管 驍 趙 欣 殷 婷

(上海理工大學醫(yī)療器械與食品學院，上海 200093)

大麥醇溶蛋白的制備及其理化性質研究

管 驍 趙 欣 殷 婷

(上海理工大學醫(yī)療器械與食品學院，上海 200093)

以大麥粉為原料制備大麥醇溶蛋白，并對其理化性質進行了系統(tǒng)研究。結果顯示粗蛋白質量分數(shù)高達92.63%，且主要以醇溶蛋白B組分(相對分子質量36～43 k)與C組分(相對分子質量45～60 k)為主。大麥醇溶蛋白的紅外光譜圖呈現(xiàn)典型的蛋白譜圖特征，1 650、1 535及1 448 cm-1處的吸收峰，分別反映了蛋白質酰胺Ι、酰胺Ⅱ、酰胺Ⅲ的特征結構。蛋白中游離巰基的含量為4.27 μmol/g，總巰基含量為24.1 μmol/g，二硫鍵含量為9.9 μmol/g，表面疏水性為283.93，蛋白中主要氨基酸組成包括谷氨酸與脯氨酸，氨基酸模式不理想。原子力顯微鏡結果顯示大麥醇溶蛋白分子呈橢球狀，尺寸大小約5.1 nm。

大麥醇溶蛋白 制備 理化性質

大麥胚乳蛋白質可分為清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白，其中醇溶蛋白質占大麥總蛋白的40%～60%，是種子蛋白的重要組成部分[1]。，大麥醇溶蛋白相對分子質量約30 000～50 000 u[2]，并具有一些獨特的功能性質，包括水不溶性、流變性、延伸性、膨脹性、成膜性和膠凝性等，可用乙醇-水混合溶液、異丙醇-水混合溶液及乙酸等作為溶劑進行提取。大麥醇溶蛋白的來源非常豐富，隨著大麥淀粉加工、啤酒行業(yè)的發(fā)展，其副產(chǎn)物大麥醇溶蛋白未能得到充分利用。因此，在節(jié)約型環(huán)保社會發(fā)展進程中，這一巨大潛在蛋白資源的回收和綜合開發(fā)利用成為當務之急，同時也可為大麥醇溶蛋白的生產(chǎn)提供新途徑。

從大麥粉中提取大麥醇溶蛋白，并分析大麥醇溶蛋白的理化性質，包括相對分子質量、分子巰基與二硫鍵含量、表面疏水性及其氨基酸組成、分子表面形態(tài)等，為大麥醇溶蛋白的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

大麥粉：市售。

1.2 主要設備

傅里葉紅外光譜儀：美國珀金埃爾默儀器(上海)有限公司；氨基酸自動分析儀：安捷倫公司；S-3000N型掃描電子顯微鏡：日立儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 大麥醇溶蛋白提取[3]

稱取一定量大麥粉(過40目篩)，按1∶6(m/V)的比例加入正己烷，室溫條件下浸泡脫脂，離心后風干待用。按1∶6(m/V)的比例往脫脂大麥粉中加入1 mol/L NaCl溶液，55 ℃磁力攪拌30 min，離心(轉速4 000 r/min，15 min)除去上清液，如此反復2次；然后按1∶6(m/V)的比例往沉淀中加入蒸餾水，55 ℃磁力攪拌30 min，離心分離洗滌沉淀，如此反復3次；最后按1∶10(m/V)的比例往沉淀中加入55%的異丙醇溶液，60 ℃磁力攪拌1 h(密封防止異丙醇揮發(fā))，離心分離(6 500 r/min，15 min)收集上清液保存于4 ℃過夜，低溫高速離心(4 ℃，12 000 r/min，15 min)得到蛋白沉淀，并用55%異丙醇溶液復溶，凍干得到大麥醇溶蛋白。

1.3.2 聚丙烯酰胺凝膠電泳分析(SDS-PAGE)

參照朱廣廉等[4]的方法進行。

1.3.3 傅里葉變換紅外光譜分析(FTIR)

