趙孟孟，孫龍，陳耀，張雅，張二芹，馮松林，張桂紅*

（1.河南農(nóng)業(yè)大學牧醫(yī)工程學院，鄭州 450002；2.華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院，國家生豬種業(yè)工程技術研究中心，廣東省動物源性人獸共患病預防與控制重點實驗室，廣州 510642）

兔抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒血清在Marc-145細胞上對病毒復制影響

趙孟孟1,2，孫龍2，陳耀2，張雅1，張二芹1，馮松林2，張桂紅2*

（1.河南農(nóng)業(yè)大學牧醫(yī)工程學院，鄭州 450002；2.華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院，國家生豬種業(yè)工程技術研究中心，廣東省動物源性人獸共患病預防與控制重點實驗室，廣州 510642）

制備兔抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗血清，探索其對病毒復制影響，通過大量培養(yǎng)豬繁殖與呼吸綜合征病毒XH-GD株病毒，高速離心后蔗糖梯度純化濃縮并免疫新西蘭大白兔，4免后采集抗血清，ELISA法測定效價。同時將抗血清與病毒共同孵育接種Marc-145細胞，熒光定量PCR和TCID50測定病毒復制情況。成功制備兔抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗血清，效價達1∶640，抗血清可以在mRNA水平和TCID50上降低病毒滴度。結果表明，兔抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗血清可以在Marc-145細胞上抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒復制。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒；抗血清；Marc-145細胞；復制；滴度

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的一種接觸性傳染病，主要特征為母豬厭食、發(fā)熱、產(chǎn)弱仔、流產(chǎn)等繁殖障礙和仔豬及各年齡段豬只呼吸道癥狀。PRRSV根據(jù)抗原性差異分為歐洲型和美洲型，我國主要流行美洲型。豬繁殖與呼吸綜合征病毒基因組主要編碼10個開放閱讀框（Open reading frame，ORF）[1-3]。從5'端到3'端依次為ORFla、ORFlab和ORF2～ORF7，ORF2～ORF7編碼病毒結構蛋白，其中ORF2～ORF5編碼病毒的糖基化蛋白，ORF6編碼膜基質(zhì)蛋白，ORF7編碼核衣殼N蛋白。ORF1a可繼續(xù)水解為Nsp1a，Nsp1b，Nsp2～Nsp6，Nsp7a，Nsp7b，Nsp8，ORFlab水解為Nsp9、Nsp10、Nsp11、Nsp12[4-6]。

PRRSV自1987年美國首次報道后[7]，1996年我國首次報道[8]，2006年暴發(fā)，對養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟損失。主要病原是Nsp2缺失30氨基酸的變異株高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒[9-11]，2015年我國出現(xiàn)新NVDC-30毒株[12]。該病毒GP5蛋白、Nsp2不斷變異，非結構蛋白變異較少[13-15]，新的亞型使該病難以診斷和防控；抗體依賴增強（ADE）效應[16]，疫苗研發(fā)受阻，缺少高效藥物和疫苗。

目前國內(nèi)主流檢測方法主要是酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測方法，主要依賴進口，成本較高，國產(chǎn)試劑穩(wěn)定性較差，批間差異大，其他診斷方法主要包括聚合酶鏈式反應（PCR）、間接免疫熒光（IFA）、病毒分離、LAMP檢測方法、免疫過氧化物酶單層細胞試驗（IPMA）方法、血清中和試驗、膠體金免疫層析方法、基因芯片技術等。其中聚合酶鏈式反應（PCR）主要針對病毒核酸，不能鑒別病毒活性，容易產(chǎn)生假陽性等問題，病毒分離方法雖準確可行，但繁瑣且用時較長。LAMP檢測方法容易產(chǎn)生假陽性，IPMA方法受人為影響因素大，血清中和試驗敏感性較差，不適用急性感染。膠體金免疫層析方法在豬繁殖與呼吸綜合征病毒上因為敏感性和特異性以及不能檢測歐洲株病毒等原因尚未大范圍推廣。基因芯片技術對設備要求較高。間接免疫熒光方法主要特異針對病毒結構蛋白和非結構蛋白，特異性和免疫原性良好，為多數(shù)實驗室采用，是官方檢測方法之一。針對N蛋白、Nsp9蛋白、Nsp7蛋白的間接免疫熒光檢測方法，僅針對特定蛋白而非全病毒，病毒感染量低則很難檢測，臨床樣品獲得的豬陽性血清可能污染其他病毒，影響檢測結果。

