李 晶 徐洪玉 吳振濤

·論著·

XIAP和caspase-9在尖銳濕疣組織中的表達

李 晶1徐洪玉1吳振濤2

目的： 檢測XIAP和caspase-9在CA組織中的表達。方法： 采用免疫組化方法分別檢測72例CA組織和20例正常包皮組織中XIAP和caspase-9蛋白的表達。結(jié)果： CA組織中XIAP蛋白的陽性表達率(56.94%)高于對照組(15.00%)，其差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而caspase-9蛋白的陽性表達率(37.50%)較對照組(70.00%)低，其差別亦有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。兩種蛋白在CA組織中的表達呈負相關(guān)(r=-0.83，P<0.05)。結(jié)論： XIAP抑制caspase-9的活性和表達，兩者共同參與CA的發(fā)病過程。

尖銳濕疣； XIAP； caspase-9； 凋亡

尖銳濕疣(Condyloma Acuminatum, CA)是由人乳頭瘤病毒(Human Papilloma virus, HPV)感染引起的一種慢性良性增殖性疾病，臨床上易反復(fù)發(fā)作，平均復(fù)發(fā)率高達40%[1]。角質(zhì)形成細胞感染HPV后失去正常凋亡的功能，CA的發(fā)病和復(fù)發(fā)與此密切相關(guān)。其生物學(xué)行為類似良性腫瘤。Caspase家族的激活是細胞凋亡過程中的中心環(huán)節(jié)，X連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein, XIAP)是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein, IAP)家族中抑制凋亡最有力的成員，可直接結(jié)合并抑制凋亡起始因子caspase-9，caspase-9是線粒體凋亡通路中重要的啟動者，可激活其下游的效應(yīng)caspase，從而啟動細胞死亡程序[2,3]。目前，有關(guān)XIAP 、caspase-9與CA的關(guān)系國內(nèi)外報道鮮見。本研究采用免疫組化方法檢測CA皮損中XIAP和caspase-9的表達，初步探討其在CA發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 資料及分組 72例CA標本均來源于2014年6月至2015年4月山東省交通醫(yī)院性病門診就診患者，皮損位于外生殖器部位?；颊呔鶠槌醮伟l(fā)病，就診前未做任何治療，無系統(tǒng)性疾病史，不合并有其他外生殖器疾病或性病。其中男42例，女30例，年齡20～45歲，平均年齡27.6歲，病程0.5～6個月，平均2.3個月。臨床表現(xiàn)典型，醋酸白試驗陽性，組織病理證實為CA(圖1)。20例包皮標本作為對照組，取自我院泌尿外科行包皮環(huán)切術(shù)者，患者系健康男性，既往無CA等外生殖器疾病，經(jīng)組織病理學(xué)檢查證實為正常上皮。

1.2 試劑 兔抗人XIAP多克隆抗體、兔抗人caspase-9多克隆抗體及SV超敏兩步法免疫組化試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 免疫組織化學(xué)染色 所有標本均連續(xù)切片3張，切片厚度4 μm，2張用于免疫組化研究，1張行HE染色，進行組織病理確診。免疫組化操作均嚴格按照說明書步驟進行。用已知陽性標本做陽性對照，PBS代替一抗做空白對照(圖2)。

1.4 結(jié)果判定標準 XIAP蛋白陽性染色定位于細胞漿或細胞膜，caspase-9蛋白陽性染色定位于細胞漿或細胞核。細胞陽性表達強度按照以下方法進行半定量分析：①按細胞著色強度：淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；②按陽性細胞百分比：≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，≥76%為4分，兩者分值的乘積即為細胞陽性表達強度，其分級方法為：0分為陰性(-)，1～4分為弱陽性(+)，6～8分為陽性(++)，9～12分為強陽性(+++)，采用單盲法，每張切片任選兩個皮片，每個皮片隨機選取表皮層5個高倍(400倍)視野進行評分，取其得分的平均數(shù)作為該標本分值，將(+)-(+++)歸為陽性表達組計算陽性率[4]。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 運用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，不同組間陽性率比較用Fisher確切概率法，兩蛋白表達的相關(guān)性采用Spearman非參數(shù)相關(guān)分析，檢驗水準a=0.05。

2 結(jié)果

2.1 XIAP在正常皮膚與CA組織中的表達 XIAP蛋白的表達情況見表1，CA組XIAP蛋白的陽性表達率(56.94%)較對照組(15.00%)高，其差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=11.036，P<0.05)。

表1 XIAP在正常皮膚與CA組織中的表達

注：*與對照組相比，P=0.001

2.2 Caspase-9在正常皮膚與CA組織中的表達 caspase-9蛋白的表達情況見表2，CA組caspase-9蛋白的陽性表達率(37.50%)低于對照組(70.00%)，其差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=6.692，P<0.05)。

表2 Caspase-9在正常皮膚與CA組織中的表達

注：*與對照組相比，P=0.012

圖1 CA組織(HE,×100) 圖2 CA組織的空白對照(×400) 圖3 XIAP在正常皮膚組織中的表達，陽性細胞主要位于基底層及棘層中下部，數(shù)目較少，染色較淺，呈灶狀分布(×400) 圖4 XIAP在CA組織中的表達，陽性細胞分布于表皮全層，以棘層為主，染色較強(×400) 圖5 Caspase-9在正常皮膚組織中的表達，陽性細胞主要位于增生上皮的基底層及棘層中下部，染色較強(×400) 圖6 Caspase-9在CA組織中的表達，染色淺，表達較少(×400)

