑒定為大孔多孔菌(Polyporusalveoaris)。

2.3 pH對(duì)大孔多孔菌菌絲體生長(zhǎng)的影響

pH對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響如表2。菌絲體在pH值為5.0～9.0均能生長(zhǎng)，酸性環(huán)境下菌絲體的長(zhǎng)勢(shì)較好，在pH值為5.0時(shí)，菌絲體的生長(zhǎng)狀態(tài)最佳，日均長(zhǎng)速達(dá)7.106 4 mm。當(dāng)pH值大于5.0，菌絲體的日均長(zhǎng)速有減弱的趨勢(shì)，并且菌絲體的粗壯度有明顯的變化。因此，菌絲體在pH值為5.0～9.0的培養(yǎng)基中，最適生長(zhǎng)pH值在5.0左右。分析其原因可能與大孔多孔菌的生長(zhǎng)環(huán)境有關(guān)。

圖3 基于rDNA-ITS的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

pH值菌絲粗壯度顏色邊緣整齊度氣生菌絲疏密程度長(zhǎng)勢(shì)日均長(zhǎng)勢(shì)/mm5．0+++乳白色整 齊+++++7．1064a6．0+++乳白色不整齊++++6．3872a7．0++乳白色整 齊++4．0227c8．0++乳白色整 齊+++5．3392b9．0++乳白色不整齊++4．3384c

注：+++ 粗壯、長(zhǎng)勢(shì)良好；++ 較粗壯、長(zhǎng)勢(shì)較好；+密、長(zhǎng)勢(shì)好；同列不同小字母表示差異顯著。

2.4 單色光對(duì)大孔多孔菌菌絲體生長(zhǎng)的影響(晝夜交替)

單色光對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響如表3。菌絲體對(duì)單色光的利用具有較顯著差異。菌絲體在不同單色光作用下的效果也有所不同。其中在紅光作用下，菌絲體的綜合指標(biāo)較好，日均長(zhǎng)速達(dá)9.040 0 mm；藍(lán)光、紫光次之；綠光、黃光對(duì)菌絲體表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用。試驗(yàn)表明，部分單色光對(duì)菌絲體具有一定的刺激作用，其中紅光(晝夜交替)為最佳。

表3 大孔多孔菌菌絲體在不同單色光下的生長(zhǎng)狀況(晝夜交替)

單色光菌絲粗壯度顏色邊緣整齊度氣生菌絲疏密程度長(zhǎng)勢(shì)日均長(zhǎng)勢(shì)/mm紫光++白 色整齊+++1．3000bc藍(lán)光++灰白色整齊+++1．6125b紅光++乳白色整齊+++++9．0400a綠光------黃光------

注：+++ 粗壯、長(zhǎng)勢(shì)良好；++ 較粗壯、長(zhǎng)勢(shì)較好；+密、長(zhǎng)勢(shì)好；同列不同小字母表示差異顯著。

2.5 氮源對(duì)大孔多孔菌菌絲體長(zhǎng)的影響

氮源對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響如表4。大孔多孔菌除尿素外的其他4種氮源下均能生長(zhǎng)。酵母浸膏為氮源時(shí)，長(zhǎng)勢(shì)良好，日均長(zhǎng)速達(dá)8.501 1 mm，優(yōu)于牛肉膏，硝酸銨次之，之后為蛋白胨。其中酵母浸膏、牛肉膏為氮源時(shí)，菌落顏色呈乳白色，菌落邊緣整齊。蛋白胨、硝酸銨為氮源時(shí)，菌落顏色呈白色，菌落邊緣不整齊。綜合認(rèn)為供試菌菌絲體的最適生長(zhǎng)氮源為酵母浸液，其次是牛肉膏。

表4 大孔多孔菌菌絲體在不同氮源下的生長(zhǎng)狀況

注：+++ 粗壯、長(zhǎng)勢(shì)良好；++較粗壯、長(zhǎng)勢(shì)較好；+密、長(zhǎng)勢(shì)好；-不生長(zhǎng)；同列不同小字母表示差異顯著。