對大麥醇溶蛋白粉末用傅里葉變換紅外光譜儀進行透射掃描，掃描范圍為400～4 000 cm-1，掃描次數(shù)為25次，分辨率為4 cm-1。

1.3.4 大麥醇溶蛋白巰基與二硫鍵分析

巰基含量測定參考文獻[6]，稍作改動。

游離巰基含量測定：將20 mg大麥醇溶蛋白溶解于10 mL的0.2 mol/L Tris-HCl，pH 8.0的緩沖液A(含8 mol/L尿素、3 mmol/L EDTA和l%SDS)中后，取出溶解液3 mL，然后加入0.2 mol/L Tris-HC1、pH 8.0的緩沖液B(含10 mmol/L DTNB)0.3 mL，避光條件下磁力攪拌30 min，412 nm測定吸光度。

總巰基含量測定：(i) NTSB 的制備：100 mg的Ellman試劑溶解到10 mL 1 mol/L的亞硫酸鈉溶液中，在38 ℃下通入氧氣直到亮紅色溶液變成淡黃色，表明 NTSB 已經(jīng)生成。(ii)將20 mg大麥醇溶蛋白溶解于10 mL 0.2 mol/L Tris-HCl，pH 8.0的緩沖液(含8 mol/L尿素，3 mmol/L EDTA，l%SDS與0.1 mol/L Na2SO3)中，取溶解液3 mL，然后加入0.2 mol/L Tris-HCl，pH 9.5的緩沖液(含8 mol/L尿素，3 mmol/L EDTA，l% SDS，0.1 mol/L Na2SO3與10 mL/L NTSB)0.3 mL，避光條件下磁力攪拌30 min，412 nm測定吸光度。

-SH(μmol/g) = 73.53×A412×D/C

-S-S-(μmol/g)=(總巰基含量-游離巰基含量)/2

式中：A412為樣品吸光度；D為稀釋倍數(shù)；C為樣品固形物含量。

1.3.5 大麥醇溶蛋白表面疏水性測定

將大麥醇溶蛋白溶解于0.01 mol/L，pH為7.0的PBS緩沖液中，配置成0.01～1 mg/mL的蛋白溶解液。分別取樣品液2 mL，加入15 μL、8 mmol/L的熒光探針試劑ANS震蕩，室溫下靜止15 min。選擇激發(fā)波長390 nm，發(fā)射波長470 nm測定熒光強度。以熒光強度對蛋白溶液濃度作圖并進行線性回歸，以線性回歸斜率作為蛋白表面疏水性指數(shù)。

1.3.6 蛋白質氨基酸分析

參照GB/T 5009.124—2003方法測定。取一定量的大麥醇溶蛋白，用6 mol/L HCl溶液于110 ℃水解24 h，烘干，然后加入標準緩沖液溶解，稀釋到合適的氨基酸濃度，用氨基酸自動分析儀在338 nm檢測波長下測定樣品氨基酸組成。

1.3.7 原子力顯微鏡分析(AFM)

稱取大麥醇溶蛋白，按1 mg/mL的濃度完全溶解于55%乙醇溶液中。取一定量溶液懸滴于干凈云母片表面，室溫下浸潤1 h后，傾倒風干后即可上機測試[5]。利用NanoScope ⅢA Multimode型原子力顯微鏡(Veeco Instruments Inc., Santa Barbara, CA)，采用輕敲模式(Tapping Mode)成像。所有圖像在分析前進行平滑處理。利用AFM自帶軟件Nanoscope 5.30中的截面形狀分析(section analysis)功能對蛋白形態(tài)進行定量分析。

