劉偉民 喬良普 （山東省臨沂市河?xùn)|區(qū)畜牧獸醫(yī)局 276000）

狼尾草屬牧草遺傳多樣性的RAPD分析

劉偉民 喬良普 （山東省臨沂市河?xùn)|區(qū)畜牧獸醫(yī)局 276000）

采用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對狼尾草屬10個品種(品系)間的遺傳關(guān)系進行了分析。從100條RAPD引物中篩選出8條RAPD引物用于RAPD分析。8條RAPD引物共檢測到70個位點，其中多態(tài)位點占88.57%，Nei’s基因多樣度為0.3080，Shannon信息指數(shù)為0.5334； RAPD標(biāo)記顯示狼尾草屬牧草具有豐富的遺傳多態(tài)性?；赗APD擴增構(gòu)建相應(yīng)的Nei’s(1979)遺傳距離矩陣以及UPGMA樹圖。狼尾草屬牧草品種(系)間遺傳相似系數(shù)(GS)值為0.5102～0.9350。粗莖象草與美洲狼尾草的遺傳相似系數(shù)最小，為0.5102，表明其親緣關(guān)系最遠(yuǎn)；粗莖象草與未知品種的遺傳相似系數(shù)最大，為0.9350，說明其親緣關(guān)系最近。

狼尾草屬牧草 RAPD 遺傳多樣性

狼尾草屬(Pennisetum Rich.)牧草為一年生或多年生禾本科牧草，主要分布在熱帶和亞熱帶，全世界約有80種，多數(shù)原產(chǎn)于非洲[1]。目前我國人工栽培利用的種主要有多年生的象草(P. purpureum Schumach)和一年生的美洲狼尾草（P. americanum Rich.)及其種間雜交種。在發(fā)展草食動物生產(chǎn)中發(fā)揮了越來越重要的作用[2]。

RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA，隨機擴增多態(tài)性DNA)技術(shù)是1990年由Welsh and Mcclelland[3]和Williams[4]同時提出的一種DNA檢測技術(shù)，是繼RFLP技術(shù)之后發(fā)展起來的一種以PCR為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)技術(shù)。RAPD技術(shù)存在的局限性是：因其使用隨機引物擴增，分子基礎(chǔ)未知，致使擴增片段的基因來源不明了；反應(yīng)的影響因素太多，穩(wěn)定性差，各實驗室的結(jié)果很難重復(fù)，因此必須嚴(yán)格控制條件[5,6]。目前，RAPD分子標(biāo)記已經(jīng)應(yīng)用到了棉屬[7]、石蒜屬[8]、杜鵑屬[9]、松毛蟲屬[10]、卷柏屬[11]等植物。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

在福建省福州市和建陽市采集了10個品系共計45份的牧草樣本，根據(jù)狼尾草屬的分布狀況選取具有代表性的樣本。要求每個樣本的株間距至少在50m以上，每株采摘的鮮嫩葉片都做好標(biāo)記，塑料袋低溫保存，立即拿到實驗室，進行基因組總DNA的提取。植株的品系名、采摘地點、電泳泳道見表1。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA的提取及檢測 本試驗DNA的提取采用天根植物基因型DNA提取試劑盒，通過1%瓊脂糖凝膠電泳和上海尤尼柯公司UV-2102紫外分光光度計檢測DNA濃度和純度。DNA濃度均調(diào)至50～100ng/μl，于-20℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 RAPD引物的篩選 RAPD引物購自上海生工生物工程公司。

1.2.3 RAPD反應(yīng)條件 總體積為20μl，反應(yīng)體系中含有1.5μl Mg2+(25mM)、0.4μl dNTPs(10mM)、1.2μl primer(10uM)、0.4μl Taq DNA Polymerase(5U/μl)、2.0μl 10×PCR Buffer、2.0μl DNA，加ddH2O補足到20μl；擴增反應(yīng)在美國Bio-RAD公司Mycycler上進行，RAPD反應(yīng)程序為：95℃ 預(yù)變性5min

表1 狼尾草屬樣本的采集地點及數(shù)目

1.2.4 RAPD引物篩選 以臺灣二系狼尾草2和矮象草1為材料篩選引物，共對上海生物工程有限公司生產(chǎn)的100條隨機引物在20μL反應(yīng)體系，10pM引物濃度下進行篩選，共篩選出8條引物能擴增出條帶清晰穩(wěn)定、明亮的條帶。用篩選出的8條RAPD引物對45份材料進行PCR擴增，并對引物進行了統(tǒng)計分析。所使用引物的序號、序列及退火溫度如表2。

1.2.5 PCR產(chǎn)物電泳檢測 PCR產(chǎn)物經(jīng)含EB1.4%瓊脂糖凝膠電泳100V電壓大約1h后，在凝膠成像系統(tǒng)上拍照。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理和聚類分析 采用Popgen32，根據(jù)10個品系間的遺傳相似度構(gòu)建系統(tǒng)聚類圖譜。采用DPSv6.85分析軟件，通過類平均法UPGMA構(gòu)建45個樣本的系統(tǒng)聚類樹狀圖。

