溫 晶 王 川 孫樂樂 陳明飛,2 付希安 王建文,2 劉 紅,2 張福仁,2

·技術(shù)與方法·

麻風(fēng)分枝桿菌qPCR鑒定方法的建立及評(píng)價(jià)

溫 晶1王 川1孫樂樂1陳明飛1,2付希安1王建文1,2劉 紅1,2張福仁1,2

目的： 建立麻風(fēng)分枝桿菌qPCR鑒定方法并評(píng)價(jià)該方法的敏感性和特異性。方法： 應(yīng)用qPCR對(duì)135例麻風(fēng)及其他疾病組織蠟塊樣本中麻風(fēng)分枝桿菌特異性基因Ag85B和SodA進(jìn)行檢測(cè)，建立結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)；對(duì)99例病種未知組織臘塊樣本和89例病種未知新鮮皮膚組織樣本以qPCR檢測(cè)麻風(fēng)特異性基因Ag85B和SodA，評(píng)價(jià)該檢測(cè)方法的特異性和敏感性。結(jié)果： qPCR技術(shù)檢測(cè)新鮮皮膚組織麻風(fēng)特異性基因Ag85B和SodA的特異性和敏感性分別為100%和91.7%，高于組織蠟塊樣本。結(jié)論： qPCR技術(shù)可用于麻風(fēng)菌的檢測(cè)。

麻風(fēng)； 麻風(fēng)分枝桿菌； qPCR； 評(píng)價(jià)

麻風(fēng)(leprosy)是麻風(fēng)分枝桿菌感染易感個(gè)體，特異性侵犯皮膚和周圍神經(jīng)組織，晚期可致殘的一種慢性傳染病，可根據(jù)查菌指數(shù)分為多菌型(multibacillary, MB)和少菌型(paucibacillary, PB)兩個(gè)亞型[1]。該病曾在全球廣泛流行，嚴(yán)重危害人民的身心健康。目前全球每年仍有逾20萬(wàn)的新登記病例，我國(guó)每年新登記病例數(shù)始終在1000例左右[2,3]。

由于麻風(fēng)分枝桿菌無(wú)法體外培養(yǎng)，此病的診斷主要為組織涂片查菌結(jié)合組織病理學(xué)與臨床表現(xiàn)的方法。有報(bào)道顯示，每克組織中含有104個(gè)病原菌才能通過抗酸染色的方式被檢測(cè)到，足以說明查菌方式靈敏度的不足[4,5]。同時(shí)，抗酸染色的原理基于分枝桿菌中的分枝菌酸與染料的結(jié)合而顯色，沒有種屬的特異性，存在誤診的可能性[6]。傳統(tǒng)組織病理學(xué)依據(jù)組織形態(tài)學(xué)改變，如肉芽腫病變、有無(wú)明顯“浸潤(rùn)帶”特點(diǎn)等，在缺乏典型的組織形態(tài)特點(diǎn)時(shí)往往難以確診，不能及時(shí)有效地為臨床治療提供有力的診斷依據(jù)。

近年來(lái)，將實(shí)時(shí)熒光定量與普通 PCR技術(shù)相結(jié)合的qPCR 技術(shù)的快速發(fā)展，以其能夠?qū)δ繕?biāo)微生物進(jìn)行特異性定量及定性檢測(cè)，已被成功用于微生物快速檢測(cè)[7,8]。麻風(fēng)分枝桿菌基因組中種屬特異性的36kDa抗原、18kDa抗原、65kDa抗原、groEL、Ag85B、SodA、16S rRNA基因?yàn)榇朔椒ㄔ跈z測(cè)麻風(fēng)分枝桿菌中的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)[9-14]。

本研究旨在以特異性基因?yàn)榛A(chǔ)，建立麻風(fēng)分枝桿菌qPCR檢測(cè)技術(shù)，然后通過對(duì)其靈敏度和特異度進(jìn)行評(píng)價(jià)，為臨床上輔助麻風(fēng)診斷提供一種快捷有效的手段。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