為更加準確、簡易診斷該病，本試驗將高致病性毒株純化后制備成油佐劑抗原免疫新西蘭大白兔，獲得抗血清，一方面避免豬源病毒污染，另一方面覆蓋多個病毒蛋白表位，減少假陰性概率，鑒定病毒抑制作用，為準確診斷豬繁殖與呼吸綜合征奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

PRRSVXH-GD種毒（GenBank登錄號EU624117）、豬陽性血清、陰性血清、兔陰性血清、Mac-145細胞由農(nóng)業(yè)部獸用疫苗創(chuàng)制重點實驗室保存；試驗動物為4只新西蘭大白兔購自廣東省實驗動物中心；高糖DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、胰酶，雙抗購自Gibco公司；細胞培養(yǎng)瓶，96孔細胞培養(yǎng)板購自Corning公司；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG，山羊抗豬IgG，異硫氰酸熒光素標記的山羊抗兔IgG，山羊抗豬IgG購自北京博奧森生物技術有限公司產(chǎn)品；弗氏完全佐劑與弗氏不完全佐劑購自Sigma公司；脫脂奶粉，TMB，4%多聚甲醛，Trition-X 100,DAB顯色液，考馬斯亮藍G-250，脫色液以及國產(chǎn)分析純試劑購自北京鼎國生物有限公司；MMLV反轉(zhuǎn)錄酶，SYBR?Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus），dNTP購自Takara公司；TRIzol購自Life Technology公司。

1.2 方法

1.2.1 病毒培養(yǎng)

將Marc-145細胞在細胞培養(yǎng)瓶中單層培養(yǎng)，生長至80%并且狀態(tài)較好時，以1個病毒感染復數(shù)（Multiplicity of infection，MOI）劑量接種PPRRV XH-GD毒株，37℃5%CO2培養(yǎng)箱中吸附1 h，PBS清洗3次，之后加入含2%胎牛血清（FBS）維持液，48 h之后反復3次凍融細胞，4℃10 000 r·min-1離心30 min，棄沉淀和細胞碎片，收集上清中病毒液，-80℃保存。

1.2.2 病毒濃縮與純化

取上述病毒培養(yǎng)液4 L，高速離心機中40 000 r·min-1速度離心5 h，參照文獻[17]制備20%、35%、50%濃度蔗糖溶液各2 mL，注射器注入10 mL離心管中，將超離后重懸液1 mL加入梯度蔗糖上層，4℃、40 000 r·min-1離心4 h，收集各層溶液至新離心管，添加PBS至10 mL，4℃、50 000 r·min-1離心1 h去蔗糖，沉淀用1 mL PBS重懸，純化后病毒用于SDS-PAGE蛋白電泳分析，并分別和等量弗氏完全佐劑與不完全佐劑混合制成免疫用抗原。

1.2.3 SDS-PAGE蛋白電泳分析

配制12%分離膠和5%積層膠，SDS-PAGE電泳檢測。將瞬時離心后樣品用微量移液器加樣，每個泳道最大上樣量為20 μL。樣品在積層膠為恒壓80 V，待染料進入分離膠后電壓加至120 V，直到染料抵達分離膠底部，斷開電源。電泳結束后，取出凝膠，做好標記，考馬斯亮藍G-250染色液緩慢震蕩染色1 h，棄去染液，將凝膠在清水中漂洗數(shù)次，加入考馬斯亮藍脫色液。為脫色完全，脫色過程需更換脫色液數(shù)次，脫色完畢后將凝膠在清水中漂洗數(shù)次，觀察分析結果。

