蔡佳文，金曉霞*，于麗杰，崔柏楊，魏迅，董延龍

（1.哈爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，植物生物學(xué)黑龍江省高校重點實驗室，哈爾濱 150025；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝分院，哈爾濱 150069）

龍葵E2泛素結(jié)合酶基因SorUBC克隆及表達特性分析

蔡佳文1，金曉霞1*，于麗杰1，崔柏楊1，魏迅1，董延龍2

（1.哈爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，植物生物學(xué)黑龍江省高校重點實驗室，哈爾濱 150025；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝分院，哈爾濱 150069）

對龍葵SorUBC基因克隆并分析其在多種非生物脅迫處理下表達特性，為E2泛素結(jié)合酶在植物逆境脅迫中應(yīng)用提供理論依據(jù)。試驗采用電子克隆結(jié)合RT-PCR方法從龍葵中克隆得到泛素E2結(jié)合酶UBC基因編碼區(qū)序列，命名為SorUBC，登陸GenBank，編號：KU233684。SorUBC基因編碼區(qū)全長888 bp，編碼295個氨基酸。進化樹分析顯示，該基因編碼氨基酸序列與馬鈴薯、番茄同源性最高，為95%，其次是煙草，為91%。該蛋白在第266～284氨基酸位具有1個跨膜螺旋區(qū)域，泛素化位點預(yù)測表明其含有8個泛素化位點。利用熒光定量PCR技術(shù)分析SorUBC基因在龍葵各器官表達特征和不同非生物脅迫處理下（干旱、鹽、堿、高溫和低溫）根部和葉片表達特性，同時測定龍葵葉片生理響應(yīng)。結(jié)果表明，SorUBC基因表達具有組織差異性，在葉片和果實中表達量較高。非生物脅迫處理（干旱、鹽、堿、高溫和低溫）后根部和葉片基因表達情況顯示該基因存在早期（3或5h）應(yīng)答上調(diào)表達，且根部與葉片基因表達量和變化趨勢差異顯著，根部表達量變化比葉片顯著，推測SorUBC基因在龍葵早期響應(yīng)干旱、鹽、堿、高溫和低溫非生物脅迫中起調(diào)控作用。生理特征數(shù)據(jù)表明，在干旱、鹽和高溫脅迫中龍葵葉片MDA含量變化差異不顯著，POD和SOD活性總體呈先降后升趨勢，說明其在脅迫后期（9 h）對活性氧造成的損傷起緩解作用。

龍葵；SorUBC；克隆；表達分析；非生物脅迫；生理特性

龍葵（Solanum nigrum L.）為茄科一年生草本植物，在中國分布廣泛，富含生物堿，全株入藥，且抗性較強，是我國發(fā)現(xiàn)的Cd超積累植物[1-2]，無論苗期或成熟期，均表現(xiàn)鎘超積累植物具備的積累性和耐性特征[3]，是一種具有重金屬修復(fù)潛力的野生植物資源。龍葵干旱適應(yīng)性強[4]，生長期極少有蟲害等[5]特性，是研究植物抗逆機制理想基因庫。

植物對非生物脅迫環(huán)境作出及時有效響應(yīng)對其生存至關(guān)重要。目前已確定多種調(diào)節(jié)干旱、鹽等脅迫相關(guān)基因[6-10]，其中，泛素/26S蛋白酶體途徑是目前已知最重要，有高度選擇性的蛋白質(zhì)降解途徑。其通過調(diào)節(jié)功能蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)或降解不正常蛋白，調(diào)節(jié)多種代謝過程。泛素是一種高度保守且有76個氨基酸組成的小分子蛋白，分子質(zhì)量約8.5 ku，廣泛存在于幾乎所有真核生物體內(nèi)[11]。泛素化是指泛素在一系列酶作用下對靶蛋白特異性修飾的過程，其中涉及E1泛素激活酶、E2泛素結(jié)合酶和E3泛素連接酶[12]，底物特異性主要取決于E2泛素結(jié)合酶（UBC）和E3泛素連接酶[13]。研究表明，該途徑廣泛參與植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[14-16]、光形態(tài)建成[17-19]、自交不親和反應(yīng)[20-22]等生長發(fā)育過程，并與植物對抗各種外界環(huán)境脅迫反應(yīng)相關(guān)[23-24]。

