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(1.南華大學醫(yī)學免疫學教研室/病原生物學研究所，湖南 衡陽 421001；2.南華大學附屬第一醫(yī)院檢驗科；3.南華大學病原生物學研究所； 4.Department of Microbiology and Immunology,UTHSCSA,USA)

·基礎醫(yī)學·

體外傳代選擇對鼠衣原體質粒缺失株培養(yǎng)特性的影響

陳超群1，任林2，陸春雪1，李忠玉3，鐘光明4，吳移謀3*

(1.南華大學醫(yī)學免疫學教研室/病原生物學研究所，湖南 衡陽 421001；2.南華大學附屬第一醫(yī)院檢驗科；3.南華大學病原生物學研究所； 4.Department of Microbiology and Immunology,UTHSCSA,USA)

目的探討傳代選擇對鼠衣原體質粒缺失株CMUT3菌株培養(yǎng)特性的影響及其相應機制。方法采用“無輔助感染”和“輔助感染”交替方式體外傳代培養(yǎng)CMUT3菌株，而后觀察傳代菌株和親代感染細胞時的吸附效率以及對離心因素的依賴性，并利用下一代測序技術對傳代菌株CMUT3G40和親代CMUT3G0進行全基因組測序分析。結果傳代菌株CMUT3G40在感染HeLa細胞時對離心因素依賴性降低，吸附試驗表明CMUT3G40菌株對細胞的吸附能力增強；比較基因組學分析結果表明CMUT3G40菌株與親代CMUT3G0在tc0237基因存在差異，TC0237Q117E錯義突變出現(xiàn)于CMUT3G40菌株基因組(CMUT3G40,99.7%；CMUT3G0,0%)。結論通過體外傳代培養(yǎng)CMUT3菌株可獲得吸附能力增強的菌株，該表型與傳代選擇所致的TC0237Q117E密切相關。

鼠衣原體； 質粒； 體外傳代； 選擇壓力； 下一代測序

鼠衣原體(Chlamydia muridarum,CM)，與沙眼衣原體(C.trachomatis,Ct)相似，是一種嚴格細胞內寄生、具有獨特發(fā)育周期的原核細胞型微生物，歸屬于衣原體科中的衣原體屬，在宿主細胞內增殖可觀察到原體(elementary body,EB)和始體兩種不同形態(tài)。CM的自然宿主為鼠類，可經呼吸道、消化道和生殖道等途徑感染宿主產生多種疾??；CM不感染人類，不引發(fā)任何已知的人類疾病。CM因其基因組與沙眼衣原體D血清型同源性高，同時小鼠生殖道CM感染模型可造成輸卵管積水等病變，這與女性生殖道Ct感染所引起的疾病相似，因而在衣原體學研究領域CM已廣泛應用于病原性衣原體致病機制和疫苗開發(fā)研究中[1-3]。

衣原體全基因組測序和注釋工作發(fā)現(xiàn)多種衣原體擁有一個大小為7.5 kb的質粒[4-6]，質粒關聯(lián)多種表型，如糖原聚積、調控染色體上多個基因的表達，此外質粒也是衣原體的一種重要毒力因子[4,7]；在自然狀況下，衣原體菌株丟失質粒的情形比較少見，若質粒缺失則表現(xiàn)為毒力減弱，可發(fā)展為衣原體減毒活疫苗：沙眼衣原體A血清型質粒缺失菌株感染非人靈長類動物恒河猴結膜上皮細胞后并不導致疾病而可誘導宿主產生保護性免疫[8]，CM質粒缺失株生殖道感染實驗小鼠并未誘導輸卵管積水等病理變化[9]。與質粒攜帶菌株相比，CM質粒缺失株在生物學性狀上表現(xiàn)為包涵體內糖原聚積障礙、糖原合酶表達或分泌水平下降[9-11]；為進一步認識質粒缺失菌株對外環(huán)境的適應情形，本研究基于巴斯德選擇(Pasteurian selection)[12]采用“無輔助感染”和“輔助感染”交替方式對CMUT3菌株進行體外傳代培養(yǎng)，比較傳代菌株和親代的培養(yǎng)特性變化，借助下一代測序(next generation sequencing,NGS)技術來探尋與表型相關聯(lián)的基因型。