2.3 XIAP和caspase-9蛋白定位表達情況 XIAP蛋白陽性著色主要位于細胞漿或細胞膜。在正常皮膚組織中，陽性細胞主要位于基底層及棘層中下部，數(shù)目較少，染色較淺，呈灶狀分布(圖3)；而在CA組織中，陽性細胞分布于表皮全層，以棘層為主，染色較強(圖4)。Caspase-9蛋白陽性著色在細胞漿或細胞核。在正常皮膚組織中，陽性細胞主要位于增生上皮的基底層及棘層中下部，染色較強(圖5)；在CA組織中表達較少，著色較淺(圖6)。

2.4 CA組織中XIAP和caspase-9蛋白表達的相關(guān)性分析 采用Spearman相關(guān)分析對二者在CA組織中的表達進行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示XIAP和caspase-9的表達呈負相關(guān)(r=-0.83，P<0.05)。見表3。

表3 XIAP和caspase-9蛋白表達的相關(guān)性

3 討論

XIAP是Peter等于1996年在人的胚胎腦細胞中克隆出的IAP家族新成員，在體內(nèi)除外周血淋巴細胞以外的所有組織中廣泛表達[5]。XIAP分子N-端的3個BIR結(jié)構(gòu)域可以直接結(jié)合和抑制caspases-3、caspases-7、caspases-9，是唯一能同時抑制起始階段和效應(yīng)階段的凋亡抑制蛋白[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，XIAP 在CA組織中表達高于正常皮膚組織，推測HPV感染宿主細胞后，可能激活了XIAP基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯，使XIAP蛋白過度表達，阻礙凋亡信號的傳導(dǎo)，從而導(dǎo)致被感染的角質(zhì)形成細胞避開凋亡、逃離生長監(jiān)控，繼而保護病毒自身的復(fù)制，促進CA的生長和發(fā)展。Yin等[7]報道XIAP在CA組織中表達的陽性率為80%，且均為較高水平表達，以棘層最為明顯，本實驗陽性率低于該報道。近年來，HPV的致癌性已得到證實，被HPV感染角質(zhì)形成細胞的凋亡具有控制CA進一步發(fā)展的作用，Cillessen等在彌漫性大B細胞淋巴瘤細胞中發(fā)現(xiàn)，XIAP的拮抗劑能恢復(fù)caspase-9介導(dǎo)的凋亡[8]，提示能夠通過XIAP作為靶標研發(fā)治療CA的新藥物。

Caspases是一類半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶家族，該家族是執(zhí)行細胞凋亡的主要酶類。其中caspases-9是線粒體通路中凋亡的啟動者，激活其下游的效應(yīng)caspases，最終導(dǎo)致細胞死亡。Caspases-9廣泛表達于人類的正常組織如神經(jīng)、肌肉等，在多種腫瘤組織中均發(fā)現(xiàn)caspase-9基因轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的下調(diào)[9，10]。本實驗結(jié)果顯示caspase-9在CA組織中低表達，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，提示caspase-9也參與了CA的發(fā)病過程。本實驗還發(fā)現(xiàn)caspase-9與高表達的XIAP呈明顯的負相關(guān)。我們推測，一方面，CA中caspase-9部分表達，可以使少數(shù)細胞發(fā)生凋亡，限制HPV的復(fù)制，這可能是機體的一種自我保護機制；另一方面，caspase-9的活性受到高表達的XIAP的抑制，細胞凋亡不能有效進行，HPV仍能保持較高水平的復(fù)制和繁殖，使越來越多的角質(zhì)形成細胞被感染，促進病變組織不斷生長。

綜上所述，我們認為XIAP高表達及caspase-9活性降低共同參與CA的發(fā)生發(fā)展過程，它們之間的相互作用關(guān)系可能是細胞凋亡通路中重要的一個環(huán)節(jié)。已有研究報道，通過慢病毒介導(dǎo)的shRNA穩(wěn)定抑制XIAP的表達，可以顯著減少腫瘤細胞的增長、誘導(dǎo)凋亡并增加腫瘤細胞對化療和放療的敏感性[11-13]。因此，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進一步發(fā)展，阻斷XIAP的表達及上調(diào)caspase-9可能成為防止CA發(fā)生、復(fù)發(fā)的新靶點。

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(收稿：2016-06-24 修回：2016-08-16)

The expression of XIAP and caspase-9 in condyloma acuminatum

LIJing1,XUHongyu1,WUZhentao2.

1.DepartmentofDermatology,ShandongJiaotongHospital,Jinan250031China; 2.QingzhouSkinDiseaseControlStation,Qingzhou262500,Sandong,China

LIJing,E-mail:lijing810222@126.com

Objective: To detect the expression of XIAP and caspase-9 in condyloma acuminatum. Methods: The immunohistochemistry method was used to detect the expression of XIAP and caspase-9 in the tissues of 72 patients with condyloma acuminatum and prepuce tissues of 20 healthy persons. Results: The positive rate of XIAP protein in condyloma acuminatum was significantly higher than that in normal prepuces (56.94% vs 15%,P<0.05), while the positive rate of caspase-9 protein in condyloma acuminatum was lower than that in normal prepuces (37.5% vs 70%,P<0.05). There was a negative correlation between the expression of XIAP and caspase-9 (r=-0.83P<0.05). Conclusion: XIAP may promote the development of condyloma acuminatum by inhibiting the activity of caspase-9. The abnormal expression of XIAP and caspase-9 may be involved in the progression of condyloma acuminatum.

condyloma acuminatum; XIAP; caspase-9; apoptosis

1山東省交通醫(yī)院皮膚科，濟南,250031 2山東省青州市皮膚病防治站，青州,262500

李晶，E-mail: lijing810222@126.com