劉 軍 鄭翠翠 廖森泰 鄒宇曉 施 英 穆利霞 林光月

(廣東省農(nóng)業(yè)科學院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)部功能食品重點實驗室/廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室，廣州 510610)

精制對蠶蛹油抗氧化活性的影響

劉 軍 鄭翠翠 廖森泰 鄒宇曉 施 英 穆利霞 林光月

(廣東省農(nóng)業(yè)科學院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)部功能食品重點實驗室/廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室，廣州 510610)

分別采用超臨界CO2萃取和溶劑浸提2種途徑從蠶蛹中提取毛油，再通過脫膠、脫酸、脫色、脫臭等工藝精制蠶蛹油，收集不同精制階段的蛹油樣品，測定色差變化，利用不同的抗氧化評價方法(包括總抗氧化能力FRAP、DPPH清除率、總酚含量、總類胡蘿卜素含量)評估其抗氧化活性，并對評估結果進行相關性分析和主成分分析。結果表明，超臨界萃取的蠶蛹毛油抗氧化活性明顯優(yōu)于正己烷浸提；隨著精制過程的進行，蛹油亮度增加，黃色減少，自身抗氧化成分逐步損失，蛹油氧化穩(wěn)定性下降，精制過程造成2種途徑獲得的蛹油總酚損失24.73%～65.14%，類胡蘿卜素損失12.0%～69.27%，其中脫色階段損失最為顯著。相關性分析發(fā)現(xiàn)，蠶蛹油的抗氧化能力與總酚和類胡蘿卜素的含量密切相關，而總抗氧化能力FRAP與DPPH清除率之間的相關性不顯著；主成分分析發(fā)現(xiàn)，溶劑提取和超臨界萃取2種途徑制備的蠶蛹毛油抗氧化活性差異較大，但經(jīng)精制處理后，二者的抗氧化能力又大幅下降至同一水平。

蠶蛹油 提取 精制 抗氧化

蠶蛹油含量豐富的活性成分，不飽和脂肪酸質(zhì)量分數(shù)在75%以上，其中α-亞麻酸的質(zhì)量分數(shù)約為35%，具有增長智力、保護視力、延緩衰老、降血脂、降血壓及預防心腦血管疾病和抑制老年性癡呆等作用[1]。提取的蠶蛹毛油由于含有磷脂、蛋白質(zhì)、水分和色素等物質(zhì)，對蠶蛹油的貯藏品質(zhì)不利，在后期加工、貯藏和運輸過程中極易受到氧、水分、高溫、光照、射線以及催化劑的影響而氧化變質(zhì)，嚴重影響了產(chǎn)品的品質(zhì)，因此必須對蠶蛹毛油進行精制處理，以獲得品質(zhì)優(yōu)良的蠶蛹油成品，延長貨架期。

酚類和類胡蘿卜素是油脂中存在的2類重要天然抗氧化劑，可以同油脂氧化酸敗產(chǎn)生的過氧化物結合，對不飽和脂肪酸起到一定的保護作用，與油脂的總抗氧化能力息息相關[2-4]。但酚類和類胡蘿卜素極易在加工過程中流失，尤其是精制的脫色階段[5]，因此有必要對整個精制工藝進行系統(tǒng)研究，掌握抗氧化成分的損失情況并加以控制?，F(xiàn)階段關于油脂的抗氧化評價方法眾多，不同的評價體系側重點各不相同，油脂的總抗氧化能力可通過FRAP法[6]、DPPH法[7]、ABTS法[6]和β-胡蘿卜素含量[7]進行評價，而針對蠶蛹油的抗氧化評價體系的研究鮮有報道。本試驗采用超臨界CO2萃取和溶劑浸提2種方法從蠶蛹中提取毛油，精制加工后收集不同精制階段的蛹油樣品，利用不同的抗氧化評價方法跟蹤蠶蛹油加工過程中的抗氧化活性變化規(guī)律，明確其抗氧化活性與酚類和類胡蘿卜素物質(zhì)的關系，為蠶蛹油的工業(yè)化生產(chǎn)及產(chǎn)品貨架期的延長提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮蠶蛹：兩廣二號品種，廣東省農(nóng)業(yè)科學院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所。

