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(南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院急診科，湖南 衡陽 421001)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

野黃芩素通過PI3K/Nrf2/HO-1途徑減輕LPS誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷

王彪，袁娜*，張永虎，曾良

(南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院急診科，湖南 衡陽 421001)

目的探討野黃芩素(SCT)對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的急性肺損傷(ALI)大鼠表達(dá)血紅素氧合酶-1(HO-1)的機(jī)制。方法大鼠靜脈內(nèi)注射LPS(30 mg/kg)以誘導(dǎo)ALI。1h后分別給予不同濃度的SCT(0.1，0.5和1.0 mmol/kg)靜脈注射。獲肺組織標(biāo)本，實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot分別檢測(cè)血紅素氧合酶-1(HO-1)mRNA及蛋白的表達(dá)；比色法檢測(cè)HO-1酶活性；HE染色觀察病理學(xué)改變情況。提取組織總蛋白和核蛋白，Western blot檢測(cè)PI3K磷酸化以及Nrf2核轉(zhuǎn)位情況，同時(shí)觀察SCT處理前后對(duì)大鼠血漿中TNF-α，IL-6和IL-10水平的影響。

野黃芩素； 急性肺損傷； 血紅素氧合酶1

急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是急診科最常見的危重病之一，其病理學(xué)上主要表現(xiàn)為肺泡毛細(xì)血管廣泛損傷，導(dǎo)致炎癥相關(guān)因子、蛋白酶和活性氧類過度釋放，并引起肺水腫、缺氧和纖維蛋白沉積[1]。ALI發(fā)生的過程中，多種細(xì)胞因子與炎癥相關(guān)介質(zhì)參與了本病的發(fā)生與發(fā)展過程，如TNF-α、IL-1和IL-6，高遷移率蛋白(high-mobility mobility group box,HMGB)1、一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase,iNOS)和一氧化氮(nitric oxide，NO)等[2]。盡管目前對(duì)ALI的治療方法有了較大的提高，但其死亡率依然可高達(dá)30%以上。血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)是催化血紅素分解為Fe2+，膽綠素和CO的限速酶。研究表明，HO-1及其代謝產(chǎn)物對(duì)中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)具有一定的抑制作用[3]。體外研究也表明，ALI大鼠給予藥物誘導(dǎo)HO-1表達(dá)后，可顯著降低其死亡率。這表明HO-1 對(duì)ALI的炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激具有一定的負(fù)向調(diào)控作用[4]。野黃芩素(Scutellarein，SCT)是從黃芩中分離出的一種黃酮類化合物單體。體外研究表明，SCT具有一定的抗炎與抗氧化活性，并能抑制核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的激活[5-6]。但SCT對(duì)ALI是否也具有保護(hù)作用目前仍不明確。本研究旨在探究LPS誘導(dǎo)的ALI動(dòng)物模型中，SCT能否影響HO-1的表達(dá)，并觀察其與細(xì)胞因子分泌的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1主要試劑與材料野黃芩素(SCT，純度98%)，錫原卟啉(SnPP，純度98%)購自Sigma-Aldrich?？笻O-1多克隆抗體、抗Nrf2多克隆抗體、抗鼠β-actin以及抗TATA盒結(jié)合蛋白(TBP)多克隆抗體購自Santa Cruz?？筽85α磷酸化和抗總p85α抗體購自Cell Signaling。HRP標(biāo)記IgG抗體購自Abcam。Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒購自Bio-Rad。TNF-α，IL-6和IL-10 ELISA檢測(cè)試劑盒購自深圳欣博盛生物科技有限公司；蛋白酶抑制劑購自Roche；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Applied Biosystems，RNA提取試劑盒購自GIBCO。細(xì)胞蛋白提取試劑盒購自Thermo。雄性8～10周齡SPF級(jí)Wistar大鼠(動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(湘)2015-0001，體重260～290 g)購自南華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 ALI模型的建立與實(shí)驗(yàn)分組60只Wistar大鼠于(23±1)℃、(55±5)%濕度環(huán)境下給予正常飼料喂養(yǎng)。本研究符合本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。大鼠采用1.5 g/kg的烏拉坦腹腔內(nèi)注射麻醉后，參照參考文獻(xiàn)提供的方法建立體外ALI模型[7]，并根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康姆譃?組(對(duì)照組、LPS組、0.1、0.5、1.0 mmol/kg不同濃度SCT干預(yù)組、SnPP干預(yù)組)，每組10只大鼠。對(duì)照組：大鼠頸靜脈滴注9 mL生理鹽水，該過程持續(xù)4 h，并在滴注生理鹽水1 h后再經(jīng)股靜脈注入2 mL林格氏液。LPS組：將LPS(30 mg/kg)溶解于9 mL生理鹽水中，頸靜脈滴入大鼠。在滴注LPS 1h后，大鼠同時(shí)給予2 mL林格氏液。4 h后用于下一步研究。SCT干預(yù)組： LPS建模開始1 h后，同時(shí)滴入不同濃度SCT(0.1，0.5和1.0 mmol/kg，用林格氏液溶解)[8]。 SnPP干預(yù)組：在LPS滴入前6 h腹腔注射30 mg/kg SnPP，其他同SCT干預(yù)組。