1.2.4 免疫接種

參照文獻[18]進行免疫，每只新西蘭大白兔免疫100 μg，初免后2周二免，二免后2周三免，三免后2周四免，四免后心臟采血，37℃靜置20 min，分離血清。

1.2.5 ELISA效價測定

①發(fā)包被：用包被液將上述純化樣品稀釋至10 μg·mL-1作為抗原，于酶標板中每孔加入200 μL，蓋好，4℃條件下過夜。②洗滌：次日，除去孔內(nèi)抗原溶液，每孔加入洗滌液200 μL，震蕩1 min，甩干洗滌液，重復3～4次。③加入一抗：將血清（對照血清和免疫血清）用稀釋液作10倍倍比稀釋，然后于每孔內(nèi)分別依次加入不同稀釋倍數(shù)抗體稀釋液200 μL，蓋好，平板置37℃溫箱保溫2～3 h。④洗滌：反應完畢，洗滌液洗孔4次。甩干洗滌液。⑤加入酶標二抗：用稀釋液將酶標二抗1∶20 000倍稀釋，置37℃溫箱保溫1 h。反應完畢如前所述，洗滌液洗板4次。⑥顯色：根據(jù)TMB底物顯色試劑盒說明書配制TMB顯色工作液。每孔加入100 μL底物顯色工作液，室溫避光孵育30 min，反應產(chǎn)物呈藍色。每孔加50 μL終止液，此時藍色產(chǎn)物變?yōu)榱咙S色。⑦讀數(shù)：將酶標板置于酶標儀中，450 nm波長下讀取數(shù)據(jù)。

1.2.6 間接免疫熒光試驗（IFA）測定抗血清特異性

將PRRSV病毒XH-GD毒株以1個病毒感染復數(shù)（MO）劑量感染長至約80%的Marc-145細胞，24 h后，4%多聚甲醛固定20 min，0.25%Triton-x100通透細胞20 min，5%脫脂奶粉封閉1h之后將抗血清1: 100稀釋后作為一抗，二抗為1∶100稀釋異硫氰酸熒光素（Fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標記的羊抗兔IgG，37℃反應1 h，通過IFA試驗驗證抗血清特異性，同時設置豬血清陽性對照和各陰性血清對照，方法同上，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.7 過氧化物酶單層細胞試驗（IPMA）試驗測定抗血清特異性

將PRRSV病毒XH-GD毒株以1個病毒感染復數(shù)劑量感染長至約80%的Marc-145細胞，24 h之后，4%多聚甲醛固定20 min，0.25%Trition-x100通透細胞20 min，然后5%脫脂奶粉封閉1 h，將抗血清1∶150倍稀釋后作為一抗，二抗為1∶200稀釋辣根過氧化物酶（Horseradish peroxidase，HRP）標記的羊抗兔IgG，37℃反應1 h，通過IPMA驗證抗血清的特異性，同時設置豬血清陽性對照和各種陰性血清對照，方法同上，顯微鏡下觀察拍照。

1.2.8 抗血清與病毒孵育

將抗血清與PRRSV XH-GD株以同等劑量混合，37℃反應1 h，之后以1個MOI的劑量混合孵育接種長滿單層的Marc-145細胞，吸附2 h后棄上清，PBS清洗3次，加入2%維持液。

1.2.9 熒光定量PCR測定病毒N蛋白mRNA表達水平

接毒36 h后，細胞單層加入750 μL TRizol試劑，置于DEPC水處理1.5 mL滅菌離心管中，按照Invitrogen公司Trizol?Reagent RNA提取試劑的使用說明書操作，提取病毒總RNA。反轉(zhuǎn)錄參照寶生物工程（大連）有限公司M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶使用說明書反轉(zhuǎn)錄：RNA 9.5 μL，RNase Inhibitor 0.5 μL，5× MLV Buffer 4.0 μL，dNTPs 4.0 μL，M-MLV 1.0 μL，反轉(zhuǎn)錄引物1.0 μL?；靹蚝?，置42℃水浴1 h，冰浴2 min，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（cDNA）直接進行qPCR反應或-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

以反轉(zhuǎn)錄樣品為模板進行PCR反應，PCR體系20 μL：SYBR?Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus）（2×）10.0 μL，上、下游引物各0.4 μL，ROX Reference DyeⅡ（50×）0.4 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 6.8 μL，擴增條件：94℃預變性5 min，1個循環(huán)；94℃變性10 s，55℃退火20 s，72℃延伸30 s，40個循環(huán)。另外PRRSV N蛋白熒光定量引物為qN-F：5' AAACCAGTCCAGAGGCAAGG 3'，qN-R：5'GCAAA CTAAACTCCACAGTGTAA 3'，甘油醛-3-磷酸脫氫酶GAPDH熒光定量引物為qGAPDH-F：5'CTGCCG CCTGGAGAAACCT 3'，qGAPDH-R：5'GCTGTAG CCAAATTCATTGTCG 3'，上述引物均由上海立菲生物科技有限公司合成。

