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(1.南華大學醫(yī)學院診斷學教研室，湖南 衡陽 421001；2.南華大學心血管疾病研究所)

·基礎醫(yī)學·

1,25-二羥維生素D3對棕櫚酸誘導巨噬細胞炎癥因子表達的影響

陳雯1，朱肖2，馮聚玲1，李熠1，游詠1，桂慶軍1，尹凱1,2*

(1.南華大學醫(yī)學院診斷學教研室，湖南 衡陽 421001；2.南華大學心血管疾病研究所)

目的研究1,25-二羥維生素D3(1,25(OH)2D3)對棕櫚酸(PMA)誘導THP-1巨噬細胞炎癥因子表達的影響及其機制。方法用1,25(OH)2D3(10 nmol/L)和/或PMA(250 μmol/L)處理THP-1巨噬細胞6 h，采用熒光定量PCR和酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)法檢測腫瘤壞死因子α(TNFα)、白細胞介素(IL)-1β、IL-6和IL-10的表達水平；用1,25(OH)2D3和/或PMA處理THP-1巨噬細胞60 min，采用免疫印跡(Western-blot)法檢測AMPKα1和磷酸化AMPKα1(p-AMPKα1)水平。結(jié)果1,25(OH)2D3(10 μmol/L))明顯抑制PMA(250 μmol/L)作用下THP-1巨噬細胞TNFα、IL-1β和IL-6的表達，并上調(diào)IL-10的表達；1,25(OH)2D3顯著上調(diào)THP-1巨噬細胞AMPKα1的磷酸化水平。結(jié)論1,25(OH)2D3抑制PMA誘導的THP-1巨噬細胞炎癥因子表達，該效應可能與其激活AMPKα1有關(guān)。

1,25-二羥維生素D3； 棕櫚酸； 巨噬細胞； 炎癥反應

維生素D(Vitamin D，VD)是一種脂溶性維生素，主要由皮膚合成和食物攝取。近來研究發(fā)現(xiàn)，VD不僅參與調(diào)節(jié)體內(nèi)鈣磷代謝，其水平還與多種慢性炎癥疾病，如肥胖、2型糖尿病和動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，As)等的發(fā)生呈顯著負相關(guān)，提示VD可能對體內(nèi)代謝性因素引起的慢性炎癥具有重要的調(diào)節(jié)作用[1]。VD進入血液后，經(jīng)肝臟25-羥化酶和腎臟共同作用轉(zhuǎn)化為具有活性的1,25-二羥維生素D3(1,25-dihydroxyvitamin D3,1,25(OH)2D3)。研究報道1,25(OH)2D3能夠抑制脂多糖(LPS)誘導的急性炎癥反應[2]。本實驗組前期發(fā)現(xiàn)，1,25(OH)2D3能夠調(diào)節(jié)THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞膽固醇流出，并促進IL-4誘導的巨噬細胞M2型極化[3]。血清游離脂肪酸(Free fat acid，F(xiàn)FA)水平升高是肥胖和2型糖尿病的主要脂質(zhì)代謝紊亂特征，然而1,25(OH)2D3是否調(diào)節(jié)FFA誘導的巨噬細胞炎癥尚不明確。本研究擬探討1,25(OH)2D3對棕櫚酸(PMA)誘導的THP-1巨噬細胞炎癥因子表達的影響和機制，為進一步研究VD與慢性代謝性疾病的關(guān)系提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要試劑棕櫚酸購自Sigma公司；1,25(OH)2D3購自美國Peprotech公司；人單核細胞株(THP-1)購自中科院上海細胞生物所細胞中心；RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；胎牛血清和小牛血清購自杭州四季清生物工程材料有限公司；兔抗人AMPKα1單克隆抗體和兔抗人AMPKα1 (phospho T172)多克隆抗體購自ABCam公司；小鼠抗人GAPDH單克隆抗體購自康成生物科技公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠二抗購自武漢博士德公司；TNFα、IL-1β、IL-6和IL-10 ELISA試劑盒購自R&D Systems公司；引物均由上海生物工程公司合成；其他試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。