1.1.1 蠟塊組織樣本 均來(lái)自我院病理科蠟塊組織樣本庫(kù)，選取1990-2009年麻風(fēng)患者85例，其中多菌型(MB)65例，少菌型(PB)20例，其他疾病患者50例。以上樣本用于qPCR方法建立。再次選取蠟塊組織99例，所選病例疾病未知，用于qPCR方法靈敏性與特異性評(píng)價(jià)。所有組織均切取厚度為8 μm蠟片，每例組織切取8片。上述麻風(fēng)的診斷均符合國(guó)家GB15973-1995麻風(fēng)診斷標(biāo)準(zhǔn)和分型標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2 臨床病例組織樣本 皮損組織樣本(6 mm3)均來(lái)自2014-2015年我院門診疑似麻風(fēng)患者，共計(jì)89例。以上該研究的參與者均簽署了知情同意書。

1.2 組織DNA的提取

1.2.1 蠟塊組織DNA的提取 切取的8片組織蠟片立即放置于1.5 mL滅菌EP管中，然后向管中加入1 mL二甲苯中，充分溶解并置換石蠟。棄去上清后加入30 μL蛋白酶K，90℃條件下解交聯(lián)裂解組織，然后按照蠟塊組織DNA提取試劑盒(德國(guó)Qiagen公司)操作說明書進(jìn)行操作，最后DNA溶解于TE緩沖液中備用。

1.2.2 皮損組織DNA的提取 臨床收取的新鮮皮損組織(6 mm3)在生物安全柜中利用手術(shù)刀片切成很小的碎塊，將組織碎塊轉(zhuǎn)移至1.5 mL無(wú)菌EP管中加入30 μL蛋白酶K，56℃條件下裂解組織，然后按照組織和全血DNA提取試劑盒(德國(guó)Qiagen公司)操作說明書進(jìn)行操作，最后DNA溶解于TE緩沖液中備用。

1.3 麻風(fēng)分枝桿菌qPCR檢測(cè) 以麻風(fēng)分枝桿菌特異性基因Ag85B和SodA為檢測(cè)目標(biāo)，利用Primer Expess 3.0設(shè)計(jì)引物及探針。PCR反應(yīng)體系體積為30 μL，其中包括2xTaqMan Gene Expression Mater Mix15 μL，20 μM上下游引物各0.75 μL，10 μM Taqman探針0.6 μL，模板DNA 2 μL，退火溫度為60℃，擴(kuò)增循環(huán)數(shù)為40，利用ABI 7300熒光定量PCR系統(tǒng)(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 麻風(fēng)分枝桿菌檢出率，qPCR靈敏性及特異性等數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0軟件完成。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 麻風(fēng)蠟塊組織檢出率及實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判定 以50份其他疾病蠟塊組織中qPCR擴(kuò)增結(jié)果無(wú)1例陽(yáng)性即保證特異性為100%同時(shí)最大可能提高靈敏性為原則，同時(shí)參考以往同類文獻(xiàn)報(bào)道[15],將麻風(fēng)分枝桿菌qPCR檢測(cè)臨界擴(kuò)增Ct值定為35，判讀標(biāo)準(zhǔn)為，當(dāng)Ag85B和SodA擴(kuò)增Ct值均≤35時(shí)，結(jié)果判定為陽(yáng)性，當(dāng)Ag85B和SodA擴(kuò)增Ct值均>35時(shí)，結(jié)果判定為陰性，若出現(xiàn)一個(gè)基因擴(kuò)增Ct值≤35而另一個(gè)基因擴(kuò)增Ct值>35時(shí)，則重新檢測(cè)，根據(jù)重新檢測(cè)的結(jié)果按照上述標(biāo)準(zhǔn)再進(jìn)行判讀。基于以上標(biāo)準(zhǔn)，麻風(fēng)患者的總體檢出率為82.4%，其中MB型患者的檢出率為89.2%，PB型患者的檢出率為60%見表1。檢測(cè)陰性的麻風(fēng)患者樣本中，有5例MB型患者(占檢測(cè)陰性MB型樣本的71.4%)和3例PB型患者(占檢測(cè)陰性PB型樣本的37.5%)出現(xiàn)了PCR擴(kuò)增，但是Ct值>35，綜上可見，MB型患者的檢出率高于PB型患者，且年代越近的樣本的檢出率越高，原因可能為蠟塊組織保存時(shí)間過長(zhǎng)造成了病原體DNA的降解，影響了檢出率。