1.2.10 病毒滴度TCID50測定

在96孔細胞培養(yǎng)板上接種Marc-145細胞，待細胞生長至85%以上用樣品接種。每個樣品做10倍梯度的倍比稀釋（即10-1～10-8倍比稀釋，每個稀釋度接種8孔，100 μL·孔-1）。接毒后，將細胞板放置37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育1.5 h。孵育完畢后棄去病毒液，補入含2%新生牛血清的DMEM，放置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。連續(xù)觀察2～7 d，記錄每個稀釋度發(fā)生細胞病變孔數(shù)，重復3次求平均值，按照Reed-Muench法計算各樣品TCID50。

1.2.11 數(shù)據(jù)分析

熒光定量數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt方法計算,熒光定量和TCID50數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism 5軟件分析，*代表P＜0.05，差異顯著，具有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 細胞病變與離心結果

PRRSV接種到長滿單層的Marc-145細胞，36 h后Marc-145細胞出現(xiàn)病變，與對照組相比，主要表現(xiàn)為細胞聚集，破裂，分布不均勻，結果見圖1。病毒濃縮后經(jīng)SDS-PAGE電泳分析結果見圖2，可見與病毒結構蛋白大小相似的條帶，表明病毒純化結果較好，與預期一致，其中病毒結構蛋白主要集中在15～30 ku。

圖1 Marc-145細胞病變圖Fig.1CPE of Marc-145 cells

2.2 抗血清效價與間接免疫熒光試驗結果

間接ELISA測定結果表明抗血清效價為1∶640，間接免疫熒光試驗結果表明以豬陽性血清對照為一抗的細胞出現(xiàn)可見綠色熒光，以豬陰性血清為一抗的對照無可見熒光，以兔高免血清為一抗的細胞出現(xiàn)綠色熒光，主要圍繞在細胞核附近，以兔陰性血清為一抗的細胞樣品無綠色熒光。結果表明陰陽對照組成立，制備的抗血清可以和病毒感染的Marc-145反應，結果見圖3。

2.3 IPMA試驗結果

IPMA試驗結果表明以豬陽性血清對照為一抗細胞出現(xiàn)可見棕色陽性細胞，以豬陰性血清為一抗對照無可見棕色陽性細胞，以兔陽性血清為一抗細胞樣品出現(xiàn)棕色陽性細胞，以兔陰性血清為一抗細胞樣品無棕色陽性細胞。結果表明陰陽對照組成立，結果可靠，制備的抗血清可和病毒感染的Marc-145反應結果見圖4。

2.4 TCID50變化

高免血清和病毒孵育結束后接毒Marc-145細胞，36 h后收集細胞上清作TCID50試驗，與陰性血清孵育的對照組相比，孵育高免血清Marc-145細胞上病毒滴度低于孵育陰性血清細胞，統(tǒng)計學差異顯著，結果見圖5。

2.5 PRRSV N蛋白mRNA表達水平變化

高免血清和病毒孵育結束后接毒Marc-145細胞，36 h后收集單層細胞作熒光定量試驗，與陰性血清孵育的對照組相比，孵育高免血清的Marc-145細胞上的病毒N蛋白mRNA水平低于孵育兔陰性血清細胞，統(tǒng)計學差異顯著，M結果見圖16。

圖2 純化病毒粒子的SDS-PAGE電泳結果Fig.2Results of SDS-PAGE of purified virus virions

圖3 抗血清間接免疫熒光圖結果Fig.3IFA result of hyper-immune serum

圖4 抗血清IPMA結果Fig.4IPMA result of hyper-immune serum

圖5 病毒滴度差異Fig.5Variance of viral titer

圖6 N蛋白mRNA水平變化Fig.6mRNA level of N gene

3 討論與結論

本試驗將高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒增殖后，經(jīng)乳化制成油佐劑抗原多次免疫兔子，獲得兔抗PPRSV效價達1∶640抗血清，該抗血清可識別感染細胞天然病毒，與病毒孵育后可抑制病毒在細胞中復制，為建立準確、快速、敏感的PRRSV檢測方法并確定檢測試劑奠定基礎。

將全病毒免疫兔子后產(chǎn)生針對PRRSV抗體，病毒內(nèi)部部分蛋白在機體內(nèi)產(chǎn)生中和抗體抑制病毒，中和抗體抑制PRRSV活性，抑制病毒在Marc-145中復制。該蛋白可能是GP5蛋白，也可能是其他中和蛋白或多種蛋白混合物，也可能是抗血清封閉受體結合位點，阻礙病毒入侵[19]。

