宋玉財(cái) 王官曉 王 彬 于曉云 劉洪明 于小川 王俊卿 徐曉靜（山東省煙臺(tái)市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所 264003）

豬圓環(huán)病毒2型LAMP檢測(cè)方法的建立

宋玉財(cái) 王官曉 王 彬 于曉云 劉洪明 于小川 王俊卿 徐曉靜（山東省煙臺(tái)市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所 264003）

本試驗(yàn)首先以PCV2的ORF2基因作為靶基因設(shè)計(jì)4條特異性引物，再優(yōu)化LAMP反應(yīng)體系各成分以找到最佳配比，經(jīng)過(guò)特異性與靈敏度試驗(yàn)的驗(yàn)證，最終建立快速檢測(cè)PCV2的LAMP方法。結(jié)果顯示，該方法最短可在1h內(nèi)完成整個(gè)檢測(cè)過(guò)程，最小檢測(cè)量接近1拷貝質(zhì)粒DNA，靈敏度遠(yuǎn)高于本實(shí)驗(yàn)室常用的PCR方法，且相同條件下PCV1、PPV、PRV均不發(fā)生擴(kuò)增，特異性良好。除通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳得到階梯狀條帶外，還可加入SYBR Green I染料肉眼判定結(jié)果。

豬圓環(huán)病毒2型 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增

LAMP建立之初是作為一種創(chuàng)新的、用于體外擴(kuò)增核酸的分子生物學(xué)技術(shù)，后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)，其許多特點(diǎn)使其在病原檢測(cè)中也有著不可比擬的優(yōu)勢(shì)。本研究利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)建立了一種新的檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)核酸的方法，擴(kuò)充了實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)抗原的方式，由于LAMP檢測(cè)方法擺脫了昂貴儀器的束縛，適合于條件受到限制的基層臨床診斷。此次嘗試為本實(shí)驗(yàn)室在檢測(cè)PCV2方向提供了新的途徑，進(jìn)一步改善之后也能為基層臨床診斷提供試劑盒選擇。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒與病毒來(lái)源 分別連接PCV2、PCV1整個(gè)病毒基因組的重組質(zhì)粒pSK-PCV2-SD1、pMD18-T-PCV1為山東省畜禽疫病防治及繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存提供。豬細(xì)小病毒病滅活疫苗WH-1株由中牧實(shí)業(yè)股份有限公司提供、偽狂犬病活疫苗由吉林正業(yè)生物制品股份有限公司提供。

1.2 主要試劑 Bst DNA聚合酶(大片段)(美國(guó)New England Biolabs公司)、Betaine(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)、MgSO4(美國(guó)Amresco公司)、Taq DNA聚合酶(Fermentas中國(guó)公司)、普通質(zhì)粒小提試劑盒(天根生化科技北京有限公司)；SYBR Green I核酸染料、Tris平衡酚購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；dNTP、DNA Marker DL-2000、蛋白酶K均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；其他試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 DNA模板的制備 （1）質(zhì)粒的抽提：無(wú)菌條件下，取兩瓶的LB液體培養(yǎng)基，首先按1:1000的比例加入氨芐青霉素(Amp，100mg/ml)，搖勻后再分別以1:100接種含有重組質(zhì)粒pSK-PCV2 SD1、pMD18-T-PCV1的DH5α菌種，置于振蕩器中37℃ 200r/min搖菌12h。將菌液轉(zhuǎn)至離心管，質(zhì)粒提取過(guò)程參照天根生化科技(北京)有限公司普通質(zhì)粒小提試劑盒(離心柱型)說(shuō)明書(shū)。（2）DNA的提?。杭尤?ml滅菌水溶解粉末狀偽狂犬病活疫苗，取偽狂犬活疫苗溶解液和豬細(xì)小病毒病滅活疫苗各500μl于1.5ml離心管。向離心管中加入10% SDS溶液50μl，而后加入蛋白酶K(20mg/ml)10ul，混勻后置55℃水浴1.5～2h；加入200μL Tris平衡酚，充分混勻溶液，置高速離心機(jī)中4℃12000rpm離心15min；取上清液于一新1.5ml離心管中，加入Tris平衡酚和氯仿各200μl，充分混勻，4℃ 12000rpm離心15min；取上清液于一新離心管中，加入氯仿200μl，充分混勻，4℃ 12000rpm離心15min；取上清液于一新離心管中，加入2倍上清液體積的已預(yù)冷的無(wú)水乙醇，于冰箱-20℃靜置20min后，4℃ 12000rpm離心15min，棄掉上清液，此時(shí)會(huì)發(fā)現(xiàn)管底附著有透明粘性沉淀。向離心管中加入1mL 70%乙醇沖洗沉淀表面和管壁，4℃ 7500rpm離心5min，棄掉乙醇，用吸水紙吸走余下液體；加入20μL滅菌水將沉淀溶解，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank上公布的多個(gè)PCV2毒株基因序列，以BioEdit軟件進(jìn)行序列比對(duì)，篩選出序列JS2003(登錄號(hào)：AY578327)的ORF2片段作為靶基因，應(yīng)用日本榮研株式會(huì)社的在線引物設(shè)計(jì)程序Primer Explorer V4(http://primerexplorer.jp/e/)，設(shè)計(jì)得到4條LAMP引物，包括1對(duì)外引物（F3/B3）和1對(duì)內(nèi)引物(FIP/BIP)。P3、P4為實(shí)驗(yàn)室常用PCR反應(yīng)中擴(kuò)增整個(gè)ORF2基因的上下游引物。所有引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。引物序列見(jiàn)表1。