2.6 無(wú)機(jī)鹽對(duì)大孔多孔菌菌絲體生長(zhǎng)的影響

無(wú)機(jī)鹽對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響如表5。在不同無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基上菌絲體生長(zhǎng)速度具有顯著性差異。最適無(wú)機(jī)鹽為硫酸鐵，日均長(zhǎng)速可達(dá)2.286 7 mm。其中硫酸鐵、硫酸鎂、硫酸錳對(duì)菌絲體的長(zhǎng)勢(shì)均有利，菌落邊緣整齊，菌絲粗壯，顏色為乳白色。而硫酸銅、硫酸鈣對(duì)菌絲的作用不顯著，且菌落邊緣不整齊，菌絲纖細(xì)。

表5 大孔多孔菌菌絲體在不同無(wú)機(jī)鹽下的生長(zhǎng)狀況

注：+++ 粗壯、長(zhǎng)勢(shì)良好；++濃密、長(zhǎng)勢(shì)較好；+纖細(xì)、密、長(zhǎng)勢(shì)好；同列不同小字母表示差異顯著。

2.7 碳源對(duì)大孔多孔菌菌絲體生長(zhǎng)的影響

碳源對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響如表6。由表可知菌絲體在以蔗糖為碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)迅速，長(zhǎng)勢(shì)最好，日均長(zhǎng)速達(dá)8.630 0 mm。菌絲體對(duì)單糖沒(méi)有較強(qiáng)的選擇性，而在乳糖為碳源的培養(yǎng)基上菌絲稀疏、纖弱、不整齊，抑制菌絲體的生長(zhǎng)。

表6 大孔多孔菌菌絲體在不同碳源下的生長(zhǎng)狀況

注：+++ 粗壯、長(zhǎng)勢(shì)良好;++ 壯、長(zhǎng)勢(shì)較好；+濃密、長(zhǎng)勢(shì)好；-密；同列不同小字母表示差異顯著。

2.8 溫度對(duì)大孔多孔菌菌絲體生長(zhǎng)的影響

溫度對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響如表7。菌絲體在以下溫度下均能生長(zhǎng)，當(dāng)溫度在30 ℃時(shí)，生長(zhǎng)速度達(dá)到最大，之后隨著溫度的上升，菌絲體的生長(zhǎng)速度逐漸減弱。菌絲體的最適生長(zhǎng)溫度在30 ℃，當(dāng)溫度為30 ℃時(shí)，菌絲體日均長(zhǎng)速為6.715 2 mm,長(zhǎng)勢(shì)較好。

表7 大孔多孔菌菌絲體在不同溫度下的生長(zhǎng)狀況

注：+++ 粗壯、長(zhǎng)勢(shì)良好;++ 較粗壯、濃密、長(zhǎng)勢(shì)較好；+密、長(zhǎng)勢(shì)好；同列不同小字母表示差異顯著。

2.9 正交試驗(yàn)分析

正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析表明，對(duì)大孔多孔菌菌絲體生長(zhǎng)的影響因素由大到小順序?yàn)閱紊?、氮源、無(wú)機(jī)鹽、溫度、pH、碳源，通過(guò)正交試驗(yàn)極差分析可知：氮源對(duì)菌絲體生長(zhǎng)影響最大，單色光對(duì)菌絲體生長(zhǎng)最小。菌絲體生長(zhǎng)的最優(yōu)組合為：藍(lán)光(晝夜交替)、牛肉膏、硫酸鎂、30 ℃、pH=5.0、淀粉。

