吳航

（菏澤醫(yī)學(xué)?？茖W(xué)校，山東 菏澤 274000）

丹參酚酸B通過調(diào)控Sirt1對大鼠肝氧化應(yīng)激損傷的影響

吳航

（菏澤醫(yī)學(xué)?？茖W(xué)校，山東 菏澤 274000）

目的探討丹參酚酸B抗大鼠肝氧化應(yīng)激損傷的機(jī)制。方法48只SD大鼠隨機(jī)分為四組:A對照組，B模型組，C丹參酸酚B空白給藥組，D丹參酸酚B預(yù)處理組。SalB溶液灌胃7天之后使用四氯化碳造模，24 h后取肝臟標(biāo)本，分別測定肝勻漿SOD、MDA水平，Western Blot檢測MnSOD和Sirt1表達(dá)水平，RT-PCR檢測MnSOD基因轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果經(jīng)過四氯化碳誘導(dǎo)，模型組小鼠SOD、Sirt1表達(dá)水平明顯下降；與模型組相比，丹參酸酚B預(yù)處理組SOD、Sirt1表達(dá)水平明顯上升。與對照組相比，丹參酸酚B空白給藥組Sirt1表達(dá)水平明顯上升。結(jié)論在四氯化碳誘導(dǎo)的大鼠急性肝損傷模型中，丹參酸酚B具有明顯的抗氧化應(yīng)激肝損傷的藥理作用，其機(jī)制與激活Sirt1的表達(dá)密切相關(guān)。

丹參酚酸B；氧化應(yīng)激損傷；Sirt1；MnSOD

肝損傷是影響人類健康的主要問題之一，化學(xué)毒物中毒引起的肝損傷則最為常見[1]。多種化學(xué)物質(zhì)，比如藥物、酒精、農(nóng)藥以及有機(jī)溶劑都可以導(dǎo)致嚴(yán)重的肝損傷。雖然肝組織具有較強(qiáng)的再生能力，但是持續(xù)性的肝損傷仍然會導(dǎo)致肝臟功能的衰竭[2]。因此，從藥用植物中提取具有保肝藥理作用的生物活性成分是目前研究熱點(diǎn)。藥用植物的活性成分由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)的巨大多樣性，為新藥的研發(fā)提供了豐富的來源。丹參作為一種傳統(tǒng)的中草藥在中國的應(yīng)用已經(jīng)超過了1000年，丹參酚酸B（SalB）作為丹參當(dāng)中一種重要的生物活性物質(zhì)，具有抑制星狀細(xì)胞激活、調(diào)節(jié)免疫以及改善缺血——再灌注損傷的作用[3]，但是SalB抗氧化應(yīng)激損傷的作用機(jī)制尚未完全闡明。去乙?；鞍祝⊿irtuin）家族是一類高度保守的依賴NAD+的去乙?；?，Sirt1作為Sirtuin家族中的一個重要成員在調(diào)控細(xì)胞增殖、抑制器官纖維化等方面發(fā)揮了重要作用[4]，然而在抗氧化應(yīng)激損傷方面則鮮有報道。因此，本研究通過四氯化碳（CCl4）引起的大鼠肝損傷模型，主要探討SalB通過Sirt1抗氧化應(yīng)激損傷的分子作用機(jī)制，為促進(jìn)SalB的臨床應(yīng)用提供新的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑 雄性SD大鼠48只，體重150～170g，SalB購自上海綠谷科技有限公司，四氯化碳購自青島佰利源化玻儀器有限公司，超氧化物岐化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、蛋白提取試劑盒試劑盒、BCA試劑盒以及ECL試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，錳超氧化物岐化酶（MnSOD）、Sirt1抗體購自美國Abcam公司，RT-PCR試劑盒及引物購自大連寶生物公司。MnSOD引物序列：上游，5’-CCACAGACACAGCTGTCAGTTTCTC-3’，下游，5’-GGTGGTGGAGGACCCAAAGGAGAGT-3’）。

