權美平 鄭翠平 馬婷婷 田呈瑞

(陜西師范大學生命科學學院1 ，西安 710119)(陜西省多河流濕地生態(tài)與環(huán)境重點實驗室2 ，渭南 714000)(渭南師范學院化學與環(huán)境學院3 ，渭南 714000)

茜草精油抗氧化及抗癌活性研究

權美平1,2,3鄭翠平1馬婷婷1田呈瑞1

(陜西師范大學生命科學學院1，西安 710119)(陜西省多河流濕地生態(tài)與環(huán)境重點實驗室2，渭南 714000)(渭南師范學院化學與環(huán)境學院3，渭南 714000)

以水蒸氣蒸餾法提取茜草精油，以天然和合成的抗氧化劑為對照，用4種不同的抗氧化體系(ABTS+·，過氧化氫，F(xiàn)RAP和還原力)檢測法估價精油的抗氧化活性。精油呈現(xiàn)出在不同體系中劑量依賴式不同程度的功效?？拱┗钚缘臋z測使用人體乳腺癌MCF-7和宮頸癌Hela細胞株，結果發(fā)現(xiàn)精油對于2種腫瘤細胞均有較強活性，IC50分別為(1.052±0.396) mg/mL和(0.275±0.026) mg/mL，MTT和LDH檢測均表明精油抗癌活性對Hela細胞明顯更強；1 g精油中總酚含量為0.220 mg/mL沒食子酸當量。研究結果表明茜草精油可作為重要的天然抗氧化劑。

茜草精油 抗氧化 抗腫瘤 Hela細胞

近些年，由于合成化合物的安全性衍生的一系列問題促使人們加快對于植物資源的研究。許多天然植物和中草藥的有效成分具有抗氧化和清除自由基的作用，在醫(yī)學應用上具有很大的潛力。植物精油是從芳香植物中提取出來的具有一定香氣和揮發(fā)性的油狀物質；是一類天然植物性添加劑，能夠矯正食品的異味，賦予香氣，具有著色、抗菌消炎、防腐、抗氧化、抗腫瘤等作用。因此，植物精油常被開發(fā)成天然防腐劑和殺菌劑，廣泛應用于食品、醫(yī)藥及化妝品等領域[1-2]。

茜草為茜草科多年生攀援草本植物茜草(RubiacordifoliaL.)的干燥根及根莖。由于茜草干根及莖自古代就作為天然染料、食品的著色劑和藥用植物使用[3]，它的化學成分、藥理和臨床作用被深入系統(tǒng)研究。其主治吐血、衄血、崩漏、外傷出血、經閉瘀阻、關節(jié)痹痛、跌撲腫痛等[4]；亦具抗菌、抗癌、增強免疫、護肝、抑制人體表皮細胞增殖等生物活性。作為一種民族藥材，它有著悠久的應用歷史，但到目前為止還鮮見茜草精油的研究報道。本研究以水蒸氣蒸餾法提取的精油進行抗氧化活性研究，并對茜草精油抗癌活性進行評價，為茜草的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

細胞株：Hela和MCF-7細胞株，第四軍醫(yī)大學提供；茜草干根：西北中藥材市場；DMEM培養(yǎng)基：Gibco公司；新生牛血清：杭州四季青生物工程材料有限公司；二甲基四氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、DPPH、ABTS、TPTZ：Sigma公司；LDH試劑盒：南京建成生物工程研究所。其余所用試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設備

722型可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；倒置顯微鏡：Nikon公司；CO2細胞培養(yǎng)箱及全自動酶聯(lián)免疫檢測儀：美國Thermo Fotma公司；TY-80脫色搖床：常州市國立試驗設備研究所。

1.3 試驗方法

1.3.1 茜草精油的提取

采用揮發(fā)油提取器用常規(guī)水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油。具體操作：粉碎至40目的茜草干粉40 g，浸泡4 h后，置于1 000 mL圓底燒瓶中，加水500 mL，加熱回流提取揮發(fā)油，回流至揮發(fā)油量不再增加，停止加熱；正己烷萃取收集合并揮發(fā)油，以無水硫酸鈉干燥，得黃色片狀固態(tài)精油，-40 ℃保存以備用分析。

1.3.2 抗氧化試驗

精油的稀釋與準備：精確稱取20 mg的揮發(fā)油，加入10 mL DMSO，配制成初始濃度2.000 mg/mL，然后用倍半法稀釋為系列濃度，精油的濃度范圍0.016～2.000 mg /mL。