IFA和IPMA兩種方法的靈敏度存在差異，IFA靈敏度高于IPMA，可能與各方法顯色差異相關，比較后可知IFA發(fā)熱靈敏度略高于IPMA方法。

特異性抗血清制備方法上，一般抗原制備純度決定特異性優(yōu)劣，如果純化不完全，會降低抗血清特異性，制備單克隆抗體同理[20]。無高純度抗原，不利于制備高純度免疫產(chǎn)物。

在大量制備病毒過程中，病毒滴度影響病毒完整性或免疫原性，因此應保持較好細胞狀態(tài)以利病毒復制，另外收毒時間最好控制在一半細胞出現(xiàn)病變時，一般為36或48 h，此時滴度處于較高水平，細胞較少脫落，比較適宜收毒。

在測定抗血清對病毒復制影響方面，本試驗采用TCID50結合熒光定量方法測定PRRSV N蛋白mRNA水平，結果表明均明顯抑制，由于熒光定量方法敏感，操作要求較高，因此在操作過程中應多次重復試驗。如果病毒滴度差異較大，通過TCID50可比較差異。如果差異較小，因操作問題無法獲得明顯差異，需通過噬斑試驗準確測定病毒粒子數(shù)目得出統(tǒng)計學差異。

本試驗得到的抗血清可在體外抑制PRRSV復制，在疾病發(fā)生過程中緊急接種抗血清可控制疾病蔓延。如果證明有效，分離有效成分，可在一定程度上抑制PRRSV傳播。設計針對病毒蛋白的藥物和制劑將成為未來控制PRRSV的新方向[21-24]。

本試驗成功制備兔抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒的抗血清，可識別感染細胞的天然病毒，也可中和病毒，為建立診斷方法奠定基礎。

[1]Andreyev V G,Wesley R D,Mengeling W L,et al.Genetic variationandphylogeneticrelationshipsof22porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV)field strains based on sequence analysis of open reading frame 5[J].Arch Virol,1997,142(5):993-1001.

[2]Kim H S,Kwang J,Yoon I J,et al.Enhanced replication of porcine reproductive and respiratory syndrome(PRRS)virus in a homogeneous subpopulation of MA-104 cell line[J].Arch Virol, 1993,133(3-4),477-483.

[3]Cavanagh D.Nidovirales:a new order comprising Coronaviridae and Arteriviridae[J].Arch Virol,1997,142(3):629-633.

[4]den Boon J A,Faaberg K S,Meulenberg J J,et al.Processing and evolution of the N-terminal region of the arterivirus replicase ORF1a protein:identification of two papainlike cysteine proteases [J].J Virol,1995,69(7):4500-4505.

[5]Snijder E J,Meulenberg J J.The molecular biology of arteriviruses [J].J Gen Virol,1998,79(5):961-979.

[6]Meulenberg J J,Petersen en Besten A,de Kluyver E,et al. Molecular characterization of Lelystad virus[J].Vet Microbiol, 1997(1-4),55:197-202.

[7]Benfield D A,Nelson E,Collins J E,et al.Characterization of swine infertility and respiratory syndrome(SIRS)virus(isolate ATCC VR-2332)[J].J Vet Diagn Invest,1992,4(2):127-133.

[8]郭寶清,陳章水,劉文興,等.從疑似PRRS流產(chǎn)胎兒分離PRRSV的研究[J].中國預防獸醫(yī)學報,1996(2):1-5.

[9]Tian K,Yu X,Zhao T,et al.Emergence of fatal PRRSV variants: unparalleled outbreaks of atypical PRRS in China and molecular dissection of the unique hallmark[J].PLoS One,2006,2(6):e526.

[10]Zhou L,Chen S,Zhang J,et al.Molecular variation analysis of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in China[J]. Virus research,2009,145:97-105.

[11]Zhou L,Zhang J,Zeng J,et al.The 30-amino-acid deletion in the Nsp2 of highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus emerging in China is not related to its virulence [J].J Virol,2009,83(10):5156-5167.

[12]Zhou L,Wang Z,Ding Y,et al.NADC30-like Strain of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,China[J].Emerg Infect Dis,2015,21(12):1957-1936.

[13]李嘉彬,趙孟孟,李玉谷,等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株FS的分離鑒定與全基因組序列分析[J].中國畜牧獸醫(yī),2012, 39(3):60-64.