1.3實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)HO-1 mRNA表達(dá)用Trizol試劑提取大鼠肺組織總RNA并測(cè)量其濃度。取2 μg RNA將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。設(shè)計(jì)并合成HO-1與β-actin引物，其中HO-1引物序列分別為：5′-CGTGCAGAGAATTCTGAGTTC -3′(正向)和5′-AGACGCTTTACGTAGTGCTG -3′(反向)；β-actin：5′-CCTGTATGCCTCTGGTCGTA-3′(正向)和5′-CCATCTCTTGCTCGAAGTCT-3′。將上述cDNA產(chǎn)物置于實(shí)時(shí)定量PCR儀器上(Roche,LightCycle 480)，設(shè)置反應(yīng)條件： 95 ℃ 10 min，然后95 ℃ 10 s、61 ℃ 20 s、72 ℃ 10 s，共35個(gè)循環(huán)。通過比較HO-1和β-actin的Ct值，計(jì)算其相對(duì)倍數(shù)表示(2-ΔΔCt)。

1.4 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)與激酶磷酸化將肺組織中加入含蛋白酶抑制劑的Cocktails并制成勻漿，隨后加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的裂解液充分裂解。胞漿和核蛋白提取試劑盒嚴(yán)格根據(jù)廠家說明書進(jìn)行。將分別獲得的總蛋白用于檢測(cè)HO-1表達(dá)或PI3K磷酸化，核蛋白用于Nrf2核轉(zhuǎn)位分析。總蛋白或核蛋白用Bradford法于595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其濃度后，取20 μg蛋白用于12%聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)。隨后將蛋白凝膠轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h。隨后分別孵育一抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，ECL發(fā)光、顯影。

1.5 HO-1酶活性測(cè)定將大鼠肺組織制成勻漿，離心獲取上清用于HO-1酶活性分析。取400 μL上清建立反應(yīng)體系(0.8 mmol/L NADPH、2 mmol/L葡糖糖-6-磷酸鹽、0.2 U葡糖糖6磷酸鹽-1脫氫酶、2 mg大鼠肝臟胞漿、100 mmol/L PBS以及10 μmol/L氯化血紅素)。37 ℃避光孵育1 h，以生成的膽紅素量表示HO-1活性，單位為nmol/(mg protein·h)。最后加入1 mL氯仿終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀(imark,Bio-Rad)上設(shè)置雙波長(zhǎng)(463 nm和530 nm)測(cè)吸各反應(yīng)管的吸光度，結(jié)果以相對(duì)值表示(待測(cè)組/對(duì)照組)。

1.6細(xì)胞因子測(cè)定大鼠處理結(jié)束后獲取其血清，采用雙抗體夾心ELISA法測(cè)定TNF-α，IL-6和IL-10濃度。根據(jù)試劑盒提供的操作步驟，在包被有相應(yīng)細(xì)胞因子抗體的微孔板中加入100 μL待測(cè)血清，37 ℃孵育2 h。經(jīng)洗滌后，按照試劑盒的步驟分別加入一抗、二抗孵育。顯色后，測(cè)定450 nm處的吸光度值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算TNF-α，IL-6和IL-10的濃度。