1.2細胞培養(yǎng)人單核細胞株(THP-1)用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)液中加10 mmol/L的羥乙基哌秦乙硫磺酸(HEPES)和青霉素、鏈霉素各1.0×105U/L。在每次實驗前用160 nmol/L佛波酯(PMA)孵育THP-1細胞12 h，使其誘導分化成巨噬細胞。

1.3實時定量PCR 將1 μg總RNA用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas)反轉(zhuǎn)錄成20 μL cDNA。采用應用生物系統(tǒng)7900HT(Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR System)進行實時定量PCR，試劑盒為FINNZYMES公司的DyNAmoTMSYBR?Green qPCR Kits。擴增混合體系包括：去離子水13.5 μL,Master Mix 15 μL,cDNA 1μL,Primer 0.5 μL,共30 μL。溶解曲線分析表明PCR反應產(chǎn)物為單獨的雙鏈DNA。用ΔΔCt值法，以GAPDH表達為內(nèi)參定量其它基因的表達。人TNFα引物序列為：上游 5′-CAGAGGGAATTCC CCAG-3′，下游：5′-CCTTGGTCTGGTAGGAGACG-3′；人IL-1β引物序列為：上游 5′-ATGGCACAAGTACCTAAGCTCGC-3′，下游：5′-ACACAAATTGCATGGTGAAGTC AGTT-3′；人IL-6引物序列為：上游 5′-ATGAACTCCTTCTCCACAAGCGC-3′，下游：5′-GAAGAGCCCTCAGGCTGGACTG-3′；人IL-10引物序列為：上游 5′-GACTCCAA GAGA AAGGCATCTAC-3′，下游：5′-CCCTGATGTCTCAGTTTCGTATC-3′；人GAPDH引物序列：上游 5′-GGTGTGAACCATGAGAAGTATGA-3′，下游 5′-GAGTCC TTCCACGATACCAAAG-3′。

1.4 ELISA法檢測炎癥因子表達THP-1細胞以5×104個/孔接種于96孔板，以含10%的胎牛血清(FCS)培養(yǎng)，誘導分化為巨噬細胞。按不同處理因素進行處理，處理前加無血清培養(yǎng)基，處理后收集培養(yǎng)基，存儲于-20 ℃冰箱備用。按說明書方法，將100 μL樣品和標準品加入板孔，蓋上封板膜，室溫孵育1～2 h?？廴タ變?nèi)液體，重復洗板3次。加入50～100 μL生物素標記抗體，孵育1～2 h。扣去孔內(nèi)液體，又重復洗板3次。加入抗生物素蛋白鏈菌素-HRP，室溫孵育30 min。重復洗板3次后，加入顯色劑，室溫孵育10～20 min。終止反應后，用450 nm波長讀值。

1.5 Western-blot技術(shù)檢測AMPKα1和p-AMPKα1表達將收集好的細胞進行裂解，于4 ℃離心10 min，棄除沉淀，用BCA法進行蛋白質(zhì)定量。上樣緩沖液調(diào)各組蛋白量一致，經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠(AnyKD)，100 mV電泳2 h后轉(zhuǎn)移(4 ℃，100 mA，2 h)至PVDF膜上，麗春紅染色觀察轉(zhuǎn)移效果，并確定蛋白分子量標準的位置。用含5%脫脂奶粉的TBST封閉液封閉2 h，按1∶500加入兔抗人AMPKα1或p-AMPKα1或GAPDH(1∶1000)一抗，4 ℃培育過夜，TBST洗三次，1∶1000 加入辣根過氧化物酶標記二抗，室溫培育1 h，TBST洗三次，用Western blot免疫印跡熒光檢測試劑盒激發(fā)熒光，結(jié)果用Labwork凝膠圖像分析系統(tǒng)獲取各條帶的光密度值(OD值)。

1.6統(tǒng)計學處理實驗所得數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差表示，兩組間比較采用方差分析及t檢驗，P<0.05為差異有顯著性意義。