表1 麻風(fēng)蠟塊組織中qPCR技術(shù)檢出率

2.2 qPCR方法在蠟塊樣本中的靈敏性及特異性分析 qPCR方法檢測(cè)病種未知的99例蠟塊組織樣本，麻風(fēng)分枝桿菌陽(yáng)性樣本為25例，陰性樣本74例；99例蠟塊組織樣本的病理結(jié)合查菌診斷為28例麻風(fēng)，其余為其他疾病，經(jīng)對(duì)比分析，該方法的檢測(cè)敏感性為82.1%，特異性為97.2%(表2)。由于蠟塊組織保存時(shí)間較長(zhǎng)及蛋白交聯(lián)給組織裂解帶來(lái)的困難，我們推測(cè)該方法在新鮮皮損組織中敏感性和特異性會(huì)更高。

表2 蠟塊組織中qPCR技術(shù)靈敏性及特異性分析

2.3 qPCR方法在新鮮皮膚樣本中的靈敏性及特異性分析 2014-2015年，我院門診共收集89例疑似麻風(fēng)患者皮損組織，利用qPCR技術(shù)對(duì)其均進(jìn)行了麻風(fēng)分枝桿菌檢測(cè)，為消除檢測(cè)的偏向性，均在病理診斷之前報(bào)告檢測(cè)結(jié)果。根據(jù)之前制定的檢測(cè)結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)，判定麻風(fēng)分枝桿菌陽(yáng)性樣本33例，陰性樣本56例；89例臨床組織樣本病理診斷為36例麻風(fēng)，53例為其他疾病，具體對(duì)比分析結(jié)果見表3?？梢?，qPCR技術(shù)在新鮮臨床病例樣本的檢測(cè)靈敏度為91.7%，特異度為100%。

表3 新鮮皮膚組織中qPCR技術(shù)靈敏性及特異性分析

3 討論

麻風(fēng)分枝桿菌不能體外培養(yǎng)，給臨床上麻風(fēng)的診斷帶來(lái)了較大困難。麻風(fēng)診斷標(biāo)準(zhǔn)為：①有皮損并伴有淺感覺障礙及閉汗；②周圍神經(jīng)干或皮支粗大；③皮膚切刮組織液及皮膚病理抗酸染色見麻風(fēng)分枝桿菌；④病理檢查見上皮樣細(xì)胞肉芽腫及巨噬細(xì)胞肉芽腫，神經(jīng)可見腫大及浸潤(rùn)。符合前2項(xiàng)疑似麻風(fēng)，符合以上4項(xiàng)即可確診[16]。以上可見，麻風(fēng)的診斷最核心的指標(biāo)為查見麻風(fēng)分枝桿菌和典型的病理表現(xiàn)。對(duì)于早期或者PB型麻風(fēng)，傳統(tǒng)的抗酸染色由于受其靈敏度限制查見病原菌比較困難，雖然為了提高該方法的靈敏度，諸如使用特殊包被的載玻片，改良的染色步驟及校準(zhǔn)的顯微鏡等措施被使用，但是特異性方面的缺陷，限制了其在臨床診斷的應(yīng)用[17，18]；對(duì)于缺乏典型病理表現(xiàn)的病例，病理檢查也不能及時(shí)提供明確的診斷依據(jù)。此外，利用酶聯(lián)免疫反應(yīng)(ELISA)技術(shù)檢測(cè)機(jī)體針對(duì)酚糖脂的IgM抗體等血清學(xué)檢查手段也被用以麻風(fēng)的輔助診斷[19，20]，該方法是非侵入性的且對(duì)抗酸染色檢查是一種有效的補(bǔ)充。此方法的檢測(cè)結(jié)果反映的是機(jī)體的病原菌載量，可根據(jù)其結(jié)果對(duì)麻風(fēng)患者作進(jìn)一步的細(xì)化分型[21]。但是，PCR技術(shù)，特別是qPCR技術(shù)已經(jīng)被證明在靈敏度方面相對(duì)于血清學(xué)檢查有著無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)[22]。