表2 引物及測試的退火溫度 (℃)

2 結(jié)果與分析

2.1 RAPD多態(tài)性分析

RAPD反應(yīng)擴增的條帶分子量一般在100～2000bp范圍內(nèi)。8個RAPD引物共擴增出70條帶，平均每個引物擴增出8.75條帶，具體如表3。

表3 狼尾草屬RAPD標(biāo)記的多態(tài)性分析

圖1 (A-B)引物176在狼尾草屬牧草材料中的RAPD圖譜

2.2 狼尾草屬牧草RAPD分子標(biāo)記遺傳差異的聚類分析

表4 10個品種遺傳多樣性水平(RAPD)

表5 10種狼尾草屬牧草的遺傳距離(對角線下)和遺傳相似性(對角線上)

圖2 狼尾草屬牧草10個品種間RAPD分析的聚類圖

2.3 狼尾草屬種間的遺傳變異

（1）利用POPGENE 32軟件分析RAPD擴增結(jié)果，得到狼尾草屬品系間遺傳一致度與遺傳距離矩陣與親緣關(guān)系聚類圖2，遺傳距離(對角線下)和遺傳相似性(對角線上)表5。結(jié)果顯示：狼尾草屬牧草品系間遺傳距離在0.0672～0.6730范圍之內(nèi)，其中粗莖象草與美洲狼尾草的遺傳距離最大為0.6730，粗莖象草與未知品系間的遺傳距離最小，只有0.0672。10種狼尾草屬植物可明顯地分為兩類：一類包括粗莖象草、細(xì)莖象草、紫象草、桂牧一號雜交象草、王草、臺灣二系狼尾草、矮象草、巨型狼尾草、未知品種；另一類只包括美洲狼尾草。對第一類又可細(xì)分為三類：矮象草單獨聚為一類；粗莖象草、細(xì)莖象草、未知品種、臺灣二系狼尾草聚為第二小類；紫象草、桂牧一號雜交象草、王草、巨型狼尾草聚為第三小類。（2）依據(jù)RAPD擴增結(jié)果，狼尾草屬牧草品系間遺傳相似系數(shù)(GS)值為0.5102～0.9350。粗莖象草與美洲狼尾草的遺傳相似系數(shù)最小，為0.5102，表明它們之間的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)；粗莖象草與未知品種的遺傳相似系數(shù)最大，為0.9350,說明其親緣關(guān)系最近。

3 討論與小結(jié)

狼尾草作為一種重要的牧草資源,在世界各地廣泛種植,并選育出許多品種,這使得狼尾草的遺傳分化越來越多樣,這種情況下單靠傳統(tǒng)的分類法已經(jīng)很難識別。DNA 指紋技術(shù)由于能鑒定出新品種的一致性和特異性,在植物新品種保護中發(fā)揮了重要作用[12]?；赗APD 分子標(biāo)記技術(shù)建立的指紋圖譜也能夠?qū)μ禺愋訢NA 片段及種族特異性差異進行鑒定。

3.1 狼尾草屬DNA提取質(zhì)量

DNA的提取是PCR反應(yīng)的第一步，DNA提取的質(zhì)量直接影響到后續(xù)反應(yīng)的進行。本試驗提取的DNA純度高，A260nm/A280nm值在1.8左右，沒有RNA及蛋白質(zhì)污染。ISSR-PCR和RAPD-PCR擴增出來的條帶清晰明亮，辨別率高，完全滿足RAPD和ISSR反應(yīng)的需要。

3.2 RAPD標(biāo)記揭示的遺傳參數(shù)

由RAPD擴增結(jié)果計算出的Nei’s基因多樣性指數(shù)和Shannon信息指數(shù)較高，多態(tài)性條帶百分率為88.57%。RAPD分析方法可檢測到較多的遺傳多態(tài)性信息。Shannon多樣性指數(shù)是使用某一擴增產(chǎn)物的存在頻率作為該位點的表型頻率來計算遺傳多樣性[13]。本研究由RAPD標(biāo)記計算出的狼尾草屬牧草的Shannon多樣性指數(shù)分別為0.4541，Nei’s遺傳多樣性指數(shù)分別為0.3086，Nei’s遺傳多樣性指數(shù)的變化趨勢與Shannon多樣性指數(shù)估測的基本相同，只是Shannon多樣性指數(shù)估計值有些偏大，這主要是統(tǒng)計方法不同造成的。因此，采用這種指數(shù)估計遺傳多樣性都是可行的。

表6 狼尾草屬10個品系間的遺傳變異分析

由表6可以得知：RAPD標(biāo)記分析10個狼尾草屬品系間基因分化系數(shù)分別為59.17%，而品系間基因分化系數(shù)表示品系間遺傳變異占總遺傳變異的百分比，因此可以判定,狼尾草屬牧草的遺傳變異主要存在于品系間。還有應(yīng)用RAPD分子標(biāo)記方法計算出的基因流分別為0.3450，小于1，表明10個品系間的基因交流還是有限的。

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