2 結(jié) 果

2.1 1,25(OH)2D3抑制PMA誘導THP-1巨噬細胞炎癥因子的表達用1,25(OH)2D3(10 nmol/L)和/或PMA(250 μmol/L)處理THP-1巨噬細胞6 h，采用熒光定量PCR和ELISA法檢測TNFα、IL-1β、IL-6和IL-10的表達水平。如圖1和圖2所示，1,25(OH)2D3(10 nmol/L)顯著抑制PMA(250 μmol/L)作用下THP-1巨噬細胞TNFα、IL-1β和IL-6的表達，并上調(diào)IL-10的表達水平。

圖1 1,25(OH)2D3對PMA作用下THP-1巨噬細胞炎癥因子mRNA表達的影響(n=3) 熒光定量PCR法檢測TNFα(左上圖)、IL-1β(右上圖)、IL-6(左下圖)和IL-10(右下圖)mRNA的表達(1,25(OH)2D3+PMA 與PMA組比較，*：P<0.05)

2.2 1,25(OH)2D3上調(diào)PMA作用下THP-1巨噬細胞AMPKα1磷酸化用1,25(OH)2D3處理THP-1巨噬細胞不同時間(0，15,30,60,120 min)，采用Western-blot檢測AMPKα1和磷酸化AMPKα1的表達，如圖3所示，1,25(OH)2D3上調(diào)THP-1巨噬細胞磷酸化AMPKα1水平。選擇60 min為時間點，如圖4所示，PMA下調(diào)THP-1巨噬細胞AMPKα1磷酸化，而1,25(OH)2D3顯著上調(diào)PMA(250 μmol/L)作用下THP-1巨噬細胞AMPKα1磷酸化水平。

3 討 論

流行病學調(diào)查顯示，我國超過90%以上的人群存在VD缺乏(參照美國內(nèi)分泌學會指南，血清25-羥膽鈣化醇(25(OH)D3)含量低于20 ng/mL為VD缺乏，低于30 ng/mL為VD不足)，提示VD缺乏是我國重要的健康問題[4]。除了參與鈣磷代謝，VD缺乏與多種慢性炎癥疾病密切相關(guān)，然而VD與上述疾病是否存在直接因果關(guān)系尚不明確[1]。1,25(OH)2D3是VD在體內(nèi)的活性成分，通過與維生素D受體(VDR)結(jié)合，啟動胞內(nèi)機制發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫功能、抑制炎癥和抗氧化等作用[5]。在前期研究中，發(fā)現(xiàn)VD能夠顯著促進As斑塊巨噬細胞向抗炎M2型極化，從而抑制As的發(fā)生發(fā)展[3]。在本研究中，發(fā)現(xiàn)1,25(OH)2D3能夠抑制PMA誘導的巨噬細胞炎癥反應，這進一步為VD與肥胖/2型糖尿病相關(guān)提供了直接的實驗證據(jù)。

近來研究發(fā)現(xiàn)，細胞代謝在調(diào)節(jié)巨噬細胞免疫/炎癥過程中起著關(guān)鍵作用[6]。在FFA、游離膽固醇等促炎因素作用下，巨噬細胞脂肪酸氧化(Fatty Acid Oxidation，F(xiàn)AO)水平明顯下降，有氧糖酵解(Aerobic Glycolysis，AG)活性顯著增加，導致細胞呈促炎狀態(tài)，表現(xiàn)為促炎因子TNFα、IL-1β和IL-6的上調(diào)及抗炎因子IL-10的下調(diào)[7-8]。5′單磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated Protein Kinase,AMPK)是維持細胞代謝平衡的關(guān)鍵蛋白酶，由α、β和γ 3個亞基組成的異源三聚體蛋白，其中α亞單位起催化作用，β和γ亞單位起穩(wěn)定作用[9]。研究證實，肥胖狀態(tài)下ATM的AMPK活性受到顯著抑制，細胞FAO水平明顯下降，AG活性顯著增加，因此調(diào)節(jié)AMPK活性成為改善胰島素抵抗和2型糖尿病新的靶點[10]。Li等[11]最近報道VD能夠通過激活AMPK/mTOR信號增強二甲雙胍對前列腺癌細胞的抑制作用[11]。VD能夠通過激活自噬介導的AMPK信號減輕魚藤酮引起的神經(jīng)損傷[5]。在本研究中，發(fā)現(xiàn)PMA能夠下調(diào)AMPKα1的磷酸化水平，而VD能夠顯著上調(diào)PMA作用下THP-1巨噬細胞AMPKα1的磷酸化水平，提示AMPKα1活化可能參與了VD對PMA誘導巨噬細胞促炎/抗炎因子表達的調(diào)節(jié)作用。然而，VD抑制PMA誘導的巨噬細胞炎癥反應是否通過調(diào)節(jié)細胞FAO/AG，將在后續(xù)實驗中進一步證實。