福林酚試劑(FC)：廣州市齊云生物技術有限公司，總抗氧化能力檢測試劑盒：南京建成生物科技有限公司，其余試劑均為分析純。

1.2 儀器

HL-1L/50Mpa-11B超臨界萃取儀：杭州華黎泵業(yè)有限公司；HZQ-QX恒溫振蕩器哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司；Infinite200酶標儀：瑞士TECAN公司；Ultrascan VIS色度儀：北京晶光儀器有限公司；UV-1800分光光度儀：日本島津公司； Sorvall Stratos高速冷凍離心機：美國Checkpoint有限公司；pHS-3C pH計：上海理達儀器廠；GHRH-20熱泵干燥機：廣東省農(nóng)業(yè)機械研究所。

1.3 試驗方法

1.3.1 蠶蛹油提取精制工藝流程

1.3.2 蠶蛹粉的制備

新鮮蠶蛹經(jīng)沸水中燙漂3 min后置于60 ℃的熱泵干燥機中，干燥至含水量為5%左右，粉碎過40目篩，存放于-18 ℃的冰箱中待用。

1.3.3 蠶蛹油的提取

正己烷浸提：按照蠶蛹粉∶正己烷=1∶4(m/V)置于恒溫振蕩器提取4 h(控制轉速160 r/min，溫度38 ℃)，然后真空抽濾除去濾渣，濾液40 ℃旋蒸回收正己烷，獲得蠶蛹毛油Z1。

超臨界CO2萃取：壓力25 MPa、溫度45 ℃、時間2.5 h，獲得蠶蛹毛油C1。

1.3.4 蛹油的精制

脫膠：參照郭無瑕等[8]的方法稍加修改，將2種提取方法獲得的蠶蛹毛油水浴加熱到70 ℃并不斷攪拌，緩慢加入占油質(zhì)量1%的磷酸(體積分數(shù)80%)，離心分別獲得上層脫膠油Z2和C2。

脫酸：參照劉玉蘭[9]的堿煉脫酸法，向脫膠蛹油中加入3.6 mol/L的NaOH溶液和0.3%的超量堿，緩慢滴加并均勻攪拌加熱到70 ℃保溫30 min，冷卻至室溫，分離得油層，再用去離子水洗滌3次，離心分別獲得上層脫酸蛹油Z3和C3。

脫色：參照郭華等[10]的方法稍加修改，用白土做脫色劑，將脫酸后的蠶蛹油水浴加熱到60 ℃，加入蠶蛹油質(zhì)量4%的白土，攪拌時間為30 min，再真空抽濾，濾液即為脫色蛹油Z4和C4。

脫臭：蛹油置于圓底燒瓶，水浴80 ℃旋轉蒸發(fā)15 min，即得到脫臭蛹油Z5和C5。

搜集精制各階段的蛹油樣品置于4 ℃以下避光保存。

1.4 測定方法

1.4.1 總抗氧化能力(FRAP法)測定

準確稱取5 g蠶蛹油樣品置于250 mL三角瓶中，加入70 mL 甲醇后，放入65 ℃恒溫水浴鍋中冷凝回流90 min，提取完成后，冷凍(-20 ℃，30 min)分離，上層液旋蒸濃縮，甲醇定容到10 mL，4 ℃以下避光保存待測[5]。

參照Benzie等[11]建立的FRAP方法：試劑TPTZ可以被樣品中的物質(zhì)還原成二價的鐵離子，顏色呈藍色，在593 nm下測定藍色的Fe2+-TPTZ即可獲得樣品中的總抗氧化能力。96孔板的每個檢測孔中加入180 μL FRAP工作液，空白對照孔中加入5 μL蒸餾水或PBS等適當溶液；標準曲線檢測孔內(nèi)加入5 μL各種濃度的FeSO4標準溶液；樣品檢測孔內(nèi)加入5 μL各種樣品。輕輕混勻；37 ℃孵育3～5 min后測定A593，根據(jù)標曲計算總抗氧化能力。