1.7病理組織學(xué)分析肺組織用10%福爾馬林固定，用石蠟包埋后制備成厚度為4 μm的切片后用蘇木精和曙紅染色，并根據(jù)組織水腫和中性粒細(xì)胞滲出對(duì)肺組織的病理損傷進(jìn)行評(píng)分(損傷程度分為0～3級(jí))，最終分?jǐn)?shù)為水腫和滲出評(píng)分之和[7]。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并使用GraphPad Prizm 6.0統(tǒng)計(jì)軟件(San Diego,CA)分析數(shù)據(jù)，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 SCT促進(jìn)ALI大鼠肺組織中HO-1 mRNA和HO-1蛋白表達(dá)與對(duì)照組相比，大鼠注射LPS后肺HO-1 mRNA表達(dá)有輕度增高。而給予1.0 mmol/kg SCT處理后HO-1 mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05，圖1A)，HO-1蛋白表達(dá)與qPCR結(jié)果類似(圖1B)。

2.2 SCT上調(diào)ALI大鼠肺組織中HO-1的酶活性

模型組大鼠肺組織中HO-1酶活性輕微增高。給予0.1～1.0 mmol/kg SCT處理后，大鼠肺組織中HO-1酶活性隨SCT濃度的遞增逐漸增強(qiáng)。其中給予1.0 mmol/kg SCT處理后，HO-1的酶活性是模型組的2.2倍(圖2)。

2.3 SCT誘導(dǎo)ALI大鼠肺組織中PI3K磷酸化的影響未處理組大鼠肺組織中PI3K亞基p85α磷酸化水平較低。用不同濃度SCT干預(yù)后，能有效上調(diào)磷酸化p85α的水平。在所有處理組中，總p85α水平保持恒定(圖3)。

圖1 SCT對(duì)肺HO-1 mRNA和HO-1蛋白表達(dá)的影響 A：SCT誘導(dǎo)ALI大鼠表達(dá)HO-1 mRNA.與LPS陰性對(duì)照組相比，*P<0.05；與0.1和0.5 mmol/kg SCT比較，#P<0.05；B：SCT誘導(dǎo)肺組織HO-1蛋白表達(dá)

圖2 SCT上調(diào)ALI大鼠肺組織中HO-1酶活性 與LPS陰性對(duì)照組相比，*P<0.05；與0.1和0.5 mmol/kg SCT比較，#P<0.05

圖3 SCT對(duì)肺組織中PI3K磷酸化的影響 與LPS陰性對(duì)照組相比，*P<0.05；與0.1和0.5 mmol/kg SCT比較，#P<0.05

2.4 SCT誘導(dǎo)核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2核轉(zhuǎn)位與正常對(duì)照組相比，ALI模型組大鼠肺組織內(nèi)細(xì)胞核中Nrf2表達(dá)水平僅輕微增高。經(jīng)SCT處理后，細(xì)胞核中Nrf2水平明顯增多，而胞漿中的Nrf2含量隨之減少，表明SCT能誘導(dǎo)Nrf2從細(xì)胞漿轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中(圖4)。

圖4 CPC對(duì)肺組織中Nrf2核轉(zhuǎn)位的影響 與對(duì)照組相比，*P<0.05

2.5 SCT對(duì)血漿TNF-α，IL-6和IL-10水平的影響

ELISA結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠血漿中TNF-α，IL-6和IL-10濃度較低。給予LPS注射后，其含量顯著增高。同時(shí)給予不同濃度的SCT處理后，TNF-α和IL-6有所降低，而IL-10明顯增高。若給予HO-1抑制劑SnPP處理后，可在一定程度上消除SCT對(duì)細(xì)胞因子的影響，見表1。

表1不同濃度LE對(duì)ALI大鼠血漿細(xì)胞因子水平的影響(n=8)