1.3.2.1 清除ABTS+·活力測定

參照Xu等[5]的方法。移取50 μL適當稀釋的樣品溶液(陽性對照VC和BHT，下同)，加入1.9 mL用甲醇稀釋至734 nm處吸光度為(0.700±0.050)的ABTS+·應用液，混合，室溫下避光反應6 min，測定其在734 nm處的吸光度。ABTS+·自由基清除率=(1-A1/A2)×100%，式中：A1為樣品管的吸光值；A2為對照管的吸光值。

1.3.2.2 過氧化氫清除力的測定

參考N. Ozsoy等[6]方法并稍作修改。將0.3 mL不同濃度樣液和0.9 mL磷酸緩沖液(50 mmol/L, pH 7.4)混合，再加入1.8 mL過氧化氫溶液后，震蕩混勻，10 min后在A230 nm測定吸光值，并用磷酸緩沖液代替過氧化氫做空白對照，H2O2清除率=(1-A1/A2)×100%，式中：A1為樣品管的吸光值；A2為對照管的吸光值。

1.3.2.3 還原力的測定

樣品提取液還原力的測定依照稍作修改的 Vaquero 等[7]的方法進行。取2.5 mL不同稀釋度的樣品提取液加入到裝有2.5 mL 0.2 mol/L pH 6.6的磷酸緩沖液的試管中，再加入2.5 mL 1%的鐵氰化鉀溶液混合均勻。50 ℃反應20 min后，加入2.5 mL 10%的三氯乙酸在3 000 r/min 的轉速下離心10 min，取上清液5 mL與4mL的蒸餾水和0.5 mL 0.1%的三氯化鐵溶液混合。反應10 min后，在700 nm 處測其吸光度?；旌弦旱奈舛仍礁弑硎緲悠诽崛∫旱倪€原能力越強。

1.3.2.4 總抗氧化能力測定(FRAP體系)

參照Benzie等[8]方法進行。以FeSO4為標液繪制標準曲線，根據(jù)反應后的吸光值，在標準曲線上求出相當于FeSO4的濃度(mg/mL)定義為FRAP值。FRAP值越大抗氧化活性越強。其具體步驟為：加入0.1 mL 不同濃度的FeSO4，加入3.1 mL蒸餾水和新鮮配制的預熱至37 ℃的1.8 mL 三吡啶三吖嗪(TPTZ)工作液?；靹蚝?，在37 ℃條件下水浴反應30 min，在593 nm波長處測定其吸光度。繪制標準曲線，其回歸方程為y=0.365 7x+0.055 5(R2=0.999 1)。精油的總抗氧化能力以樣品相當于FeSO4的濃度(mg/mL)表示。

1.3.3 抗腫瘤試驗

1.3.3.1 細胞培養(yǎng)及藥物處理

細胞采用含10%新生牛血清的1640培養(yǎng)基(100 U/mL青霉素、100 μg/mL 鏈霉素)，置于37 ℃含5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞貼壁生長，用0.25%的胰酶與0.02%的 EDTA(體積比1∶1) 消化傳代，取對數(shù)增殖期的細胞用于試驗。給予藥物時、精油以DMSO溶解且溶劑的終濃度在培養(yǎng)體系中保持在0.500 mg/mL以避免溶劑毒性。取細胞生長至對數(shù)期或密度達到90%以上的5×103細胞/孔細胞懸液接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，分別給予不同濃度的待測樣品溶液各10 μL (0、0.031、0.063、0.125、0.250、0.500、1.000、2.000 mg/mL)，在相同的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24 h，每濃度設3個復孔，并設空白(不加藥物)和溶劑對照。

1.3.3.2 MTT 法測定細胞活力

藥物處理結束，避光加入10 μL MTT(5 mg/mL), 置于細胞培養(yǎng)箱4 h后，吸棄培養(yǎng)基，每孔加150 μL DMSO，避光振蕩10min，至結晶完全溶解。酶標儀A490 nm測吸光值，計算平均值和標準差，按下公式計算癌細胞的存活率。存活率=A試驗孔/A對照孔×100%。

1.3.3.3 乳酸脫氫酶(LDH)檢測

細胞給藥處理同3.3.3.1，不同之處在于藥物處理 24 h后，直接離心，取上清(用24孔板操作)，然后按照LDH檢測試劑盒的說明進行操作，在酶標分析儀450 nm處檢測其OD值，然后按照公式計算細胞上清液中LDH的活性，LDH(U/L)=(A試驗孔- A對照孔)/(A標準孔-A空白孔) ×標準濃度×樣品稀釋倍數(shù)×1 000。