目前，對泛素E3連接酶研究較多，而對E2泛素結(jié)合酶研究相對較少，Wan等報道E2泛素結(jié)合酶（UBCs）在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育等多方面發(fā)揮重要作用，而在植物遭受非生物脅迫下響應(yīng)情況還有待進一步研究[25]。王安邦等發(fā)現(xiàn)香蕉泛素結(jié)合酶MaUCE2基因表達受非生物脅迫誘導(dǎo)[26]。Chung等發(fā)現(xiàn)過表達綠豆泛素結(jié)合酶VrUBC1通過改變ABA相關(guān)基因表達增強轉(zhuǎn)基因擬南芥滲透脅迫抗性[27]。小白菜BcUBCE2基因在銅脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用[28]。大豆泛素E2結(jié)合酶基因GmUBC2在擬南芥中過表達，可明顯提高擬南芥對干旱和高鹽抗性[12]；大豆GmUBC13基因在參與植物對干旱耐受作用時起正調(diào)控作用[29]；甜瓜CmUBC基因響應(yīng)干旱和鹽脅迫[30]等，而泛素E2結(jié)合酶UBC基因在茄科植物龍葵中作用卻未見報道。

本研究利用擬南芥泛素E2結(jié)合酶基因UBC32 mRNA全長序列信息，從番茄基因組數(shù)據(jù)庫中釣取番茄泛素結(jié)合酶E2基因編碼區(qū)序列信息，根據(jù)該序列信息設(shè)計特異引物，利用RT-PCR技術(shù)克隆得到龍葵E2泛素結(jié)合酶SorUBC基因，預(yù)測其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能。利用熒光定量PCR技術(shù)檢測龍葵SorUBC基因組織器官表達特征，同時結(jié)合生理響應(yīng)分析其在各種非生物脅迫處理（鹽堿、干旱、高溫、低溫）下表達特性，旨在揭示龍葵E2泛素結(jié)合酶基因SorUBC時空表達及其參與非生物脅迫響應(yīng)表達特征，為進一步開發(fā)和利用龍葵SorUBC基因提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理

本試驗以野生型龍葵為試驗材料，草炭土培育，取成株期葉片作SorUBC基因克隆。取5葉期植株經(jīng)鹽、堿、干旱、高溫、低溫處理，具體方法見表1，獲取處理后不同時間段葉片和根部，立即液氮冷凍，存于-80℃，用于RNA提取。

表1 處理溶液濃度及溫度Table 1Concentration and temperature of treatment solutions

1.2 SorUBC克隆及測序分析

根據(jù)擬南芥泛素結(jié)合酶E2基因UBC32（XM_ 002882991.1）mRNA全長序列，從番茄基因組數(shù)據(jù)庫（https://solgenomics.net/）中釣取番茄泛素結(jié)合酶E2基因UBC（Solyc12g099310.1.1）基因信息，根據(jù)該基因信息設(shè)計特異引物，擴增龍葵SorUBC基因序列，特異引物序列如下：

SorUBC-F：5'ATGGCGGAAGACAAGTATAAT CT 3'；

SorUBC-R：5'TACGATTCATCCATAAAGACA GC 3'。

試驗使用TRlzon（康為世紀）提取龍葵成株總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TOYOBO）合成第一條cDNA，以該條鏈為模版，SorUBC-F/SorUBC-R為上下游引物作PCR擴增。將擴增產(chǎn)物凝膠電泳并回收產(chǎn)物與pUC-T載體（康為世紀）相連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α，經(jīng)藍白斑篩選，選取白斑克隆，再次對菌液PCR和雙酶切初步鑒定，測序分析。

1.3 SorUBC基因生物信息學(xué)分析

根據(jù)SorUBC氨基酸序列，利用NCBI-blast（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）在線分析軟件比對其與其他植物序列，為進一步研究SorUBC蛋白氨基酸序列相似性及進化關(guān)系，利用軟件DNAMAN對序列多重比對，再用軟件MEGA 4構(gòu)建系統(tǒng)進化樹；利用TMPRED分析蛋白質(zhì)跨膜區(qū)；利用UbiPred預(yù)測基因編碼氨基酸存在的泛素化位點；利用SOPMA預(yù)測氨基酸二級結(jié)構(gòu)[31-32]。

1.4 SorUBC基因在不同組織器官中的表達分析

根據(jù)龍葵SorUBC的cDNA序列設(shè)計UBC片段上下游引物C-Y2（見表2）。取成株期植株不同部位：根、莖、葉、花、果實，用于基因組織器官表達分析。提取各組織器官RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以龍葵β-actin基因為內(nèi)參基因，使用上下游引物C-Y2各0.5 μL，cDNA 1 μL，40個循環(huán)熒光定量PCR。

表2 引物名稱及序列Table 2Names and sequences of the primers

1.5 SorUBC基因在不同非生物脅迫處理下的表達分析

對5葉期龍葵作干旱、鹽、堿、高溫及低溫處理，分別在處理后0、1、3、5、9、12 h取植株根部和葉片，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用上下游引物C-Y2熒光定量PCR表達分析。

1.6 干旱、鹽、高溫脅迫下龍葵生理指標測定

對成株期龍葵經(jīng)干旱、鹽及高溫處理（濃度同1.5），分別在0、1、3、5、9 h取植株葉片，測定部分生理活性物質(zhì)（MDA、POD、SOD）含量。丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸法測定[33]；過氧化物酶（POD）活性采用愈創(chuàng)木酚顯色法測定；超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮藍四唑光還原法測定[34]。以上試驗每組重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 龍葵SorUBC基因編碼區(qū)全長克隆及測序分析