圖2 1,25(OH)2D3對PMA作用下THP-1巨噬細胞炎癥因子表達的影響(n=3) ELISA法檢測TNFα(左上圖)、IL-1β(右上圖)、IL-6(左下圖)和IL-10(右下圖)的表達(1,25(OH)2D3+PMA與PMA組比較，*：P<0.05)

圖3 1,25(OH)2D3對THP-1巨噬細胞AMPKα1和p-AMPKα1表達的影響(n=3) Western blot法檢測AMPKα1和p-AMPKα1表達(與0 min組比較，*：P<0.05)

圖4 1,25(OH)2D3對PMA作用下THP-1巨噬細胞AMPKα1和p-AMPKα1表達的影響(n=3) Western blot法檢測AMPKα1和p-AMPKα1表達(與control組比較，*：P<0.05；與PMA組比較，#：P<0.05)

綜上，本實驗證實VD抑制PMA誘導的巨噬細胞炎癥因子表達，并激活THP-1巨噬細胞AMPKα1磷酸化水平，這將為肥胖和2型糖尿病的防治提供一種新的思路。

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1,25-dihydroxyvitaminD3SuppressesPalmiticAcid-inducedInflammatoryCytokinesExpressionintheTHP-1Macrophage

CHEN Wen，ZHU Xiao，F(xiàn)ENG Juling，et al
(ResearchLabofTranslationalMedicine,MedicalSchool,UniversityofSouthChina,Hengyang,Hunan421001,China)

ObjectiveTo investigate the effect and mechanism of 1,25-dihydroxyvitamin D(1,25(OH)2D3) on palmitic acid(PMA)-induced inflammatory cytokines expression in THP-1 macrophage.MethodsThe THP-1 macrophages were cultured and incubated with 1,25(OH)2D3(10 nmol/L) and/or PMA(250 μmol/L) for 6h.The RT-PCR and ELISA technology were used to detect mRNA and protein expression of inflammatory cytokines including TNFα,IL-1β,IL-6 and IL-10 in different groups.The THP-1 macrophages were treated with 1,25(OH)2D3and/or PMA for 60min.The westernblot technology was used to detect the expression of AMPKα1 and AMPKα1 phosphorylation.Results1,25(OH)2D3obviously abolished the effect of PMA on the expression of inflammatory cytokines including TNFα,IL-1β,IL-6 and increased the expression of IL-10 in THP-1 macrophages.1,25(OH)2D3significantly promoted the phosphorylation of AMPKα1 in THP-1 macrophages.Conclusion1,25(OH)2D3can suppress PMA-induced inflammatory cytokines expression in THP-1 macrophages via regulation of AMPKα1 phosphorylation.

1,25-dihydroxyvitamin D； palmitic acid； macrophage； inflammation

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2016.04.008

2016-04-09；

2016-06-28

國家自然科學基金資助項目(81100213，81470569)；南華大學博士啟動基金(2015XQD49)；南華大學留學歸國人員啟動基金(2015XQD55).

*通訊作者，E-mail：kaiyinby@hotmail.com.

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蔣湘蓮)