表1 LAMP和PCR引物序列

1.5 LAMP檢測(cè)方法的建立與優(yōu)化 通常LAMP方法使用25μL反應(yīng)體系，成分包括：內(nèi)外引物、dNTPs、MgSO4、Betaine、Bst DNA聚合酶、10×ThermoPol Buffer、模板DNA。以LAMP原文中提到的反應(yīng)體系為基礎(chǔ)，對(duì)各組分進(jìn)行適當(dāng)優(yōu)化。內(nèi)外引物濃度比按照10:1～1:1不斷調(diào)試，其中內(nèi)引物終濃度范圍0.8～2.4μM，外引物終濃度范圍0.2～0.8μM；dNTPs終濃度范圍0.2～1.4mM；MgSO4終濃度范圍0～6mM；Betaine終濃度范圍0～1.4M；Bst DNA聚合酶8U、10×ThermoPol Buffer 2.5μl、模板DNA 1μl。反應(yīng)溫度控制在60～65℃，擴(kuò)增60min，80℃ 5min終止反應(yīng)。取8μL擴(kuò)增產(chǎn)物上樣于1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，置凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果。此外，還可向反應(yīng)管中加入1μl SY BR Green I核酸染料，肉眼觀察溶液顏色變化，進(jìn)一步確定結(jié)果，可將反應(yīng)管置于紫外分析儀下觀察有無(wú)熒光。

1.6 PCR體系構(gòu)成和擴(kuò)增反應(yīng)程序 以實(shí)驗(yàn)室常用檢測(cè)PCV2的PCR方法來(lái)實(shí)現(xiàn)與LAMP檢測(cè)方法的對(duì)比，PCR方法也使用25μL反應(yīng)體系，已經(jīng)過(guò)前任研究者的優(yōu)化。各成分終濃度分別是：上下游引物(P3、P4)0.4μM，dNTPs 0.2mM，1.5mM MgCl2，2.5U Taq DNA聚合酶，1×Taq Buffer with KCl。加入模板DNA 1μl，滅菌水補(bǔ)齊25μl。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序設(shè)定為：95℃ 3min，94℃1min，55℃ 1min，72℃ 1min，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下分析結(jié)果。

1.7 LAMP檢測(cè)方法的靈敏性試驗(yàn) （1）梯度標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒模板的建立：① 分子量(M)=堿基數(shù)×堿基平均分子量=(擴(kuò)增片段堿基數(shù)+載體堿基數(shù))×2×330；②拷貝數(shù)=質(zhì)量/分子量*NA= m/M*NA。制備質(zhì)粒模板，用微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度，計(jì)算出此濃度下溶液包含的質(zhì)?？截悢?shù)，使用滅菌水倍比稀釋該溶液，得到每μl溶液所含質(zhì)?？截悢?shù)的數(shù)量級(jí)按109～100依次分布的梯度標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒模板。（2）LAMP和PCR方法的靈敏度測(cè)定：以1μl拷貝數(shù)為109～100梯度標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒溶液為模板DNA，按照優(yōu)化后的體系進(jìn)行LAMP反應(yīng)。同時(shí)，使用相同的模板DNA進(jìn)行常規(guī)PCR檢測(cè)。兩者的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，LAMP的擴(kuò)增產(chǎn)物加入SYBR Green I核酸染料，置紫外分析儀下觀察結(jié)果。另外，提取臨床已知的58份病料的DNA，同時(shí)進(jìn)行了LAMP和PCR方法的檢測(cè)，予以比較。