提取龍葵葉片RNA（見圖1），反轉(zhuǎn)錄后以cDNA為模板，利用SorUBC-F/R為引物PCR擴增，使用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測預(yù)期大小條帶（見圖2）。將PCR產(chǎn)物回收，連接pUC-T載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α，經(jīng)藍白斑篩選后，挑取白斑培養(yǎng)，菌液PCR，雙酶切鑒定（見圖3），表明目的基因已連接到克隆載體上，將獲得陽性克隆送往上海生工測序，獲得編碼區(qū)序列，全長888 bp，登陸GenBank，編號為：KU233684。

圖1 龍葵RNA提取Fig.1Extraction of Solanum nigrum L.RNA

2.2 龍葵SorUBC氨基酸同源性分析及系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

將克隆得到的cDNA序列作生物信息學(xué)分析，通過NCBI的ORF Finder程序分析，結(jié)果顯示開放讀碼區(qū)為888 bp，編碼295個氨基酸（見圖4），蛋白分子質(zhì)量為25 ku，理論等電點pI=5.23。

圖2 SorUBC基因全長cDNA序列電泳結(jié)果Fig.2Agarose gel electrophoresis of the cDNA sequence of SorUBC gene

圖3 pUCT-SorUBC雙酶切鑒定Fig.3Identification of pUCT-SorUBC double digested

根據(jù)已克隆龍葵SorUBC基因氨基酸序列在NCBI上與其他植物同源氨基酸序列比對分析，結(jié)果表明（見圖5），龍葵SorUBC氨基酸序列與馬鈴薯、番茄一致性為95%，與煙草一致性為91%，與葡萄、芝麻、麻風(fēng)樹、梅、紅景天等植物為80%以上，說明SorUBC基因在這些植物中高度保守。

將上述氨基酸序列比對，構(gòu)建植物生成進化樹，分析龍葵SorUBC蛋白與其他物種相關(guān)蛋白進化關(guān)系，結(jié)果表明（見圖6），龍葵SorUBC與馬鈴薯、番茄同屬1個分支；麻風(fēng)樹和梅UBC屬同1個分支；葡萄、芝麻、紅景天UBC屬同1個分支，其中芝麻和紅景天進化關(guān)系較近。

圖4 SorUBC編碼區(qū)核苷酸序列及氨基酸序列Fig.4Nucleotide and amino acid sequences of SorUBC coding regions

2.3 龍葵SorUBC蛋白結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

2.3.1 SorUBC蛋白跨膜螺旋結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用TMPRED預(yù)測SorUBC蛋白跨膜螺旋（見圖7、8），結(jié)果表明該蛋白具有1個跨膜螺旋區(qū)域，其相應(yīng)氨基酸位置是第266～284位。

2.3.2 SorUBC蛋白泛素化位點預(yù)測

利用UbiPred在線預(yù)測分析SorUBC中泛素化位點，發(fā)現(xiàn)SorUBC有8個泛素化位點，位置分別為第5、9、14、21、73、91、160、172位氨基酸。說明SorUBC蛋白可能通過相應(yīng)位點泛素化發(fā)揮作用（見表3）。

2.3.3 SorUBC蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用SOPMA預(yù)測SorUBC蛋白二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果見圖9。結(jié)果表明SorUBC蛋白二級結(jié)構(gòu)中，h占25.91%，e占18.60%，t占5.32%，c占50.17%。由此推測，SorUBC蛋白含有大量α-螺旋和無規(guī)則卷曲。

2.4 龍葵SorUBC基因組織特異性表達分析

利用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測SorUBC基因在龍葵不同組織器官表達量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該基因在龍葵根、莖、葉、花和果實中均有表達，且差異較大，SorUBC基因在葉片與果實中表達量最高，莖中表達量為5倍，花中表達量為3倍，根中表達最弱，是葉片和果實中的1/10。說明SorUBC基因在龍葵中的表達具有組織特異性（見圖10）。

2.5 不同非生物脅迫處理下，龍葵SorUBC基因表達分析

采用實時熒光定量PCR技術(shù)，對成株期龍葵經(jīng)鹽、堿、干旱、高溫及低溫處理，檢測不同非生物脅迫處理下SorUBC基因在龍葵根部和葉片表達特性。結(jié)果表明，不同脅迫處理下SorUBC基因表達受不同程度影響（見圖11）。低溫處理下，從1 h起，SorUBC基因葉片表達量逐漸下降，僅12 h有一次上升，但總體含量低于對照組；而根中表達量呈先增后降趨勢，5 h時達最大值，是對照組的6.7倍（見圖11A）。高溫處理下，葉基因表達量明顯低于對照組；而根中表達量在處理5 h后已顯著上調(diào)表達，處理12 h時SorUBC表達量達最大，為對照組的30倍（見圖11B）。