1.2 動物分組及造模方法 所有SD大鼠隨機(jī)分為4組：（A）對照組。（B）四氯化碳損傷組。（C）SalB空白給藥組。（D）SalB預(yù)處理后四氯化碳損傷組，每組12只動物。C、D組動物使用SalB水溶液灌胃(20mg/kg, 0.1m l/10 g)，A、B組大鼠灌胃給予同容量生理鹽水，每天一次，連續(xù)給藥7天。最后一次灌胃結(jié)束2 h后，B、D組大鼠腹腔注射50%四氯化碳（0.1m l/100 g），A、C組大鼠同時腹腔注射同容量生理鹽水。腹腔注射后禁食24 h，處死動物，留取相同部位的肝臟標(biāo)本，-80℃冰箱保存。

1.3 生化指標(biāo)測定 肝組織勻漿后離心，取上清液按照試劑盒說明書測定肝組織中SOD、MDA的水平。

1.4 Western-Blot按照蛋白提取試劑盒說明書分別提取胞漿蛋白和核蛋白，蛋白變性之后使用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量，SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜后使用蛋白封閉液進(jìn)行封閉，一抗孵育過夜，二抗孵育2h后使用ECL試劑盒顯色。

1.5 RT-PCR 按照RT-PCR試劑盒說明書步驟提取大鼠肝臟標(biāo)本RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄完成進(jìn)行PCR。PCR結(jié)束后使用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行成像分析。1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0軟件，所獲數(shù)據(jù)采用方差分析和t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 SalB對SOD和MDA的影響 模型組動物肝勻漿中的SOD活性與對照組比較，P＜0.01，有顯著性差異。SalB預(yù)處理組大鼠肝的SOD活性明顯上升與模型組比較，P＜0.05，有顯著性差異。模型組動物肝勻漿中的MDA水平明顯上升，P＜0.01，有顯著性差異。SalB預(yù)處理組肝臟當(dāng)中MDA水平與模型組，P＜0.05，有顯著性差異。見表1。

表1 丹參酚酸B對大鼠ALT、AST水平的影響(±s,U/mgprot)

表1 丹參酚酸B對大鼠ALT、AST水平的影響(±s,U/mgprot)

與對照組相比**P＜0.01，與模型組相比#P＜0.05。

組別 n SOD MDA(U/mgprot)對照組 12 105.33±2.86 1.309±0.190 CCl4損傷組 12 77.66±4.34** 2.263±0.156** SalB空白給藥組 12 113.7±2.37 1.260±0.157 SalB預(yù)處理+CCl4損傷組 12 91.06±4.14# 2.051±0.245#

2.2 SalB對MnSOD蛋白表達(dá)和基因轉(zhuǎn)錄的影響 模型組大鼠MnSOD的蛋白表達(dá)水平P＜0.01,有顯著性差異，SalB預(yù)處理組，與模型組比較，P＜0.05有顯著性差異，MnSOD的基因轉(zhuǎn)錄水平也呈現(xiàn)出相同趨勢。見圖1、圖2。

圖1 丹參酚酸B對MnSOD蛋白表達(dá)的影響

圖2 丹參酚酸B對MnSOD基因轉(zhuǎn)錄的影響

2.3 SalB對Sirt1蛋白表達(dá)的影響 模型組Sirt1蛋白表達(dá)水平與對照組比較，P＜0.01，有顯著性差異。SalB預(yù)處理組，Sirt1蛋白表達(dá)水平與對照組比較，P＜0.05，有顯著性差異。SalB空白給藥組Sirt1水平與對照組比較，P＜0.05，有顯著性差異。見圖3。