1.8 LAMP檢測(cè)方法的特異性試驗(yàn) 提取到重組質(zhì)粒pSK-PCV2-SD1、pMD18-T-PCV1，提取到兩種疫苗中的PRV和PPV基因組DNA。通過(guò)實(shí)驗(yàn)室其他研究人員建立的，用于同時(shí)檢測(cè)PCV、PRV、PPV的多重PCR診斷方法來(lái)確定PRV和PPV作為對(duì)照可用。分別以質(zhì)粒pSK-PCV2-SD1、pMD18-T-PCV1和驗(yàn)證過(guò)含PRV、PPV的DNA為模板，滅菌水為陰性對(duì)照，采用優(yōu)化后的體系來(lái)檢驗(yàn)LAMP方法的特異性。擴(kuò)增完成后，1.5%瓊脂糖凝膠中電泳確定結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 優(yōu)化后的LAMP反應(yīng)體系 LAMP優(yōu)化完成的25μL反應(yīng)體系中各成分最終濃度確定為：內(nèi)引物(FIP/BIP) 2.4μM，外引物(F3/B3)0.24μM，dNTPs 0.6mM，Betaine 0.4M，Bst DNA聚合酶8U，1×ThermoPol Buffer(20mM Tris-HCl、10mM KCl、10mM (NH4)2SO4、2mM MgSO4、0.1% Triton X-100)，模板DNA 1μl，添加滅菌水至25μl?？梢钥吹?×ThermoPol Buffer包含2mM的MgSO4，試驗(yàn)證明在該體系下另外添加Mg2+后可導(dǎo)致擴(kuò)增失敗。最佳反應(yīng)條件是將反應(yīng)管置63℃水浴60min，再放入80℃ 5min中止擴(kuò)增。電泳分析可得知，當(dāng)反應(yīng)溫度在60～64℃范圍，均能呈現(xiàn)出明顯的LAMP特有的階梯狀條帶，表明擴(kuò)增完成良好，其中尤以63℃條帶最亮；加入SYBR Green I核酸染料后，肉眼觀察可見(jiàn)陽(yáng)性反應(yīng)管內(nèi)液體呈黃色，而陰性對(duì)照則為橙紅色；紫外燈下可見(jiàn)陽(yáng)性反應(yīng)管發(fā)出明亮的黃色熒光。

圖1 LAMP溫度梯度的電泳及可視化分析

2.2 LAMP檢測(cè)方法的靈敏度 （1）使用引物P3、P4的PCR方法擴(kuò)增的靶序列包含PCV2基因組中整個(gè)ORF2，擴(kuò)增片段大小717bp。靈敏度測(cè)試以含有109～100拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒溶液為模板DNA。電泳結(jié)果可見(jiàn)，PCR的條帶從第7泳道開(kāi)始消失，而LAMP的階梯狀條帶直到第10泳道，也就是質(zhì)粒模板僅為個(gè)位拷貝數(shù)時(shí)仍完成擴(kuò)增。相比較而言，LAMP檢測(cè)方法的最低檢測(cè)量為100拷貝，質(zhì)粒濃度約為0.01fg/μL；常規(guī)PCR檢測(cè)方法的最低檢測(cè)量為104拷貝，質(zhì)粒濃度約為100fg/μL。同時(shí)檢測(cè)PCV2，LAMP方法的靈敏度相當(dāng)于常規(guī)PCR法的10000倍。（2）對(duì)于臨床已知的58份病料的檢測(cè)情況為：PCR方法共檢測(cè)出12例陽(yáng)性結(jié)果，而LAMP方法則檢測(cè)出了18例陽(yáng)性結(jié)果，相比PCR方法能多檢測(cè)出6例陽(yáng)性病料。在臨床檢測(cè)結(jié)果的確認(rèn)方面還有不完善的地方，但應(yīng)該能部分反映出LAMP方法的靈敏性確實(shí)比PCR要好一些。

圖2 LAMP檢測(cè)方法和PCR的靈敏度對(duì)比A: LAMP靈敏度的電泳及可視化分析；B: PCR靈敏度的電泳分析。M：DNA Marker DL-2000；1-10：每反應(yīng)管內(nèi)模板質(zhì)粒拷貝數(shù)10倍倍比縮小，依次從109-100；11：陰性對(duì)照。Lanes: M, DNA Marker DL-2000; 1, 1 × 109copies/tube; 2, 1 × 108copies/tube; 3, 1 × 107copies/tube; 4, 1 × 106copies/tube; 5, 1 × 105copies/tube; 6, 1 × 104copies/tube; 7, 1 × 103copies/tube; 8, 1 × 102copies/tube; 9, 1 × 101copies/tube; 10, 1 × 100copy/tube; 11, negative control.