標準曲線的制備：稱取27.8 mg本試劑盒提供的FeSO4·7H2O，溶解并定容到1mL，此時濃度即為100 mmol/L。取適量100 mmol/L FeSO4溶液稀釋至0.15、0.3、0.6、0.9、1.2和1.5 mmol/L的Trolox標準品溶液，然后按上述方法操作，獲得以吸光度為縱坐標、Fe2+濃度為橫坐標的標準曲線y=0.286 8x-0.009 9(R2=0.996)。

1.4.2 DPPH法測定[12]

DPPH溶液(105 μmol/L)：稱取DPPH 0.008 28 g加乙酸乙酯溶解并定容于200 mL混合均勻，得到105 μmol/L DPPH溶液。Trolox標準儲備液(0.1 g/L Trolox)：稱取Trolox標準物0.001 g，用適當?shù)囊宜嵋阴ト芙獠⒍ㄈ莸?0 mL的容量瓶中混合均勻，即為0.1 g/L Trolox標準儲備液。

按油樣與乙酸乙酯體積比為1∶0、1∶0.5、1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5配制，待測。樣品和標準曲線(Trolox)的測定方法根據(jù)表1的順序向試管中加入所需試劑并按照表所列規(guī)定進行操作。

表1 樣品及標準曲線的測定方法

式中：Ao為3.8 mL的DPPH溶液+0.2 mL乙酸乙酯溶液所測吸光值；Ai為3.8 mL的乙酸乙酯溶液+0.2 mL樣品的乙酸乙酯稀釋液所測吸光值；Aio為3.8 mL的DPPH溶液+0.2 mL樣品的乙酸乙酯稀釋液所測吸光值。

標準曲線的繪制：取0.1 g/L(相當于0.4 mmol/L) Trolox標準儲備液，稀釋成0.16、0.08、0.04、0.02、0.01、0 mmol/L的Trolox標準品溶液，然后按照表1測定，重復測定3次，獲得以清除率為縱坐標、Trolox濃度為橫坐標的標準曲線y=0.907 4x-0.032(R2=0.991 9)。

1.4.3 總酚含量(TPC)的測定[13]

分別吸取50 μL待測樣(按1.4.1方法提取)到刻度試管中，用蒸餾水補足至6 mL，再順序加入1 mL FC顯色劑溶液，3 mL NaCO3(7.5%)溶液，搖勻，室溫放置顯色2 h，在765 nm下測吸光值，由標曲求總酚質(zhì)量濃度，以沒食子酸(GA)計。

標準曲線的測定：配制沒食子酸標準品的質(zhì)量濃度分別為0、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50 mg/L，按照上述方法操作，獲得以吸光值為縱坐標、GA濃度為橫坐標的標準曲線y=0.140 1x+0.018 9(R2=0.997)。

1.4.4 總類胡蘿卜素含量(TCC)的測定[14]

稱取蠶蛹油1.5 g，用正己烷溶解并定容至10 mL，再從中取1 mL稀釋到適當?shù)馁|(zhì)量濃度，采用紫外分光光度儀在450 nm下測定吸光值，樣品中總類胡蘿卜素的含量(mg/g)用標準品β-胡蘿卜素計。以質(zhì)量濃度作橫坐標，吸光值作縱坐標繪制標準曲線y=0.088 5x-0.282(R2=0.993 9)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Excell 2010處理，采用SPSS16.0、ORIGIN7.5、SAS9.2軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 精制對蠶蛹油色差的影響

針對不同提取方法制備的蠶蛹毛油，分別收集各精制階段的蛹油樣品，測定其色差的變化，具體結果如表2所示。由表2可以看出，隨著精制過程的進行，2種方式提取的蛹油均呈現(xiàn)L*值逐漸增大，b*值逐漸減少，a*值則呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢，說明精制過程會逐步增加蛹油的亮度，減少黃色，綠色先呈現(xiàn)增加，在脫色階段后又大幅減少，這是由于精制過程會使油樣中的蛋白質(zhì)、糖類、磷脂和色素等成分被脫除，特別是脫色階段，在吸附劑的作用下蛹油中的天然色素(包括類胡蘿卜素、葉黃素等)大量減少，b*值(黃色)下降明顯，油脂變得更加澄清透明。