本研究選取麻風(fēng)分枝桿菌特異性基因Ag85B和SodA作為檢測(cè)目標(biāo)，設(shè)計(jì)特異性引物及探針，對(duì)前期85例麻風(fēng)蠟塊組織樣本(65例MB型和20例PB型)和50例其他疾病蠟塊組織樣本進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)PCR的擴(kuò)增結(jié)果及充分保證特異性并最大可能提高靈敏性的原則，我們將PCR擴(kuò)增臨界Ct值定為35。按照此標(biāo)準(zhǔn)，85例麻風(fēng)蠟塊組織樣本檢出率為82.4%。然后，我們檢測(cè)了病種未知的99例蠟塊組織樣本的麻風(fēng)分枝桿菌，將判讀結(jié)果與臨床診斷結(jié)果進(jìn)行比對(duì)后，計(jì)算出qPCR方法的特異度為97.2%，靈敏度為82.1%。接下來(lái)在89例新鮮皮損組織中進(jìn)行了麻風(fēng)分枝桿菌檢測(cè)，經(jīng)比對(duì)計(jì)算后，特異度為100%，靈敏度為91.7%，其中多菌型的靈敏度達(dá)100%，而少菌型的靈敏度為50%。以上結(jié)果證實(shí)了我們對(duì)蠟塊組織中靈敏度偏低原因的推測(cè)；同時(shí)，我們的上述研究結(jié)果與國(guó)內(nèi)外研究團(tuán)隊(duì)研究結(jié)果基本保持一致。葉理等[24]利用qPCR方法在52例皮膚組織標(biāo)本中檢測(cè)麻風(fēng)分枝桿菌DNA的檢出率為90.38%；覃曉琳等[25]利用單管巢式qPCR在54例疑似麻風(fēng)組織液標(biāo)本中檢測(cè)麻風(fēng)分枝桿菌DNA，其中多菌性的檢出率為96.9%，少菌型檢出率為83.3%。另外，Martinez等[15]于2006年利用qPCR技術(shù)在69例皮膚組織樣本中檢測(cè)麻風(fēng)分枝桿菌Ag85B基因的靈敏度達(dá)91.3%；而后于2011年再次利用qPCR技術(shù)在62例皮膚組織樣本中同時(shí)檢測(cè)麻風(fēng)分枝桿菌Ag85B基因和SodA基因，其靈敏度分別為68.8%和75%；對(duì)于Ag85B基因，多菌型的靈敏度為95.2%，而少菌型的靈敏度為36.4%[23]。

本研究結(jié)果表明，同時(shí)選取麻風(fēng)分枝桿菌特異性基因Ag85B和SodA作為檢測(cè)目標(biāo)的qPCR技術(shù)，具有較高的靈敏度和最高的特異度；輔之以蛋白酶K裂解為核心的麻風(fēng)分枝桿菌DNA提取方法，是一種快捷有效的臨床診斷麻風(fēng)的輔助手段，特別是對(duì)于BT型麻風(fēng)和缺乏典型組織形態(tài)學(xué)改變的麻風(fēng)診斷則意義更為明顯。

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(收稿：2016-06-21 修回：2016-06-24)

Establishment and evaluation of quantitative PCR method for detection of Mycobacterium leprae DNA

WENJing1,WANGChuan1,SUNLele1,CHENMingfei1,2,FUXi'an1,WANGJianwen1,2,LIUHong1,2,ZHANGFuren1,2.

1.ShandongProvincialInstituteofDermatologyandVenereology,AcademyofMedicalSciences,Jinan250022,China; 2.ShandongProvincialDermatologyHospital,ShandongUniversity,Jinan250022,China

Correspondenceauthor:ZHANGFuren,E-mail:zhangfuren@hotmail.com

Objective: To establish the detection method of Mycobacterium leprae DNA using quantitative PCR (qPCR) and to analyze the sensitivity and specificity of qPCR in identifyingMycobacteriumlepraeDNA. Methods: The special gene sequences Ag85B and soda ofMycobacteriumlepraeDNA were detected in 135 formalin-fixed, paraffin-embedded skin tissues of leprosy or non-leprosy patients using qPCR to establish the criterion for this method. Then the special gene sequences Ag85B and sodA ofMycobacteriumlepraeDNA were also detected in 99 formalin-fixed, paraffin-embedded skin tissues of unknown disease and 89 frozen skin tissues of unknown diseases to evaluate the sensitivity and specificity of qPCR. Results: The specificity and sensitivity of qPCR were 100% and 91.7% in frozen skin tissues and higher than those in formalin-fixed, paraffin-embedded skin tissues. Conclusion: qPCR is an useful method in detectingMycobacteriumlepraeDNA.

leprosy;Mycobacteriumleprae; qPCR; evaluation

山東省自然科學(xué)基金青年基金(編號(hào)：ZR2013HQ041)

1山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，山東省皮膚病性病防治研究所，濟(jì)南，250022

2山東省皮膚病醫(yī)院，山東大學(xué)，濟(jì)南，250022

張福仁，E-mail：zhangfuren@hotmail.com