[14]Zhao M M,Ning Z Y,Wang H et al.Sequence analysis of NSP9 gene of 25 PRRSV strains from Guangdong province,subtropical southern China[J].Virus Genes,2013,46(1):88-96.

[15]Rascon-Castelo E,Burgara-Estrella A,Mateu E,et al.Immunological features of the non-structural proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J].Viruses,2015,7(3):873-886.

[16]Yoon K J,Wu L L,Zimmerman J J,et al.Antibody-dependent enhancement(ADE)of porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV)infection in pigs[J].Viral Immunol 1996, 9(1):51-63.

[17]楊立清,張晉,盧立新,等.蔗糖梯度離心法純化Vero細胞乙腦疫苗的純度分析及與層析法的比較[J].微生物學免疫學進展, 2004,32(4):11-13.

[18]鄧大旺,陳麗萍,崔健揚.淺析兔抗豬高致病性藍耳病高免血清的制備和鑒定[J].中國畜牧獸醫(yī)文摘,2012,28(5):43-46.

[19]曹宗喜,焦培榮,林哲敏,等.Marc-145細胞CD163基因克隆及其真核表達質(zhì)粒構建[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報,2013,44(6):28-31.

[20]趙孟孟,張二芹,馮松林,等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒NSP9蛋白單克隆抗體制備與鑒定[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報,2016,47 (7):63-69.

[21]Cong Y,Huang Z,Sun Y,et al.Development and application of a blocking enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)to differentiate antibodies against live and inactivated porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J].Virology,2013,444:310-316.

[22]Liu H,Wang Y,Duan H,et al.An intracellularly expressed Nsp9-specificnanobodyinMARC-145cellsinhibitsporcine reproductive and respiratory syndrome virus replication[J].Vet Microbiol,2015,181:252-260.

[23]Gao L,Zhang W W,Sun Y P,et al.Cryptoporus volvatus extract inhibits porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)in vitro and in vivo[J].PLoS One,2013,8(5):e63767.

[24]Xie J,Zhou H,Cui J,et al.Inhibition of porcine reproductive and respiratory syndrome virus by specific siRNA targeting Nsp9 gene

Effect of antiserum of PRRSV on the replication of PRRSV in Marc-145 cells/

ZHAO Mengmeng1,2,SUN Long2,CHEN Yao2,ZHANG Ya1,ZHANG Erqin1,FENG Songlin2,ZHANGGuihong2(1.Schoolof AnimalScienceandVeterinaryMedicin,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China;2.Key Laboratory of Zoonosis Prevention and Control of Guangdong Province,National Engineering Research Center for Breeing Swine Industry,School of Veterinary,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China)

In order to verify whether hyper-immune serum of PRRSV has an influence on the replication of PRRSV,hyper-immune serum was prepared,PRRSV XH-GD strain were cultured,then centrifuged with high speed,the purified viruses were used to immunize the New Zealand rabbits to raise antibody.New Zealand rabbits were immunized intraperitoneally(i.p.)plus Freund's complete adjuvant.Antiserum was collected from the rabbits that had been placed under terminal halothane anesthesia.Antiserum titer was 1：640,the antiserum was incubated with virus,then qPCR and TCID50 used to evulate the titer of virus.The results showed that antiserum could inhibit the replication of PRRSV at the mRNA lever,so hyper-immune serum of PRRSV was able to inhibit the replication ofPRRSV in Marc-145 cells.

PRRSV;hyper-immune serum;Marc-145 cells;replication;titer

S852.6

A

1005-9369（2016）11-0052-07

時間2016-12-1 14:48:30[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20161201.1448.020.html

趙孟孟,孫龍,陳耀,等.兔抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒血清在Marc-145細胞上對病毒復制的影響[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報,2016, 47(11)：52-58.

Zhao Mengmeng,Sun Long,Chen Yao,et al.Effect of antiserum of PRRSV on the replication of PRRSV in Marc-145 cells [J].Journal of Northeast Agricultural University,2016,47(11)：52-58.(in Chinese with English abstract)

2016-09-13

國家自然科學基金項目（31272564）；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項經(jīng)費（201203039）；國家生豬現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系項目（CARS-36）；國家重點研發(fā)計劃課題（2016YFD0500707）

趙孟孟（1986-），男，博士，研究方向為豬繁殖與呼吸綜合征病毒的致病機理。E-mail:zhaomengmeng502@163.com

*通訊作者：張桂紅，教授，研究方向為動物傳染病，E-mail:guihongzh@scau.edu.cn