圖5 龍葵SorUBC與其他物種UBC氨基酸序列保守區(qū)域多重比對Fig.5Alignment of conserved domains of SorUBC between Solanum nigrum L.and other plants

圖6 UBC氨基酸序列系統(tǒng)進化樹Fig.6Phylogenetic tree of UBC amino acid sequences

圖7 SorUBC蛋白跨膜區(qū)域預(yù)測Fig.7Predicted transmembrane domains of SorUBC protein

圖8 TMHMM預(yù)測SorUBC蛋白跨膜結(jié)構(gòu)Fig.8SorUBC transmembrane regional prediction by TMHMM

表3 SorUBC泛素化位點預(yù)測Table 3Ubiquitinated site analysis on SorUBC

干旱脅迫下，SorUBC基因處理組葉片表達量一直低于對照組；而根部表達量在處理3 h時達到最大，為對照的9倍，隨后顯著下調(diào)后又上升，在12 h上調(diào)為3 h表達量的1/17（見圖11C）。鹽脅迫下，1 h時葉片中SorUBC表達量下降，處理3 h達到最低后又顯著上調(diào)，9 h葉表達量達到最大，是對照2倍；在根部該基因分別在3和9 h時達最大值，為對照的1.8倍和2倍，而在12 h表達量最低（見圖11D）。堿處理下，葉片中SorUBC表達量除9 h與對照基本持平外，表達量均下調(diào)；在根部，該基因表達量除在3 h有一次下調(diào)外，總體呈先升后降趨勢，9 h達到最大值，為對照組的2.5倍（見圖11E）。以上結(jié)果表明SorUBC基因在以上非生物脅迫處理下均存在不同早期應(yīng)答反應(yīng)，分別在3或5 h表達上調(diào)，且根部與葉片基因表達量和變化趨勢差異顯著，根部SorUBC基因表達變化比葉中更明顯，從基因表達量變化看SorUBC基因參與龍葵在非生物脅迫中的應(yīng)答反應(yīng)過程。

圖9 SorUBC蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.9Secondary structure prediction of SorUBC protein

圖10 龍葵SorUBC基因在不同器官中的表達Fig.10Expression of SorUBC in different organs of Solanum nigrum L.

圖11 非生物脅迫下龍葵SorUBC基因在根部和葉片的表達Fig.11Expression of SorUBC gene in roots and leaves of Solanum nigrum under abiotic stress

2.6 不同非生物脅迫對龍葵葉片生理特性影響

圖12A顯示干旱、高溫和鹽脅迫后龍葵MDA變化情況。干旱脅迫中，MDA含量總體呈先降后升再降趨勢，5 h時達到最大值，受損傷程度加劇。高溫脅迫中，MDA含量在1 h時含量較高，之后略有下降，且變化不顯著。鹽脅迫處理中，MDA含量呈先升后降趨勢，處理1 h時，MDA含量略微增加，膜脂過氧化程度增加。

圖12 非生物脅迫下龍葵葉片生理指標測定結(jié)果Fig.12Determination results of physiological index of leaves of Solanum nigrum under abiotic stress

過氧化物酶POD和超氧化物歧化酶SOD在植物中廣泛存在，是防御系統(tǒng)保護酶。圖12B顯示，干旱脅迫中，POD活性呈下降趨勢，5 h時葉中表達量最低，為對照組的1/5，之后活性增強，9 h時為5 h時的5倍，說明脅迫初期植株適應(yīng)性較差，后期POD活性增強，緩解干旱對植株活性氧的傷害。高溫脅迫中，POD活性呈先降后升趨勢，9 h達到最大值，為對照的1.3倍。POD活性在鹽脅迫處理中變化不明顯。從圖12C可知，龍葵葉片SOD活性總體呈先降后升趨勢。干旱、高溫脅迫中，SOD活性較對照組顯著下降，干旱脅迫5 h時與對照組相比下降5倍，之后活性略有上升，且均未高于對照組。鹽脅迫中，3 h時達最小值，為對照的1/2，之后SOD活性顯著上升，9 h時達到最大值，為對照組的1.32倍。三種處理中，SOD活性均顯著低于對照。以上說明非生物脅迫初期，龍葵過氧化物酶POD和超氧化物歧化酶SOD活性不高，植株適應(yīng)調(diào)節(jié)能力較差，對植株造成一定傷害；脅迫后期（9 h），兩種酶活性增加，對活性氧造成的損傷起緩解作用。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)植物體內(nèi)多種泛素結(jié)合酶基因在各器官中均有表達，例如E2泛素結(jié)合酶TaE2基因在小麥根、莖、葉和種子中均有表達[35]；SUMO E3連接酶SIZ1和E3泛素連接酶AtSAP5，在擬南芥根、莖、葉、花中均有表達[36-37]。Suzuki等研究也表明，E2泛素結(jié)合酶基因在調(diào)節(jié)植物光形態(tài)建成[38]、胚胎及器官形成[39]、維管束發(fā)育[40]等方面起一定作用。本研究在克隆獲得龍葵E2泛素結(jié)合酶SorUBC基因編碼區(qū)全長基礎(chǔ)上，通過熒光定量PCR技術(shù)測定龍葵不同組織器官SorUBC基因表達量，結(jié)果表明各組織中均有表達且差異顯著，SorUBC編碼的蛋白在龍葵各組織中普遍存在，且在葉片和果實中表達量顯著高于其他器官。