表2 精制對蠶蛹油色差的影響

注：同列含有相同字母表示差異不顯著(P>0.05 )，下同。

2.2 精制對蠶蛹油抗氧化能力的影響

以FRAP、DPPH、TPC和TCC為抗氧化評估指標，分別測定不同提取方法制備的蠶蛹油精制過程中的各抗氧化水平，結果見表3和圖1。

表3 精制對蠶蛹油抗氧化活性的影響

Duncan分析可以看出，2種不同提取方法制備的蠶蛹油精制階段的FRAP、DPPH、TPC和TCC水平存在顯著性差異，這是由于原料、環(huán)境和提取工藝等因素的差異造成。而超臨界萃取(模式2)的蠶蛹毛油的抗氧化能力明顯高于正己烷提取(模式1)，其中模式2 FRAP=131.19>模式1 FRAP=52.53，模式2 TPC=18.85>模式1 TPC=11.08，模式2 TCC=22.73>模式1 TCC=17.09，可以預測模式2的提取工藝優(yōu)于模式1，這是由于超臨界萃取工藝的高濃度CO2和低溫環(huán)境對蛹油起到了很好的保護作用，降低了蠶蛹油的氧化程度。

結合圖1可以看出，隨著精制階段的進行，各抗氧化水平基本呈下降趨勢，說明精制過程導致蠶蛹油的抗氧化性能逐步降低，特別是脫色階段，在脫除色素的同時帶走了大量的抗氧化成分(包括酚類和類胡蘿卜素)，影響蠶蛹油的氧化穩(wěn)定性。以FRAP指標為例，精制過程中造成2種途徑制備的蛹油總抗氧化能力損失高達45.57%～71.51%，總酚損失24.73%～65.14%，類胡蘿卜素損失12.0%～69.27%。酚類和類胡蘿卜素是油脂的2類重要的天然抗氧化劑，脫色階段造成正己烷組的TPC和TCC損失分別達到9.57%和23.17%，造成超臨界組的TPC和TCC損失分別達到29.12%和17.25%，從而影響蠶蛹油后期加工和儲藏的穩(wěn)定性，因此補充外源性抗氧化劑對蠶蛹油的保存具有重要意義。

圖1 精制過程對FRAP、DPPH、TPC和TCC的影響

2.3 相關性分析

對精制各階段蠶蛹油的抗氧化評估結果進行相關性分析，結果見表4，其中FRAP與TPC和TCC之間存在極顯著相關(r分別為0.965和0.803)，DPPH與TPC之間存在顯著相關，與TCC之間存在極顯著相關(r分別為0.734和0.894)，而FRAP與DPPH間相關性不顯著(r為0.6)，從而說明FRAP和DPPH 2種評價體系評估蠶蛹油的抗氧化能力各有側重點，F(xiàn)RAP與TPC相關性較大，DPPH與TCC相關性較大，這可能與各自的抗氧化機理不同有關，F(xiàn)RAP體系傾向于評價還原金屬離子的能力，DPPH體系則傾向于評價清除自由基的能力。但總體來講，蠶蛹油的抗氧化能力與自身存在的總酚和類胡蘿卜素的含量密切相關。

表4 蛹油抗氧化結果的相關性分析

注：**表示P< 0.01 的水平，*表示P<0.05 的水平。

2.4 主成分分析

對不同蛹油樣品的4項抗氧化水平進行主成分分析，得到4個主成分見表5，其中第1主成分的特征值高達3.463，方差貢獻率為86.564%，其他3個主成分(PC2，PC3和PC4)的特征值逐漸減小(<1；分別為0.472，0.056和0.009)，不能很好地描述其抗氧化能力，因此選用前2個主成分用于接下來的因子分析。主成分1與4個變量間均呈正相關性：TPC(0.974)、TCC(0.971)、FRAP(0.909)、DPPH(0.864)，而且DPPH(0.488)和TCC(0.159)對主成分2的貢獻率較高。