3 結(jié)論與討論

對(duì)大孔多孔菌生物學(xué)特性的研究得出以下結(jié)論：該菌株的菌絲生體長(zhǎng)最適pH為5.0，大孔多孔菌和多數(shù)大型真菌一樣喜歡中性偏酸環(huán)境下生長(zhǎng)；大孔多孔菌菌絲體生長(zhǎng)階段最適單色光質(zhì)為紅光晝夜交替，與朱崢等[9]對(duì)左家保護(hù)區(qū)的野生紫丁香蘑生物學(xué)特性研究和朱堅(jiān)等[10]的不同顏色薄膜套袋對(duì)金針菇生長(zhǎng)發(fā)育的影響相一致，紅色光質(zhì)對(duì)，在誘導(dǎo)子實(shí)體發(fā)生階段。關(guān)于紅光在大型真菌菌絲體生長(zhǎng)中的促生機(jī)制有待于深入研究；大孔多孔菌菌絲體生長(zhǎng)最適氮源為酵母浸膏，在尿素作為氮源的培養(yǎng)基上我不能生長(zhǎng)或萌發(fā)初期即菌絲枯黃萎縮等情況，分析幾種氮源在被微生物利用的分子水平上發(fā)現(xiàn)：尿素在高溫條件下即超過(guò)60 ℃既可以發(fā)生水解，且隨溫度升高，水解更加劇烈，本研究培養(yǎng)基滅菌條件為121 ℃，20 min。在此條件下尿素會(huì)快速水解為NH3和CO2，且NH3又極易溶于水，而釋放出大量OH-而使整個(gè)基質(zhì)呈弱堿性，而不利于菌絲體生長(zhǎng)。在無(wú)機(jī)鹽利用上，大孔多孔菌菌絲體和其他大型真菌相似在硫酸鎂和硫酸鐵的利用上更優(yōu)于其他無(wú)機(jī)鹽，關(guān)于這方面的結(jié)論在朱崢等[9]等諸多文獻(xiàn)均以Mg2+作為酶的活性中心而進(jìn)行分析。大多數(shù)大型真菌在碳源選擇上以葡萄糖為最優(yōu)，但在本研究中蔗糖為大孔多孔菌的最佳碳源。根據(jù)溫度試驗(yàn)研究結(jié)果顯示30 ℃條件下大孔多孔菌的菌絲體長(zhǎng)勢(shì)最優(yōu)，長(zhǎng)速最快，通過(guò)分析該菌株采集時(shí)間及氣候條件分析，確定大孔多孔菌的溫型為中高溫型。

綜合以上研究，大孔多孔菌菌絲體在30 ℃時(shí)生長(zhǎng)最快，因此，在北方野生大孔多孔菌大都發(fā)生在夏季；且與多數(shù)大型真菌一樣適合在中性偏酸環(huán)境下生長(zhǎng)；給予藍(lán)光刺激有利于菌絲體的生長(zhǎng)。通過(guò)正交試驗(yàn)，確定最優(yōu)組合，為其森林防護(hù)、子實(shí)體的栽培馴化、菌絲體的充分開(kāi)發(fā)和利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為探索大孔多孔菌的遺傳多樣性及真菌區(qū)系多樣性研究提供參考。

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WildPolyporusalveolarisSeparate Isolation and Identification of Biological Characteristics

Lu Mengzhao, Wang Shiwei

(Jilin Agriculture Technology and Science College, Jilin 132101, P. R. China)； Xu Jize(Key Labratory of Changbai Mountain Animal and Plant Rescources' Utilization and Protection of Univer)

White rot fungi; Internal transcript spacer (ITS) identification; Morphological identification

1)吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院微生物重點(diǎn)學(xué)科資助項(xiàng)目；吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目(吉農(nóng)合字(2015)第039號(hào))；吉林省釀造技術(shù)科技創(chuàng)新中心項(xiàng)目；國(guó)家級(jí)大學(xué)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目(201611439017)；吉林省大學(xué)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目(吉農(nóng)合字(2016)第050號(hào))。

盧孟召，男，1995年9月生，吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院生物工程學(xué)院，本科生。E-mail：1134674900@qq.com。

徐濟(jì)責(zé)，吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院生物工程學(xué)院，講師；長(zhǎng)白山動(dòng)植物資源利用與保護(hù)吉林省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，講師；吉林省釀造技術(shù)科技創(chuàng)新中心，講師。E-mail：xujize@163.com。

2016年4月20日。

S646.2；Q934.1

責(zé)任編輯：潘 華。