植物在生長發(fā)育過程中，受各種自然條件因素影響，當(dāng)這些因素超過一定范圍時即對植物構(gòu)成脅迫，以往研究表明泛素蛋白酶體途徑在植物受到非生物脅迫時發(fā)揮重要作用[41-43]。而E2泛素結(jié)合酶在泛素化過程中扮演重要角色，提高植物應(yīng)對不良環(huán)境能力。如大豆GmUBC2基因在擬南芥中過表達，明顯提高擬南芥對干旱和高鹽抗性[12]；甜瓜CmUBC基因響應(yīng)干旱和鹽脅迫[29]。本研究中，葉片在低溫、高溫和干旱處理后SorUBC基因處于下調(diào)狀態(tài)，在鹽、堿處理后呈下調(diào)后上調(diào)又下降趨勢。而根部在這些脅迫中SorUBC表達量大致呈兩次上升過程（除低溫、堿脅迫為一次上升過程）。徐東北等研究表明，GmUBC13基因在參與植物對干旱耐受作用時起正調(diào)控作用[30]；而本研究中，干旱處理下（見圖11C），根部SorUBC基因表達量在脅迫初期（3 h）呈一次明顯上升，表達量總體上與對照組相比呈上升趨勢。鹽堿脅迫下（見圖11D、E），基因表達量與低溫、高溫和干旱相比較低，鹽脅迫下根部SorUBC基因表達量在3、9 h與對照組相比處于上調(diào)狀態(tài)，堿脅迫在5、9、12 h處于基因上調(diào)表達狀態(tài)，說明SorUBC基因不同程度響應(yīng)干旱、鹽堿與高、低溫脅迫處理。Wan等研究表明，花生在受到由干旱、高鹽、低溫、施用外源ABA等引起的生理水脅迫時AhUBC2表達量增加[25]；而本研究中，低溫下（見圖11A）龍葵根部SorUBC基因表達量在5 h脅迫處理下呈最高值；高溫下（見圖11B），SorUBC基因隨處理時間變化表達量有所變化，且與對照組比較明顯呈上調(diào)趨勢。推測SorUBC基因可能在以上非生物脅迫中發(fā)揮作用，該基因是否具有以上功能需深入研究。

本試驗還選取高溫、干旱和鹽三種非生物脅迫處理龍葵檢測其生理響應(yīng)。MDA是膜脂過氧化最終分解產(chǎn)物，其細胞內(nèi)濃度表示脂質(zhì)過氧化強度和膜系統(tǒng)傷害程度，是逆境生理中重要指標[44]。POD和SOD是植物防御脅迫過程中重要保護酶。三種脅迫處理中，MDA含量變化差異不顯著，植物在高溫、干旱和鹽脅迫處理中未受明顯傷害。POD和SOD活性總體呈先降后升趨勢，說明其參與龍葵自身修復(fù)過程，脅迫后期（9 h）對活性氧造成損傷起緩解作用。

4 結(jié)論

本研究從龍葵中克隆到一個泛素結(jié)合酶E2基因SorUBC，SorUBC基因在馬鈴薯、番茄、煙草等植物中保守性較高。生物信息學(xué)預(yù)測表明該蛋白具有1個跨膜螺旋區(qū)域，其相應(yīng)氨基酸位置是第266～284位，且該蛋白存在8個泛素化位點，可能通過相應(yīng)位點泛素化來發(fā)揮泛素結(jié)合酶E2功能。

泛素結(jié)合酶E2基因SorUBC在龍葵各組織中均有表達，在葉片和果實中表達量顯著高于其他組織。鹽、堿、高溫、低溫及干旱非生物脅迫處理下，龍葵SorUBC基因表達量均存在早期應(yīng)答上調(diào)表達趨勢，分別在3或5 h上調(diào)表達，且SorUBC基因在根部與葉片表達量和變化趨勢差異顯著，根部表達量明顯高于葉片表達量。三種脅迫處理（高溫、干旱和鹽）中，MDA含量變化差異不顯著；POD和SOD活性總體呈先降后升趨勢。

[1]Wei S H,Zhou Q X,Wang X.Characteristics of 18 species of weed hyperaccumulating heavy metal in contaminated soils[J]. Journal of Basic Science and Engineering,2003,11(2):152-159.