1.3.3.4 倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化

MTT試驗前，倒置顯微鏡觀察精油處理孔的細胞形態(tài)變化并拍照。

1.4 總酚含量測定

精油總酚含量的測定以福臨酚法進行且精油總酚含量以標準品沒食子酸當量(mg/mL)表示。

1.5 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，數(shù)據(jù)處理，顯著性檢驗及IC50的計算應用SPSS 18.0軟件進行，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 茜草精油的得率與形態(tài)

以水蒸氣蒸餾法可得茜草精油的提取率0.12%，密度測定為0.896 g/mL。室溫條件下茜草精油的顏色為黃色狀態(tài)為薄片狀結晶狀固態(tài)精油，具有特殊的刺激性芳香氣味。茜草精油是精油中為數(shù)不多的固態(tài)精油種類， Chen等[9]從健康的沉香木中所提取的精油即為固體精油，但目前大多數(shù)的研究報告證明芳香植物精油以液體精油占絕大多數(shù)。據(jù)Mitsuo等[10]報道可知，茜草精油的主要成分為mollugin(大葉茜草素占19.6%)和furomollugin (呋喃大葉茜草素占17.4%)。

2.2 茜草精油的抗氧化活性

2.2.1 清除ABTS+·活力測定結果

不同濃度的精油和陽性對照清除ABTS+·能力如圖1所示。精油、VC和BHT清除ABTS+·能力與所試濃度呈劑量依賴效應，在低濃度范圍內量效關系增加明顯；精油在低濃度范圍(<0.063)內，對ABTS+·清除力明顯低于VC和BHT，以BHT的清除活力最強；但精油在高濃度范圍內(>0.063)對ABTS+·清除基本與VC和BHT相當，表現(xiàn)出超強的抗氧化性，0.063 mg/mL時其清除率高達(98.380±0.820)%，稍高于VC (96.930±0.500%)和BHT(97.580±1.350%)；1.000 mg/mL和2.000 mg/mL精油與同濃度的陽性對照VC和BHT對ABTS+·的清除都基本完全，達100%?？梢?，精油具有較強的ABTS+·清除活力。

圖1 茜草精油、VC和BHT 對ABTS自由基的清除效果

2.2.2清除過氧化氫活力測定結果

不同濃度的精油和陽性對照清除過氧化氫能力如圖2所示。精油、VC和BHT清除過氧化氫能力與所試濃度呈劑量依賴效應；精油相對于陽性對照(VC和BHT)表現(xiàn)出明顯高的過氧化氫清除活力，在所試濃度范圍(0.063～2.000 mg/mL)，精油隨濃度增加清除活力的增加不明顯，清除率從(75.600±0.530)%～(97.310±0.500)%[VC從(15.580±0.420)%～(62.230±2.010)%，BHT從(20.260±0.680)%～(88.380±1.010)%]。三者對于過氧化氫清除的活力順序為精油>BHT>VC。

圖2 茜草精油、VC和BHT 對過氧化氫的清除效果

2.2.3 還原力的測定結果

不同濃度的精油和陽性對照的還原能力如圖3所示。精油、VC和BHT的還原能力與所試濃度呈劑量依賴效應，但精油的劑量效應性關系不明顯，其在所試濃度范圍內吸光值僅從0.277升高至0.369，而VC(0.299～0.603)和BHT(0.198～0.705)的變化要更明顯。同濃度范圍下(<1)，還原能力的大小順序為VC>BHT>精油。

圖3 茜草精油、VC和BHT 的還原能力

2.2.4 總抗氧化能力測定結果(FRAP體系)

測定FeSO4的標準曲線曲線方程：y=0.365 7x+0.055 5(R2=0.999 1)。不同濃度的精油和陽性對照的總抗氧化能力(FRAP體系)如圖4所示。不同濃度的精油和陽性對照的總抗氧化能力如圖4所示。精油、VC和BHT總抗氧化能力與所試濃度呈劑量依賴效應；精油相對于陽性對照(VC和BHT)表現(xiàn)出較低的總抗氧化活力，陽性對照VC則比BHT活力更高；精油的FRAP值其在所試濃度范圍的變化范圍為(0.676±0.01)～(3.673±0.03)，VC的FRAP值的變化范圍為[(2.055±0.00)～(4.423±0.15)]，BHT的FRAP值的變化范圍為(0.944±0.01)～(4.387±0.16)。三者總抗氧化活力順序為VC>BHT>精油。