TNF?α(ng/mL)IL?6(ng/mL)IL?10(pg/mL)對(duì)照組31．5±11．715．5±8．122．3±5．2LPS858．4±51．3a106．6±12．8a486．8±26．4aSCT 0．1mmol/kg858．4±51．396．5±9．7902．4±44．2bc 0．5mmol/kg476．2±18．2bc62．5±10．7b752．6±36．2bc 1．0mmol/kg465．6±29．4bc45．3±8．2bc978．5±25．6bcSnPP+SCT(1．0mmol/kg)785．4±33．6b78．1±6．5b589．1±37．5b

與對(duì)照組相比，a：P<0.05；與LPS組相比，b：P<0.05；與SnPP+ SCT相比，c：P<0.05

2.6 SCT對(duì)肺組織病理變化的影響LPS所致的ALI以水腫和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)為主要特征。光學(xué)顯微鏡結(jié)果表明，肺臟正常組織學(xué)評(píng)分為1。注射LPS后不僅引起肺泡間質(zhì)彌漫性水腫，同時(shí)引起肺泡含氣空間明顯減少，其組織學(xué)評(píng)分為5。1.0 mmol/kg SCT處理LPS大鼠后，肺組織學(xué)評(píng)分降低至3分(圖5)。

圖5 SCT對(duì)肺組織病理變化的影響(200×)

3 討 論

SCT是從唇形科黃芩屬和菊科飛蓬屬植物中分離出的一種黃酮類成分，藥理學(xué)研究表明，它具有擴(kuò)張血管、抗血小板以及抗氧化應(yīng)激損傷等效應(yīng)[5]。本研究采用不同濃度SCT處理ALI大鼠后，發(fā)現(xiàn)它能降低ALI大鼠血漿中TNF-α和IL-6的濃度。IL-6是一種促炎細(xì)胞因子，它在啟動(dòng)炎癥反應(yīng)和休克早期高凝狀態(tài)發(fā)揮至關(guān)重要作用。在ALI發(fā)生的過程中，肺組織水腫和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)是其主要特征，本研究也發(fā)現(xiàn)SCT處理后，可顯著減輕肺泡間質(zhì)彌漫性水腫程度，增加病理學(xué)評(píng)分，這表明SCT能有效改善ALI大鼠的局部炎癥反應(yīng)程度。本研究同時(shí)也發(fā)現(xiàn)SCT能增加IL-10的水平。IL-10對(duì)炎癥具有抑制作用，它能負(fù)向調(diào)控微生物所致的感染性休克[9-10]。IL-10的另一個(gè)重要生物學(xué)作用是能上調(diào)HO-1的表達(dá)。本研究也發(fā)現(xiàn)，SCT處理后，不但能上調(diào)其mRNA和蛋白表達(dá)水平，也能提高其酶活性。HO-1主要是通過其代謝產(chǎn)物來發(fā)揮作用。CO和膽綠素不僅可抑制巨噬細(xì)胞中iNOS的轉(zhuǎn)錄表達(dá)和TNF-α生成，同時(shí)也能增加抗炎性細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)，形成正反饋而調(diào)控炎癥反應(yīng)。如有研究顯示給予HO-1誘導(dǎo)劑CoPP能明顯抑制TNF-α和HMGB1的表達(dá)，從而緩解LPS所致ALI的病情[11]。此外，HO-1缺陷型小鼠IL-10水平降低，但I(xiàn)L-6產(chǎn)生增加，并且對(duì)內(nèi)毒素的敏感大大增強(qiáng)[12]。這些結(jié)果證明HO-1能負(fù)向調(diào)節(jié)IL-6、正向調(diào)節(jié)IL-10的分泌，從而減少內(nèi)毒素所致器官損傷。本研究也證實(shí)，SCT處理后，大鼠肺組織中HO-1的表達(dá)水平明顯增高，而采用其抑制劑SnPP處理后，可明顯消除SCT對(duì)TNF-α和IL-6分泌的抑制作用，這表明SCT最終可能通過上調(diào)HO-1的表達(dá)而參與其對(duì)ALI的保護(hù)作用。