表5 主成分分析表

由系數(shù)矩陣將2個公因子表示為4個指標的線性形式，因子得分函數(shù)分別為：

PC1=0.769ZX1-0.509ZX2+0.513ZX3-0.018X4

PC2=-0.458ZX1+0.933ZX2-0.148ZX3+0.438ZX4

以主成分1為X軸，主成分2為Y軸做4個變量的因子得分函數(shù)如圖2，由對應分析圖的規(guī)律可知：Z1、Z2、Z3靠的較近，而C1、C2、C3靠的較近，且二者之間沒有明顯交集，說明正己烷提取和超臨界萃取2種工藝制備的蠶蛹油在脫色工藝前的抗氧化能力差異較大，但2種制備的毛油經(jīng)脫膠、脫酸工藝后其各自的抗氧化能力變化并不大；Z4、Z5、C4、C5靠的非常近，具有明顯的關聯(lián)性，說明2種方法制備的蠶蛹油在精制工藝(尤其是脫色)后總抗氧化能力趨向同一水平。

圖2 因子得分分析圖

3 結論

3.1 色差分析表明，精制過程會逐步增加蛹油的亮度，減少黃色，綠色先呈現(xiàn)增加，在脫色階段后又大幅減少，精制工藝后蛹油色澤淡黃、澄清透明。

3.2 超臨界CO2萃取的蠶蛹油氧化穩(wěn)定性明顯優(yōu)于正己烷浸提的蠶蛹油，隨著精制過程的進行，蠶蛹油自身抗氧化成分酚類和類胡蘿卜素逐步減少，蠶蛹油的抗氧化能力也逐步降低。精制過程中造成2種途徑獲得的蛹油總抗氧化能力損失高達45.57%～71.51%，總酚損失24.73%～65.14%，類胡蘿卜素損失12.0%～69.27%，其中脫色階段損失最為顯著。

3.3 相關性分析發(fā)現(xiàn)，蠶蛹油的抗氧化活性與總酚和類胡蘿卜素的含量密切相關，而總抗氧化能力FRAP與DPPH清除率之間的相關性不顯著；主成分分析發(fā)現(xiàn)，溶劑提取和超臨界萃取2種工藝制備的蠶蛹毛油氧化穩(wěn)定性差異較大，但經(jīng)精制處理后，二者的抗氧化能力又大幅下降至同一水平。

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The Effect of Refining Processes on Antioxidant Activity of Silkworm Pupa Oil

Liu Jun Zheng Cuicui Liao Sentai Zou Yuxiao Shi Ying Mu Lixia Lin Guangyue

(Sericultural & Agri-Food Research Institute Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Functional Foods, Ministry of Agriculture/ Guangdong Key Laboratory of Agricultural Products Processing, Guangzhou 510610)

Supercritical CO2fluid extraction (SFE) and solvent extraction were used to extract crude oil in silkworm pupa. During refining processes of degumming, deacidification, decoloration and deodorization, oil samples in each stage were collected to determine their color changes and evaluate the antioxidant capacity with different antioxidant measuring methods including FRAP, DPPH clearance, TPC and TCC. In addition, correlation and principal component analysis of different levels of antioxidant capacity were run. The experimental results showed that antioxidant activity of silkworm pupa oil from SFE was superior to N-hexane clearly. During the refining process, brightness of silkworm pupa oil increased, but yellow decreased, antioxidant ingredients lost and oxidation stability also decreased gradually. The refining process of silkworm pupa oil from two ways caused 24.73%～65.14% losses of TAC, 12.0%～69.27% losses of TCC, especially the highest losses during decoloring step. Correlation analysis found that antioxidant capacity of silkworm chrysalis oil was closely related to the contents of total phenol and carotenoids, but no significant correlation between FRAP and DPPH clearance was found. Principal component analysis suggested that, antioxidant activity of crude oil from SFE and solvent extraction had big differences, but after refining treatment, both total antioxidant capacity decreased to the same level significantly.

silkworm pupa oil, extraction, refining, antioxidation

Q5R91

A

1003-0174(2016)04-0051-06

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201403064)，現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系專項(CARS-22)，國家科技支撐計劃(2013BAD16B00)

2014-08-07

劉軍，男，1981年出生，助理研究員，農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