圖4 茜草精油、VC和BHT 的總抗氧化能力

2.3 茜草精油的抗腫瘤活性

2.3.1 MTT法測定細胞存活率結果

茜草精油對2種癌細胞增殖效果的影響見圖6。精油質量濃度范圍內(0.031～2.000 mg/mL)明顯地以劑量依賴方式抑制了2種癌細胞的生長，且對于Hela細胞更為敏感，對其的抑制效果明顯比MCF-7強，Hela細胞存活率變化范圍[(30.500±1.500)%～(83.900±6.000)%)]，MCF-7細胞存活率變化范圍[(39.600±8.200)%～(86.200±3.700)%]；精油對于2種癌細胞的IC50分析表明：Hela細胞的IC50值(0.275±0.026) mg/mL，MCF-7細胞的IC50值1.052±0.396 mg/mL；顯著性分析表明，精油的各受試質量濃度條件下，細胞存活率與對照組相比都有顯著性差異(P<0.05)?？芍?，茜草精油對于Hela和MCF-7細胞均具較強的抗癌活性。

圖5 茜草精油對Hela和MCF-7細胞增殖的影響

2.3.2 LDH法檢測結果

LDH是從細胞內釋放出來檢測細胞凋亡的指示器。因此，可測定細胞培養(yǎng)液中LDH的活性來判斷樣品對細胞的損傷程度[11]。由圖6可知，細胞培養(yǎng)液中LDH活力與藥物呈現(xiàn)明顯呈劑量依賴效應，如：隨藥物濃度(0～2.000 mg/mL)，Hela細胞LDH的釋放量從(89.300±2.900)U/L增加到(264.300±4.600)U/L，MCF-7細胞LDH的釋放量從(81.700±2.600)U/L增加到(232.700±3.400)U/L，Hela細胞LDH的釋放量較大。此結果與茜草精油對Hela細胞的活性更強的MTT結果相吻合；顯著性分析表明：受試2種細胞在所試濃度下釋放出的LDH與對照組相比都有顯著性差異(P<0.05)。

圖6 茜草精油對Hela和 MCF-7細胞LDH的影響

2.3.3 細胞形態(tài)變化

從圖7的藥物處理組可知，給藥細胞明顯發(fā)生形態(tài)改變，細胞變形，發(fā)生皺縮，有些甚至發(fā)生大面積的調亡，形成許多的凋亡小體，由此可見精油對Hela和MCF-7細胞有著明顯的促凋亡作用。

圖7 茜草精油對MCF-7細胞形態(tài)的影響

2.4 精油總酚含量的測定結果

福林酚法測定所得沒食子酸的標準曲線方程為：y=8.481 7x+0.088 2(R2=0.996 7)；試驗所測定的精油總酚含量為1 g精油與0.220 mg/mL沒食子酸當量研究。研究表明[6,12]：總酚含量是主要地天然抗氧化活性成分；總酚含量與生物活性間有很強的呈正相關性關系。

3 討論與結論

大量研究分析表明，精油中化合物多為抗氧化劑[13]。Fatouma等[14]研究的茉莉精油強的抗氧化活性足以解釋此植物能治療多種疾病的原因，即精油的天然抗氧化劑與藥用植物的有益屬性密切相關。本研究以不同體系評價精油的抗氧化活性結果證明茜草精油具有較好的清除ABTS+·和過氧化氫的生物活性，總抗氧化能力和還原能力相對陽性對照較弱。

本研究以Hela和MCF-7為受試細胞株，精油處理后其存活率的IC50值分別為(0.275±0.026)mg/mL和(1.052±0.396) mg/mL，Hela細胞比MCF-7細胞的LDH檢測的結果值高都說明茜草精油具有抗癌活性，且茜草精油對于Hela細胞更敏感。

植物界的酚類化合物是植物發(fā)揮抗氧化潛力的主要源泉，是發(fā)揮抗氧化活性的主要貢獻和參與者[6]，抗氧化活性的強弱與酚類含量緊密相關；Wu等[15]和Bakkali等[14]研究表明精油中多酚類物質可以有效地導致腫瘤細胞凋亡或者細胞壞死。本研究測定出茜草精油的多酚含量為1 g精油與0.220 mg/mL沒食子酸當量相等，精油中的多酚含量可以解釋和支撐茜草精油的抗氧化和抗癌活性效果。

[1]Tian Jun, Ban Xiaoquan, Zeng Hong, et al. Chemical composition and antifungal activity of essential oil fromCicutavirosaL.var.latisectaCelak[J]. International Journal of Food Microbiology,2011,145(2/3):464-470

[2]Mohamed Hajji,Ons Masmoudi,Nabil Souissi,et al. Chemical composition, angiotensin I-converting enzyme (ACE) inhibitory, antioxidant and antimicrobial activities of the essential oil fromPeriplocalaevigataroot barks[J]. Food Chemistry, 2010, 121(3): 724-731