HO-1受多重機(jī)制調(diào)控，包括絲裂原活化蛋白激酶、蛋白激酶C、活性氧、PI3K和核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2等[13-14]。PI3K是由p85、p55和p110等亞基組成的一種復(fù)合體。其中p85α亞基為調(diào)節(jié)亞基，其磷酸化后可激活下游蛋白激酶B(即Akt)而發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng)。本研究證實(shí)SCT處理后能明顯誘導(dǎo)p85磷酸化，表明SCT能激活PI3K?；罨腜I3K的另一作用就是激活核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2。細(xì)胞在靜息條件下，Nrf2與其抑制因子keap1結(jié)合并定位于細(xì)胞漿內(nèi)。多種外源性刺激可誘導(dǎo)keap1降解，Nrf2隨之轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核內(nèi)，并能與HO-1的啟動(dòng)子上游結(jié)合而誘導(dǎo)其表達(dá)[15-17]。本研究也證實(shí)SCT處理可誘導(dǎo)Nrf2核轉(zhuǎn)位，與肺組織中HO-1蛋白表達(dá)的趨勢(shì)一致，這表明Nrf2的激活是誘導(dǎo)HO-1表達(dá)的機(jī)制。總之，本研究證實(shí)SCT能有效改善LPS所致的ALI，其細(xì)胞保護(hù)作用可能歸因于其影響細(xì)胞因子的分泌，并激活PI3K/Nrf2通路并誘導(dǎo)HO-1表達(dá)有關(guān)。

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ScutellareinReducesLPS-inducedAcuteLungInjuryviaRegulationofPI3K/Nrf2/HO-1inEndotoxemicRats

WANG Biao,YUAN Na,ZHANG Yonghu,et al
(DepartmentofEmergency，theSecondAffiliatedHospitalofUniversityofSouthChina,Hengyang,Hunan421001,China))

ObjectiveTo observe the molecular mechanism of Scutellarein-induced heme oxygenase 1 (HO-1) expression in endotoxemic acute lung injury rat.MethodsRats were administered LPS (30 mg/kg) by intravenous infusion to induce ALI.Scutellarein (0.1,0.5 and 1.0 mmol/kg) was given 1 h after LPS initiation.Expression of HO-1 mRNA and protein in lungs were detected by real time PCR and Western blot,respectively.The enzymic activity of HO-1 was detected by colorimetric method;The tissue injury was analyzed by histopathology.Phosphorylation of PI3K and nuclear translocation of Nrf2 were measured by Western blot.The content of TNF-α,IL-6 and IL-10 were measured by ELISA in serum.ResultsLPS caused a slight HO-1 induction both at the mRNA and protein level,whereas administration of Scutellarein significantly induced higher HO-1 expression and enzymic activity,as compared with the LPS group.In addition,Scutellarein could also induce PI3K phosphorylation and Nrf2 nuclear translocation.Furthermore,0.5 and 1.0 mmol/kg of Scutellarein could attenuate plasma levels of TNF-α and IL-6,and further increased IL-10 levels compared with the LPS group.However,the beneficial effects of Scutellarein on cytokines expression were reversed by HO-1 inhibitor SnPP.ConclusionsScutellarein induces acute lung injury of endotoxemic rat expression of heme oxygenase-1 by activation of PI3K/Nrf2 pathway.

Scutellarein; acute lung injury; hemeoxygenase-1

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2016.04.012

2016-03-28；

2016-06-27

*通訊作者，E-mail：359503318@qq.com.

結(jié)果LPS注射后肺組織中HO-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平有所增加，而SCT處理后能進(jìn)一步上調(diào)HO-1表達(dá)水平，并能增強(qiáng)其酶活性。同時(shí)，SCT也可促進(jìn)PI3K磷酸化，并能誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子Nrf2核轉(zhuǎn)位。此外，0.5和1.0 mmol/kg的SCT能減少大鼠血漿中TNF-α和IL-6含量，并能進(jìn)一步增加IL-10水平。HO-1抑制劑SnPP處理后可消除SCT對(duì)細(xì)胞因子的影響。結(jié)論SCT可能通過激活PI3K/Nrf2誘導(dǎo)HO-1表達(dá)來減輕LPS所致炎癥反應(yīng)。

R563

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蔣湘蓮)