[2]Wei S H,Zhou Q X,Wang X.Cadmium-hyperaccumulator Solanum nigrum L.and its accumulating characteristics[J].Environmental Science,2005,26(3):167-171.

[3]孫瑞蓮,周啟星,王新.鎘超積累植物龍葵葉片中鎘的積累與有機酸含量的關(guān)系[J].環(huán)境科學(xué),2006,27(4):765-769.

[4]裘梅.干旱脅迫對龍葵解剖結(jié)構(gòu)和生理特性的影響[D].南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2010.

[5]肖湘黔,曾東強,李德偉.龍葵上三種主要害蟲及防治[J].廣西熱帶農(nóng)業(yè),2005(6):37-38.

[6]Bray E A.Plant responses to water deficit[J].Trends in Plant Science,1997(2):48-54.

[7]Zhang Y Y,Yang C W,Li Y,et al.SDIR1is a RING finger E3 ligase that positively regulates stress-responsive abscisic acid signaling in Arabidopsis[J].The Plant Cell,2007,19(6):1912-1929.

[8]Li H G,Jiang H L,Bu Q Y,et al.The Arabidopsis RING finger E3 ligase RHA2b acts additively with RHA2a in regulating abscisic acid signaling and drought response[J].Plant Physiology Preview, 2011,156(2):550-563.

[9]Cheng M C,Hsieh E J,Chen J H,et al.Arabidopsis RGLG2, functioning as a RING E3 ligase,interacts with AtERF53 and negatively tegulates the plant drought stress response[J].Plant Physiology Preview,2012,158(1):363-375.

[10]Zhu J K.Salt and drought stress signal transduction in plants[J].Annual Review of Plant Biology,2002,53:247-273.

[11]Hershko A,Ciechanover A.The ubiquitin system[J].Annual Review of Biochemistiy,1998,67:425-479.

[12]Zhou G A,Chang R Z,Qiu L J.Overexpression of soybean ubiquitinconjugating enzyme gene GmUBC2 confers enhanced drought and salt tolerance through modulating abiotic stress-responsive gene expression in Arabidopsis[J].Plant Molecular Biology,2010,72: 357-367.

[13]Cui F,Liu L J,Zhao Q Z,et al.Arabidopsis ubiquitin conjugase UBC32 is an ERAD component that functions in brassinosteroidmediated salt stress tolerance[J].The Plant Cell,2012,24:233-244.

[14]Dharmasiri N,Dharmasiri S,Estelle M.The F-box protein TIR1 is an auxin receptor[J].Nature,2005,435(7041):441-445.

[15]Ariizumi T,Lawrence P K,Steber C M.The role of two F-box proteins,SLEEPY1 and SNEEZY,in Arabidopsis gibberellin signaling[J].Plant Physiology,2011,155(2):765-775.

[16]Chini A,Fonseca S,Fernandez G,et al.The JAZ family of repressors is the missing link in jasmonate signaling[J].Nature, 2007,448(7154):666-671.

[17]Marrocco K,Zhou Y C,Bury E,et al.Functional analysis of EID1, an F-box protein involved In phytochrome A2 dependent light signal transduction[J].The Plant Journal,2006,45(3):423-438.

[18]Holm M,Ma L G,Qu L J,et al.Two Interacting bZIP proteins are direct targets of COP1-Mediated control of light-dependent gene expression in Arabidopsis[J].Genes&Development,2002,16 (10):1247-1259.

[19]OsterlundMT,HardtkeCS,WeiN,etal.Targeted destabilization of HY5 during light-regulated development of Arabidopsis[J].Nature,2000,405(6785):462-466.

[20]Wang Y,Wang X,Skirpan A L,et al.S-RNase-mediated self-Incompatibility[J].Journal of Experimental Botany,2003,54(380): 115-122.

[21]Lai Z,Ma W,Han B,et al.An F-box gene linked to the selfincompatibility(S)locus of antirrhinum is expressed Specifically in pollen and tapetum[J].Plant Molecular Biology,2002,50 (1):29-42.

[22]于曉敏,藍興國,李玉花.泛素/26S蛋白酶體途徑與顯花植物自交不親和反應(yīng)[J].植物學(xué)通報,2006,23(2):197-206.

[23]劉方方,姜穎,曹言勇,等.玉米中RING型E3泛素連接酶基因ZmGW2的表達分析[J].玉米科學(xué),2013,21(2):47-51.

[24]Lee H K,Cho S K,Son O,et al.Drought stress-induced Rma1H1, a RING membrane-anchor E3 ubiquitin ligase homolog,regulates aquaporin levels via ubiquitination transgenic Arabidopsis plants [J].Plant Cell,2009,21(2):622-641.