[3]Cai Yizhong,Sun Mei,Xing Jie,et al. Antioxidant phenolic constituents in roots ofRheumofficinaleandRubiacordifolia: structure radical scavenging activity relationships[J].Agricultral Food Chemistry,2004,52:7884-7890

[4]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:一部[S].北京:化學工業(yè)出版社,2005:162

[5]Xu JG,Hu QP,Liu Y, et al. Antioxidant and DNA-protective activities of chlorogenic acid isomers. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2012,60:11625-11630

[6]Ozsoy N,Can A,Yanardag R. Antioxidant activity ofSmilaxexcelsaL. leaf extracts[J]. Food Chemistry, 2008,(110):571-583

[7]Vaquero M J R,Serravvalie L R T,de Nadra M C M,et al. Antioxidant capacity and antibacterial activity of phenolic compounds from argentinean herbs infusions[J].Food Control,2010,21(5):779-785

[8]Benzie,Iris FF, J J Strain.The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of “antioxidant power”: the FRAP assay [J].Analytical Biochemistry,1996,23(9):70-76

[9]Chen Huaiqiong,Yang Yun,Xue Jian, et al. Comparison of compositions and antimicrobial activities of essential oils from chemically stimulated agarwood,wild agarwood and healthyaquilariasinensis(Lour.) Gilg Trees[J]. Molecules, 2011,(16):4884-4896

[10]Mitsuo Miyazawa, Jyunichi Kawata. Identification of key aroma compounds in dried roots of Rubia cordifolia[J]. Journal of Oleo Science,2006,55(1):37-39

[11]Cui Guoting, Zhang Wuxia, Zhang Amin,et al. Variation in antioxidant activities of polysaccharides fromFructusJujubaein South Xinjiang area [J]. International Journal of Biological Macromolecules,2013,57:278-284

[12]Lee YuLing,Huang GiWei, Liang ZengChin, et al. Antioxidant properties of three extracts fromPleurotuscitrinopileatus[J]. LWT-Food Science and Technology,2007(40):823-833

[13]Bakkali F, Averbeck S, Averbeck D,et al. Biological effects of essential oils-A review[J]. Food and Chemical Toxicology,2008,46:446-475

[14]Fatouma Abdoul-Latif, Prosper Edou, Fran?ois Eba, et al. Antimicrobial and antioxidant activities of essential oil and methanol extract ofJasminumsambacfrom Djibouti[J].African Journal of Plant Science,2010,4(3): 38-43

[15]Wu Xinjiang,Thorsten Stahl,Hu Ying,et al. The production of reactive oxygen species and the mitochondrial membrane potential are modulated during onion oil-induced cell cycle arrest and apoptosis in A549 cells[J].Nutrition,2006,136:608-613.

Antioxidant and Anticancer Activity of Essential Oil from Madder(Rubia cordifolia L.)

Quan Meiping1,2,3Zheng Cuiping1Ma Tingitng1Tian Chengrui1

(College of Life Science, Shaanxi Normal University1, Xi′an 710119)(Key Lab of River Wetland Ecology and Environment in Shaanxi Province2,Weinan 714000)(The College of Chemistry and Environment Science, Weinan Normal University3,Weinan 714000)

The antioxidant and anticancer activity of the essential oil by hydrodistillation from the roots of Rubia cordifolia was examined. 4 different antioxidant tests (evaluated by ABTS radical method, hydrogen peroxide-scavenging activity, the FRAP assay and reducing power assays.) were employed in order to evaluate the antioxidant activities of the essential oil, in addition, the results were compared with natural and synthetic antioxidants. The essential oil exhibited varying degrees of efficacy in each assay in a dose-dependent manner. The anticancer activity of this oil was tested on human breast carcinoma cell line MCF-7 and human cervical carcinoma cell line Hela. The oil was found to be very active against both tumor cell lines, with an IC50of (0.275±0.026) mg/mL for Hela and (1.052±0.396) mg/ml for MCF-7. The anticancer activity of the essential oil against Hela was significantly higher than against MCF-7 through MTT assay and released LDH assay. The levels of total phenolics in the oil were also determined as 0.220 mg/mL in 1 g essential oil. Our findings demonstrate that the essential oil from madder could be considered as a significant natural antioxidant source and be a good candidate for further investigations of new bioactive substances.

rubiacordifoliaL., essential oil, antioxidation, anticancer, Hela cell

Q946

A

1003-0174(2016)04-0089-06

2014年渭南師范學院特色學科建設(14TSXK04)

2014-07-28

權美平，女，1978年出生，副教授，植物資源開發(fā)與利用

田呈瑞，男，1955年出生，博士生導師，教授，植物資源開發(fā)與利用