2 結果與討論

2.1 大麥醇溶蛋白SDS-PAGE分析

大麥醇溶蛋白屬于大麥貯存蛋白，主要存在于大麥的淀粉胚乳層中，約占籽粒總蛋白含量的30%～50%。本試驗所用大麥粉原料蛋白質質量分數(shù)為10.7%，采用此蛋白提取工藝蛋白提取率為20.62%，提取率不高的原因可能是此原料中醇溶蛋白所占比例較低。根據(jù)相對分子質量大小，大麥醇溶蛋白可分為4個組分，B組分(36～43 k)、C組分(45～60 k)、D組分(80～90 k)和γ組分(12～16 k)，其中組分B約占大麥醇溶蛋白總量的70%～80%；組分C約占10%～20%，組分D和γ含量較低，約占總量的5%[7-8]。本試驗制備的大麥醇溶蛋白的SDS-PAGE圖譜如圖1所示。從圖1可看出，通過該工藝制備的大麥醇溶蛋白主要包括2簇蛋白帶，分別為相對分子質量30～40 k與45～50 k，對應于大麥醇溶蛋白B組分與C組分。同時可發(fā)現(xiàn)在低分子質量處(小于30 k)有微量其他蛋白組分存在，這可能是由于提取過程中微量的非醇溶性蛋白同時溶出造成的。凱氏定氮結果表明所提取大麥醇溶蛋白中粗蛋白質量分數(shù)為92.63%。

注：S為標準分子質量蛋白。

2.2 傅里葉變換紅外光譜分析(FTIR)

大麥醇溶蛋白的紅外光譜圖如圖2所示，呈現(xiàn)典型的蛋白譜圖特征。1 650 cm-1、1 535 cm-1及1 448 cm-1處的吸收峰，分別反映了蛋白質酰胺Ι、酰胺Ⅱ、酰胺Ⅲ的特征結構。1 240 cm-1吸收峰主要由蛋白分子間氫鍵與β-折疊結構所引起[9-10]，3 300 cm-1處吸收峰反映了-OH與-NH2的伸縮振動，2 962 cm-1處吸收峰是因蛋白質中-CH2-的對稱伸縮所引起。由此可進一步證實采用本研究提取大麥醇溶蛋白是有效的。

圖2 大麥醇溶蛋白紅外光譜圖

2.3 大麥醇溶蛋白巰基與二硫鍵含量

分子中的巰基與二硫鍵一直被視為蛋白質結構中重要的功能基團[13]。經(jīng)測定，大麥醇溶蛋白中游離巰基的含量為4.265 μmol/g，總巰基的含量為24.118 μmol/g，二硫鍵的含量為9.927 μmol/g。同時，大麥醇溶蛋白分子中含有大量的疏水性氨基酸殘基，而疏水氨基酸殘基更容易圍繞二硫鍵形成局部疏水中心，拒絕水分子進入蛋白分子的內(nèi)部破壞氫鍵，更利于形成穩(wěn)定的高級結構區(qū)域[14-15]。

2.4 大麥醇溶蛋白表面疏水性

ANS與蛋白質分子中芳香族氨基酸殘基結合后， 390 nm激發(fā)波長下在470 nm處發(fā)生最大吸收，且熒光強度與蛋白表面疏水性成正相關[16]。如圖3所示，大麥醇溶蛋白的表面疏水性高達283.93，高于大多數(shù)常見的食物蛋白，這主要是由于大麥醇溶蛋白中疏水性基團含量較高的緣故。

圖3 大麥醇溶蛋白表面疏水性測定

2.5 大麥醇溶蛋白氨基酸組成分析

表1所示為大麥醇溶蛋白的氨基酸組成分析結果，由于蛋白樣品在強酸條件下水解，因此色氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺遭到破壞無法檢測。由表1可看出，大麥醇溶蛋白中谷氨酸含量最高，達到36.9%，次之為脯氨酸(15.6%)，其后依次為苯丙氨酸、亮氨酸、纈氨酸。根據(jù)FAO/WHO建議的理想蛋白模式，質量較好的蛋白質其必需氨基酸與總氨基酸(E/T)的比值在36%以上，必需氨基酸與非必需氨基酸(E/N)的比值在60%以上[16]。從表1可知，大麥醇溶蛋白的E/T為25.8%，E/N為34. 7%，特別是谷物蛋白第一限制氨基酸—賴氨酸的質量分數(shù)僅占0.56%，說明大麥醇溶蛋白的營養(yǎng)價值較低，并非是一種理想的膳食蛋白。然而，谷物醇溶蛋白具有特殊的氨基酸模式，具有特殊黏結性、延伸性，并應用于食品保鮮、緩釋材料載體等[8]。