2.3 LAMP檢測(cè)方法的特異性 PCV2、PRV、PPV是引起幾類主要豬病的重點(diǎn)DNA病毒，PCV1不具致病性，但由于與PCV2基因組之間存在較高的同源性，在檢測(cè)PCV2感染時(shí)必須能夠加以區(qū)分。電泳結(jié)果顯示，同等條件下，只有以重組質(zhì)粒pSK-PCV2 SD1為模板的LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物呈現(xiàn)特有的階梯狀條帶。其余分別使用重組質(zhì)粒pMD18-T-PCV1、PRV DNA、PPV DNA作為模板的反應(yīng)結(jié)果均為陰性。說(shuō)明該LAMP檢測(cè)方法對(duì)PCV2有良好的特異性。

圖3 LAMP檢測(cè)方法特異性試驗(yàn)的電泳分析

3 討論

（1）豬圓環(huán)病毒包括PCV1和PCV2兩種基因型，PCV1并無(wú)致病性，而PCV2感染對(duì)養(yǎng)豬業(yè)來(lái)說(shuō)卻是一個(gè)比較棘手的問(wèn)題。Meehan等報(bào)道中提到PCV2各毒株間的核苷酸同源率達(dá)到96%以上，PCV1和PCV2之間的核苷酸同源率則小于80%[1-3]。以基因組中兩個(gè)較大的開(kāi)放閱讀框ORF1和ORF2來(lái)看，兩者在ORF1的核苷酸同源率約為83%，相對(duì)地，兩者在ORF2的核苷酸同源率更小，約為67%[2-4]。試驗(yàn)的目的是擴(kuò)增只針對(duì)PCV2進(jìn)行，選擇ORF2為靶基因設(shè)計(jì)的4條引物，從而取得了比較理想的結(jié)果。（2）試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，LAMP體系的優(yōu)化與引物不同有關(guān)，同樣的體系在引物改變后有可能不會(huì)完成核酸擴(kuò)增。因此，每當(dāng)更換一組引物，體系配比最好重新摸索。如本試驗(yàn)最終選定的這組引物所構(gòu)成的體系，在MgSO4終濃度超過(guò)2mM時(shí)，便無(wú)法繼續(xù)完成核酸擴(kuò)增。此外，擴(kuò)增失敗的原因還與內(nèi)外引物濃度比密切相關(guān)，就這組引物而言，當(dāng)內(nèi)引物濃度不大于2μM，外引物濃度不大于0.2μM時(shí)，只有當(dāng)模板濃度較大時(shí)擴(kuò)增才能發(fā)生。所以，前期不斷調(diào)試直到找到最佳反應(yīng)體系，對(duì)于后續(xù)LAMP靈敏度和特異性方面的研究是至關(guān)重要的。（3）LAMP原理表明，當(dāng)形成使核酸循環(huán)擴(kuò)增的初始莖環(huán)結(jié)構(gòu)后，多條內(nèi)引物會(huì)同時(shí)與模板作用[5]，最終形成莖環(huán)數(shù)量不同的混合產(chǎn)物。因此經(jīng)過(guò)凝膠電泳能呈現(xiàn)出LAMP特有的階梯狀條帶。在其他文獻(xiàn)中提到LAMP擴(kuò)增過(guò)程中產(chǎn)生焦磷酸鎂，將反應(yīng)管離心后能觀察到白色沉淀[6]。但本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，由于沉淀很難經(jīng)由肉眼觀察，在沒(méi)有濁度儀的情況下，這種判別方式并不理想，當(dāng)然也可能與該體系的Mg2+濃度偏低有關(guān)。除了通過(guò)凝膠電泳的方式判定結(jié)果外，還可向擴(kuò)增產(chǎn)物中添加SYBR Green I核酸染料，本試驗(yàn)中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)管內(nèi)液體呈橘黃色而陰性管呈橘紅色的情況，所以相對(duì)于單純用肉眼觀察，將反應(yīng)管置于紫外燈下觀察有無(wú)熒光會(huì)使精確度提高很多。

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S852.65+9.2

A

1007-1733(2016)05-0009-03

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