趙明禮 （齊魯動(dòng)物保健品有限公司 山東 濟(jì)南 250100）

豬化膿性鏈球菌的分離鑒定及耐藥性分析

趙明禮 （齊魯動(dòng)物保健品有限公司 山東 濟(jì)南 250100）

本試驗(yàn)利用山東某豬場(chǎng)發(fā)生臨床癥狀疑似鏈球菌疾病的豬，采集內(nèi)臟器官(肝臟、脾臟)。通過(guò)菌落形態(tài)、鏡檢、生化實(shí)驗(yàn)及PCR鑒定，篩選出1株化膿性鏈球菌，并進(jìn)行了6種抗生素的藥敏試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)分離菌株對(duì)四環(huán)素、克拉霉素、壯觀霉素和紅霉素有很強(qiáng)的耐藥性，對(duì)頭孢喹肟和青霉素高度敏感，敏感藥物是豬場(chǎng)防控豬化膿性鏈球菌的首選藥物。

豬化膿性鏈球菌 分離鑒定 藥敏試驗(yàn)

豬化膿性鏈球菌病是由豬鏈球菌感染引起的一種常見(jiàn)傳染病，其危害日益嚴(yán)重。鏈球菌可引起豬的多種疾病，侵害各年齡段的豬只，通常以敗血癥、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、淋巴結(jié)炎為主要特征，人接觸病死豬可感染發(fā)病[1]。1998-1999年夏季中國(guó)江蘇省部分地區(qū)豬群中爆發(fā)鏈球菌病，導(dǎo)致相關(guān)人員感染致死；2005年中國(guó)四川再度爆發(fā)此疾病，同樣導(dǎo)致人員死亡的現(xiàn)象，給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失的同時(shí)，嚴(yán)重危害人類(lèi)的公共衛(wèi)生安全[2]。

2015年11月中旬，山東某豬場(chǎng)發(fā)生個(gè)別的死亡現(xiàn)象，死前呼吸困難，沙啞，病死豬剖檢氣管有泡沫樣物質(zhì)，肝臟腫大，呈土黃色，脾臟硬，稍腫大，心臟幾乎沒(méi)有太大的變化，腎臟正常，為了探討該豬場(chǎng)病因，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 該豬場(chǎng)病死豬的肝臟、脾臟等病變病料。

1.1.2 培養(yǎng)基 腦心浸液培養(yǎng)基，普通肉湯培養(yǎng)基等由市售商品；

1.1.3 生化試劑 乳糖、棉子糖、甘露醇、衛(wèi)矛醇、水揚(yáng)苷、山梨醇、精氨酸、七葉苷、木糖、蔗糖和葡萄糖，由杭州天和微生物試劑有限公司。

1.1.4 主要儀器 電熱恒溫培養(yǎng)箱DRP-9162型(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)、顯微鏡(NIKON公司)、恒溫?fù)u床TH2-300(上海一恒科學(xué)儀器有限公)、潔凈工作臺(tái)SW-CJ-2FD型(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)、梯度PCR儀S1000(北京金業(yè)德祥科技有限公司)、BG-Power600i型電泳儀(西安超杰生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng) 在超凈工作臺(tái)下無(wú)菌挑取脾臟、肝臟病變部位，直接劃線接種于血平板上，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18～24h，觀察結(jié)果。在血平板上挑取菌落，接種于腦心浸液培養(yǎng)基中，放入恒溫?fù)u床內(nèi)震蕩8～10h，吸取10ul的菌液分別進(jìn)行涂片，再革蘭氏染色，鏡檢，觀察細(xì)菌的形態(tài)。

1.2.2 生化試驗(yàn) 用已滅菌的接種環(huán)蘸取少量的細(xì)菌純培養(yǎng)液分別接于生化微量管：乳糖、棉子糖、甘露醇、衛(wèi)矛醇等。置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培24h觀察結(jié)果。

1.2.3 PCR鑒定 （1）引物的設(shè)計(jì)與合成：根據(jù)GenBank中化膿性鏈球菌23sRNA基因序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，F(xiàn)(上游)：5’-TGGAGGTAGAGCACTGTTTG-3’；R(下游)：5’-TTCTCACTTCTATGCGTTCC-3’，目的片段397bp，引物委托哈爾濱博仕生物有限公司合成。（2）細(xì)菌DNA的提?。喊凑占?xì)菌DNA提取試劑盒的使用說(shuō)明來(lái)提取即可，-20℃保存。（3）PCR擴(kuò)增：以提取的細(xì)菌DNA為模板，PCR反應(yīng)體系50μl：DNA2μl，上引1μl，下引1μl，DNTP2.5μl，10×Buffer5μl，Tap酶1μl，ddH2O37.5μl；PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min，94℃變性30″，52℃退火30″，72℃延伸30″，30個(gè)循環(huán)。（4）DNA瓊脂糖凝膠電泳：取10μl的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.0%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，120V，15min。以DNA Marker DL2000為標(biāo)準(zhǔn)分子量，在紫外燈下觀察電泳結(jié)果并照相。