表1 大麥醇溶蛋白氨基酸組成

2.6 原子力顯微鏡分析

圖4所示為大麥醇溶蛋白的高度圖(與表面形態(tài)相關)與相圖(與機械強度差異相關)。圖中顯示大部分大麥醇溶蛋白呈單個分子分布狀態(tài)，同時也存在少量蛋白聚集體。由圖中還可看出，大麥醇溶蛋白分子在干態(tài)環(huán)境下基本呈橢球狀，其尺寸大小可通過AFM的截面形態(tài)分析軟件給出。本試驗中，基于AFM的懸臂式探針的敲擊原理，考慮將從蛋白顆粒頂部至基底表面的垂直高度作為蛋白橢球顆粒的度量尺寸，對所有單個蛋白分子進行測定并平均后可知，大麥醇溶蛋白分子大小約為5.1 nm(如圖4c)。在此需指出的是，盡管測定蛋白分子流體動力學半徑的常用方法是動態(tài)光散射方法(DLS)，然而主要也是限于球狀蛋白分子。應用DLS方法測定大麥醇溶蛋白尺寸存在以下兩方面的限制：1)大麥醇溶蛋白分子主要是橢球狀而非規(guī)則的球形；2)在溶液狀態(tài)下蛋白分子之間容易發(fā)生相互作用呈結合狀態(tài)，很難通過DLS方法去測定單個大麥醇溶蛋白分子的大小。

圖4 大麥醇溶蛋白原子力顯微鏡圖譜

3 結論

考察了以大麥粉為原料制備大麥醇溶蛋白的技術方案，測試結果顯示獲得的大麥醇溶蛋白純度高達92.63%，主要包括組分B與組分C，說明該方案是可行的。對大麥醇溶蛋白的理化性質進行了測定，結果表明蛋白中游離巰基的含量為4.27 μmol/g，總巰基的含量為24.1 μmol/g，二硫鍵的含量為9.9 μmol/g，表面疏水性為283.93，蛋白中主要的氨基酸為谷氨酸與脯氨酸，氨基酸模式并不理想。原子力顯微鏡結果直觀顯示了大麥醇溶蛋白分子在干態(tài)環(huán)境中呈橢球狀，橢球體直徑約5.1 nm。

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Preparation and Physicochemical Properties of Hordein

Guan Xiao Zhao Xin Yin Ting

(School of Medical Instruments and Food Engineering,University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai 200093)

In this paper, hordein was prepared using barley as raw material, and its physicochemical properties were studies thoroughly. The results demonstrated that the crude protein content in hordein was up to 92.63%, and mainly consisted of hordein B(Mw 36～43 k) and hordein C(Mw 45～60 k).The FTIR of hordein presented typical protein spectrum. The absorption peak of 1 650 cm-1, 1 535 cm-1and 1 448 cm-1, respectively, reflecting the characteristic structure of protein amide Ι , amide Ⅱand amide Ⅲ. The content of free sulfhydryl group in hordein was 4.27 μmol/g; the total sulfhydryl content was 24.1 μmol/g; the two disulfide bond content was 9.9 μmol/g; and the surface hydrophobicity was 283.93. The main amino acid in protein included glutamic acid and proline, and the amino acid pattern was not ideal. Atomic force microscopy results showed that the shape of hordein molecular was ellipsoidal with the size of about 5.1 nm.

hordein, preparation, physicochemical properties

TQ432.2

A

1003-0174(2016)04-0047-05

國家自然科學基金(31101348)，上海市自然科學基金(14ZR1419200)

2014-07-17

管驍，男，1979年出生，副教授，博士，食品科學