圖3 丹參酚酸B對Sirtl基因轉(zhuǎn)錄的影響；與對照組相比

3 討論

氧化應(yīng)激是造成肝損傷的重要原因[5]。我們使用四氯化碳造成了大鼠急性肝損傷的模型，四氯化碳經(jīng)過肝細(xì)胞色素P450代謝生成氧自由基，氧自由基攻擊肝細(xì)胞導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷甚至壞死[6]。為了研究SalB抗氧化應(yīng)激損傷的機(jī)制，測定大鼠肝組織中SOD和MDA的水平。SOD是大鼠體內(nèi)的一種重要的抗氧化酶[7]。模型組大鼠肝組織的SOD活性明顯下降，SalB預(yù)處理組大鼠肝組織當(dāng)中SOD活性明顯上升。MDA是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，MDA的水平可以反映肝組織氧化應(yīng)激損傷的程度[8]。結(jié)果顯示與對照組相比模型組大鼠肝組織中的MDA水平明顯上升，而與模型組相比，SalB預(yù)處理組大鼠肝組織MDA水平明顯下降，證實(shí)了四氯化碳導(dǎo)致大鼠產(chǎn)生了明顯的氧化應(yīng)激損傷，而SalB則可以明顯減輕四氯化碳導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷，而且其機(jī)制很可能與大鼠體內(nèi)的抗氧化的關(guān)鍵酶—SOD密切相關(guān)。

SalB抗氧化應(yīng)激損傷的分子作用機(jī)制，結(jié)果顯示經(jīng)過CCl4誘導(dǎo)，大鼠肝組織中MnSOD的表達(dá)水平明顯下降，而與模型組相比，SalB預(yù)處理組MnSOD的表達(dá)水平明顯上升，在基因轉(zhuǎn)錄水平MnSOD也表現(xiàn)出了同樣的趨勢，這證明了SalB抗氧化應(yīng)激的機(jī)制之一是在轉(zhuǎn)錄水平激活了MnSOD的表達(dá)。

目前的研究已經(jīng)證實(shí)在細(xì)胞質(zhì)中Sirt1有一定程度的表達(dá)[9]，但是只有細(xì)胞質(zhì)當(dāng)中的Sirt1進(jìn)入細(xì)胞核才能激活其下游的轉(zhuǎn)錄因子，誘導(dǎo)相關(guān)蛋白的表達(dá)[10]。Sirt1進(jìn)入細(xì)胞核之后與PGC-1α相互作用，調(diào)控AMPK，從而誘導(dǎo)MnSOD的表達(dá)[11]。經(jīng)過四氯化碳誘導(dǎo)，核蛋白中的Sirt1水平明顯下降，而與模型組比較，SalB預(yù)處理組大鼠肝組織核蛋白Sirt1的水平明顯上升，并且與對照組相比，SalB空白給藥組大鼠核蛋白中Sirt1水平也有一定程度的提高。SalB可以誘導(dǎo)Sirt1的表達(dá)，而Sirt1的高表達(dá)則可以激活Mn-SOD的基因轉(zhuǎn)錄從而提升MnSOD的表達(dá)水平。

綜上所述，SalB具有明顯的抗氧化應(yīng)激損傷的作用，其機(jī)制與激活Sirt1的表達(dá)從而提升肝臟內(nèi)MnSOD的表達(dá)密切相關(guān)。

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執(zhí)行編委：吳效普

責(zé)任編輯：吳效普 邵文錦

英文編輯：楊 馨

責(zé)任校對：吳效普 邵文錦

微機(jī)排版：邵文錦 張鴻雁

Salvianolic Acid B Attenuates Liver Oxidative Stress by Regulate Sirt1 in Rats

W u Hang
（Heze Medical College,Heze 274000,Shandong）

ObjectiveTo study the molecular mechanism of Salvianolic acid B(SalB)attenuates liver oxidative stress.Methods48 SD rats were divided into fore groups random ly:(A)control group，(B)model group，(C)Salvianolic acid group，(D)Salvianolic acid+CCl4group.Liver injury w as caused by CCl4after SalB gavage 7 days,then take the liver specimens.Determine the level of SOD and MDA of liver homogenate.Western blotwas used to detect the protein expression levels of MnSOD and Sirt1.RT-PCR was used to detect the levels of gene transcription of MnSOD.ResultsAfter CCl4induced,the SOD and Sirt1 levels of group B were significantly depressed,however the levels of SOD and Sirt1 in group D were rised obviously,and the level of Sirt1 in group C was promoted compared with group A.ConclusionSalvianolic acid has obvious antioxidant stress effects of liver damage in?rats induced by CCl4.

Salvianolic acid B;Oxidative stress;Sirtl；MnSOD

R285.5

：A

：1008-4118（2016）02-0008-03

10.3969/j.issn.1008-4118.2016.02.003

2016-02-23