1.2.4 藥敏試驗(yàn) 應(yīng)用WHO推薦的改良藥敏紙片擴(kuò)散法（K-B法），按照NCCLS上的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)做：先將純培養(yǎng)的菌液計(jì)數(shù)，然后稀釋到1～1.5×108cfu/ml。取100ul滴于普通肉湯瓊脂平板中，用已滅好的涂布棒涂勻，再用滅菌尖頭鑷子將藥敏片平鋪在肉湯瓊脂平板上，并且輕輕的壓緊，每個(gè)平板上貼5個(gè)藥敏片，藥敏片一旦接觸平板，就不能在移動(dòng)。最后將貼紙片的平板底部在下，在37℃恒溫培養(yǎng)18h～24h，分析結(jié)果。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 細(xì)菌的培養(yǎng)特性

經(jīng)過(guò)37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h后，在血平板上生長(zhǎng)良好，呈溶血現(xiàn)象，中等大小，不透明，灰白色，圓形，中央隆起，邊緣整齊，光滑濕潤(rùn)(圖1)。

圖1 分離菌在血平板上的菌落形態(tài)

2.2 鏡檢結(jié)果

在固體培養(yǎng)基上鏡檢為G+，短鏈(圖2)，在液體培養(yǎng)基上鏡檢為G+，長(zhǎng)鏈(圖3)。

圖2 固體培養(yǎng)基上菌落的鏡檢結(jié)果

圖3 分離菌液的鏡檢結(jié)果

2.3 生化試驗(yàn)結(jié)果

在恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)取出已接菌的生化微量鑒定管，根據(jù)顏色的變化，按照生化試驗(yàn)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)來(lái)判斷(有的需要指示劑來(lái)進(jìn)一步的判定)。

表1 分離菌株生化試驗(yàn)結(jié)果

2.4 PCR鑒定結(jié)果

取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5～8μl，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，120V，15min。在397bp處均擴(kuò)增出目的片段，與陽(yáng)性對(duì)照片段吻合(圖4)。

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

抑菌環(huán)的大小與1994年12月版的《美國(guó)NCCLS藥敏試驗(yàn)紙片擴(kuò)散法法規(guī)》做對(duì)比來(lái)分析判定藥敏試驗(yàn)結(jié)果：

圖4 PCR擴(kuò)增結(jié)果M：DNA Marker DL2000；1：分離菌株；2：陽(yáng)性對(duì)照

表2 分離菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

（1）根據(jù)臨床剖檢變化及生化試驗(yàn)和PCR等實(shí)驗(yàn)室診斷結(jié)果，可以初步鑒定引起豬場(chǎng)死亡的主要病原是化膿性鏈球菌，由于沒(méi)有做血清學(xué)分析，具體是哪個(gè)血清型還有待于進(jìn)一步研究。（2）通過(guò)藥敏試驗(yàn)可知，對(duì)頭孢喹肟和青霉素的敏感性較高，與毛劍虹等[3]報(bào)道相符，對(duì)大多數(shù)抗生素均有耐藥性，但對(duì)紅霉素等部分抗生素有很強(qiáng)的耐藥性，在國(guó)內(nèi)董太明等[4]報(bào)道1993～1994年吉林、四川、廣州等地分離出376株化膿性鏈球菌中，對(duì)紅霉素耐藥率高達(dá)43.3%，香港地區(qū)報(bào)道2001～2002年耐藥率達(dá)32%[5]。藥敏試驗(yàn)結(jié)果基本符合當(dāng)前在大、中、小三種類(lèi)型豬場(chǎng)對(duì)仔豬進(jìn)行保健的藥物使用情況，目前保健藥物主要是頭孢類(lèi)，目的主要是防控保育期的鏈球菌的發(fā)生。

4 結(jié)論

該豬場(chǎng)發(fā)病的主要病原為豬化膿性鏈球菌，并對(duì)病豬注射頭孢喹肟或青霉毒敏感性較高的藥物，其他豬至今沒(méi)有傷亡，得到了一定的控制。

[1] 王海麗, 趙德明, 葛長(zhǎng)城等. 豬鏈球菌的分離鑒定及其生物學(xué)特性試驗(yàn)[J]. 中國(guó)獸醫(yī)雜志, 2012,48(7): 36-39.

[2] 李彩英, 岳修偉, 侯怡軒等. 上海地區(qū)31株2型豬鏈球菌的分離鑒定及其耐藥性分析[J]. 中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào), 2011,19(6): 54-59.

[3] 毛劍虹, 呂火祥. 臨床分離化膿性鏈球菌的耐藥性分析[J]. 浙江醫(yī)學(xué), 2008, 30(5): 483-484.

[4] 董太明, 蘇健, 黃震東等. 我國(guó)部分地區(qū)兒童A組鏈球菌耐藥性的研究[J]. 中華兒科雜志, 1999, 37(1): 35- 37.

[5] Ho PL, Johnson D R, Yue AWY, etal.Epidemiologic analysis of invasive and noninvasive group A streptococcal isolates in Hong Kong JC lin Microbiol, 2003, 41: 937-942.

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