[25]Wan X R,Mo A Q,Liu S,et al.Constitutive expression of a peanut ubiquitin-conjugating enzyme gene in Arabidopsis confers improved water-stress tolerance through regulation of stressresponsive gene expression[J].Journal of Bioscience and Bioengineering,2011,111:478-484.

[26]王安邦,金志強,劉菊華,等.香蕉泛素結(jié)合酶基因MaUCE2在非生物脅迫下的表達分析[J].生物技術(shù)通報,2013(5):77-80.

[27]Chung E,Cho C W,So H A,et al.Overexpression of VrUBC1,a Mung Bean E2 ubiquitin conjugating enzyme,enhances osmotic stress tolerance in Arabidopsis[J].PLOS ONE,2013(8):1-15.

[28]趙瑞麗,鐘鳳林,林義章,等.小白菜BcUBCE2基因的克隆及表達分析[J].西北植物學(xué)報,2014,34(1):60-65.

[29]Baloglu M C,Patir M G.Molecular characterization,3D model analysis,and expression pattern of the CmUBC gene encoding the melon ubiquitin-conjugating enzyme under drought and salt stress conditions[J].Biochemical Genetics,2014,52:90-105.

[30]徐東北,于月華,韓巧玲,等.大豆（Glycine max）GmDREB5互作蛋白GmUBC13的特性及功能[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2014,47(18): 3534-3544.

[31]賴先軍,古英洪,王海燕,等.甘薯Sporamin家族基因克隆與表達分析[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報,2013(4):215-223.

[32]戴凌燕,唐呈瑞,殷奎德,等.甜高粱SUTI基因克隆、表達及生物信息學(xué)分析[J].核農(nóng)學(xué)報,2015,29(12):2276-2286.

[33]Dhindsa R S,Dhindsa P P,Thorpe T A.Leaf senescence: Correlated with increased leaves of membrane permeability and lipid peroxidation,and decreased levels of superoxide dismutase and catalase[J].J Exp Bot,1981,32:93-101.

[34]孫群.植物生理學(xué)研究技術(shù)[M].楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué)出版社,2007.

[35]尹麗娟,陳陽,劉沛,等.小麥泛素結(jié)合酶TaE2的表達分析及蛋白互作[J].植物遺傳資源學(xué)報,2014,15(1):144-149.

[36]Catala R,Jian O,Abreu I A,et al.The Arabidopsis E3 SUMO ligase SIZ1 regulates plant growth and drought responses[J].The Plant Cell,2007,19(9):2952-2966.

[37]Kang M,Fokar M,Haggag A,et al.Arabidopsis SAP5 functions as a positive regulator of stress responses and exhibits E3 ubiquitin ligase activity[J].Plant Molecular Biology,2011,75:451-466.

[38]Suzuki G,Yanagawa Y,Kwok S F,et al.Arabidopsis COP10 is aubiquitin-conjugating enzyme variant that acts together with COP1 and the COP9 signalosome in repressing photomorphogenesis[J]. Genes&Development,2002,16(5):554-559.

[39]Hanjo H,Mark E.Plant development:regulation by protein degradation[J].Science,2002,297(5582):793-797.

[40]Criqui M C,Engler J D A,Camassees A,et al.Molecular characterization of plant ubiquitin-conjugating enzymes belonging to the UbcP4/E2-C/UBCx/UbcH10 gene family[J].Plant Physiology, 2002,130:1230-1240.

[41]Lee H,Xiong L,Gong Z,et al.The Arabidopsis HOS1 gene negatively regulates cold signal transduction and encodes a RING

[14]黃紹敏,寶德俊,黃甫湘榮,等.長期施用有機和無機肥對潮土氮素平衡與去向的影響[J].植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報,2006,12(4): 479-484.

[15]李宗新,董樹亭,胡昌浩,等.有機無機肥互作對玉米產(chǎn)量及耕層土壤特性的影響[J].玉米科學(xué),2004,12(3):100-102.

[16]朱平,彭暢,高洪軍,等.長期培肥對土壤肥力及玉米產(chǎn)量的影響[J].玉米科學(xué),2009,17(6):105-108.

[17]Brookes P C,Landman A,Pruden G,et al.Chloroform fumigation and the release of soil N:A rapid direct extraction method to measure microbial biomass nitrogen in soil[J].Soil Biology and Biochemistry,1985,17:837-842.

[18]Inubushi K,Brookes P C,Jenkinson D C.Soil microbial biomass C,N and ninhydrin-N in aerobic and anaerobic soils measured by the fumigation-extraction method[J].Soil Biology and Biochemistry,1991,23:737-741.

[19]吳金水,林啟美,黃巧云,等.土壤微生物生物量測定方法及其應(yīng)用[M].北京:氣象出版社,2006.

[20]中國科學(xué)院南京土壤研究所微生物室.土壤微生物研究法[M].北京:科學(xué)出版社,1985.

[21]許光輝,鄭洪元.土壤微生物分析方法手冊[M].北京:農(nóng)業(yè)出版社,1986.

[22]魯如坤.土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法[M].北京:中國農(nóng)業(yè)科技出版社,1998.

[23]劉艷麗.長期施肥下水稻土土壤性質(zhì)變化及其與生產(chǎn)力的關(guān)finger protein that displays cold-regulated nucleo-cytoplasmic partitioning[J].Genes Development,2001,15:912-924.

[42]Yan J,Wang J,Li Q,et al.AtCHIP,a U-box-containing E3 ubiquitin ligase,plays a critical role in temperature stress tolerance in Arabidopsis[J].Plant Physiolgy,2003,132:861-869.

[43]Seo Y S,Choi J Y,Kim S J,et al.Constitutive expression of CaRma1H1,a hot pepper ER-localized RING E3 ubiquitin ligase, increases tolerance to drought and salt stresses in transgenic tomato plants[J].Plant Cell Reports,2012,31:1659-1665.

[44]成廣雷,張海嬌,趙久然,等.臨界脅迫貯藏條件下不同基因型玉米種子活力及生理變化[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,48(1):32-42.

Clone and expression pattern analysis of E2 ubiquitin-binding enzymegeneSorUBCinSolanum nigrumL./

CAI Jiawen1,JIN Xiaoxia1,YU Lijie1,CUI Baiyang1,WEI Xun1,DONG Yanlong2(1.School of Life Science and Technology,Harbin Normal University,Key Laboratory of Plant Biology,College of Heilongjiang Province,Harbin 150025, China;2.Horticulture Branch,Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150069, China)

In this researchSorUBCgene fromSolanum nigrumL.was cloned and the expression pattern under different abiotic stresses were detected.This would help us to predict the characteristics of E2 ubiquitin binding enzyme and provide theoretical basis for the application of E2 ubiquitin binding enzyme in plant stress.The research cloned E2 ubiquitin binding enzymeUBCgene full-length coding region sequence by electronic cloning and RT-PCR method fromSolanum nigrumL.,namedSorUBC,GenBank accession number：KU233684.The coding region sequence was 888 bp,encoded 295 amino acids.Phylogenetic tree analysis showed thatSorUBCamino acid sequence was homologous highest with potato and tomato,was 95%,followed by tobacco which was 91%.The protein was predicted to have one transmembrane helical regions in the 266-284 amino acid site,and the ubiquitin-based site prediction showed that it contained eight ubiquitin-based sites.The expression characteristics of SorUBCin various organs and in roots and leaves with abiotic stress treatments(drought,salt,alkali, high temperature and low temperature)ofSolanum nigrumL.were detected using quantitative PCR analysis,meanwhile physiological response of leaves inSolanum nigrumL.were determined.The results showed that the expression ofSorUBCgene were different in tissues,higher in leaves and fruits.Detection of gene expression in roots and leaves after abiotic stress treatments(drought,salt, alkali,high temperature and low temperature)showed that there was an early(3 or 5 h)response up regulation expression ofSorUBCgene,the expression levels and the trends of the gene in roots and leaves had significant difference,the expression in roots were more obvious than in leaves,suggesting thatSorUBCgene might play a regulatory role in early stage response to different abiotic stress such as drought,salt,alkali,high temperature and low temperature stress inSolanum nigrumL. Physiological characteristic data showed that no significant change of the MDA content in leaves of Solanum nigrumin drought,salt and high temperature stress,the activity of POD and SOD increased first and decreased afterward,indicated that they played a certain role in alleviating the damage caused by reactive oxygen species in the later stage of stress(9 h).

Solanum nigrumL.;SorUBC;clone;expression analysis;abiotic stress;physiological characteristics

Q785

A

1005-9369（2016）11-0026-11

時間2016-12-1 11:35:17[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20161201.1135.006.html

蔡佳文,金曉霞,于麗杰,等.龍葵E2泛素結(jié)合酶基因SorUBC克隆及表達特性分析[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2016,47(11)：26-36.

Cai Jiawen,Jin Xiaoxia,Yu Lijie,et al.Clone and expression pattern analysis of E2 ubiquitin-binding enzyme geneSorUBC inSolanum nigrumL.[J].Journal of Northeast Agricultural University,2016,47(11)：26-36.(in Chinese with English abstract)

2016-09-29

黑龍江省教育廳面上項目（12531204，12531178）；“植物生物學(xué)”黑龍江省高校重點實驗室開放課題（ZK201205）；哈爾濱師范大學(xué)青年學(xué)術(shù)骨干資助計劃項目（KGB201218）

蔡佳文（1991-），女，碩士研究生，研究方向為植物分子生物學(xué)。E-mail:caimylove1991@126.com

*通訊作者：金曉霞，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向為植物分子生物學(xué)。E-mail:xiaoxia6195@163.com