1 材料與方法

1.1主要試劑和材料

1.1.1 衣原體菌株和細胞 CM質粒攜帶菌株由美國得州大學圣安東尼奧健康科學中心(UTHSCSA)鐘光明教授實驗室傳代保存；質粒缺失株CMUT3菌株，系采用新生霉素處理CM、結合噬斑形成實驗和以質?；蚓幋a蛋白-3(plasmid gene protein 3,Pgp3)為檢測對象的間接免疫熒光法(indirect immunofluorescence assay,IFA)篩選與鑒定[11]。HeLa細胞，購自ATCC。

1.1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基購自Sigma公司，胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)購自Gemini Bio公司，放線菌酮購自Sigma-Aldrich公司；兔抗CM多克隆抗體(編號為#1064)由鐘光明教授實驗室制備并保存；Cy2標記的羊抗兔IgG二抗購自Jackson ImmunoResearch公司，蛋白酶購自Life technologies公司，QIAamp DNA抽提試劑盒購自QIAGEN公司。

1.1.3 主要儀器 Olympus AX-70熒光顯微鏡，Optima L-100 XP超速離心機。

1.2方法

1.2.1 CMUT3菌株的體外傳代培養(yǎng) 參考文獻[13]進行，第一代采用“無輔助感染”方法，DMEM培養(yǎng)基洗滌24孔板中的單層HeLa細胞，加入CUMT3原代(generation 0，以CMUT3G0表示)感染液，每孔200 μL，37 ℃放置2 h后吸棄感染液，加入1 mL衣原體培養(yǎng)液(DMEM培養(yǎng)基，10%FBS，2 mg/L放線菌酮)，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～28 h，收集感染細胞于含玻璃珠和100 μL SPG緩沖液的離心管，振蕩裂解細胞，此即傳代的第一代(以CMUT3G1表示)。隨后采用“輔助感染”方法進行下一次感染，DMEM培養(yǎng)基洗滌HeLa細胞，每孔加入0.5 mL含30 mg/L DEAE-葡聚糖的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃放置10 min預處理HeLa細胞后加入CMUT3G1感染液200 μL，37 ℃放置30 min，補加1 mL DMEM培養(yǎng)基后室溫1000 r/min離心1 h，然后棄去接種液后加入1 mL衣原體培養(yǎng)液，培養(yǎng)24～28 h后收集感染細胞，此即傳代的第二代(以CMUT3G2表示)。第三代的感染方法與第一代相同，第四代的感染方法同第二代，依此類推，按上述“無輔助感染”和“輔助感染”交替方式連續(xù)傳代培養(yǎng)至第40代，隨后通過噬斑形成實驗分離得到CMUT3G40的單個噬斑，擴大培養(yǎng)后大規(guī)模感染HeLa細胞，密度梯度離心法分離純化EB。

1.2.2 離心因素對CM培養(yǎng)生長特性的影響分析 預冷DMEM培養(yǎng)基稀釋CMUT3G40、CMUT3G0和CMG0的EB，DMEM培養(yǎng)基洗滌24孔板(放置有滅菌的圓形蓋玻片)的單層HeLa細胞，每孔加200 μL EB稀釋液(每份樣品設置復孔，分別加樣于兩塊培養(yǎng)板內)，加樣結束后培養(yǎng)板轉移至37 ℃培養(yǎng)箱，采用兩種條件進行后續(xù)試驗：其一“無輔助感染”條件，37 ℃放置2 h后吸棄感染液，每孔加入1 mL衣原體培養(yǎng)液，CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h；其二離心“輔助感染”條件，培養(yǎng)板于37 ℃放置1 h，每孔補加DMEM培養(yǎng)基1 mL后室溫1000 r/min離心1 h，棄去孔內感染液，每孔加入衣原體培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。然后采用4%多聚甲醛固定和0.1% Trixton-100透膜打孔處理，洗滌后用4% BSA封閉，兔抗CM一抗37 ℃孵育1 h；Cy2標記的羊抗兔IgG二抗，Hoechst標記細胞核，37 ℃孵育1 h進行免疫熒光檢測，熒光顯微鏡下進行包涵體計數(shù)，每張蓋玻片隨機取5個視野計數(shù)，根據(jù)公式推算衣原體的數(shù)量，以包涵體形成單位(inclusion forming unit,IFU)表示(IFU/mL=5個視野的平均包涵體數(shù)目×視野校正因子×稀釋倍數(shù))，進一步計算IFU比值(即同一菌株離心“輔助感染”條件下的IFU平均值對“無輔助感染”條件下IFU平均值的比例)；實驗重復五次，IFU比值以均數(shù)±標準差表示。

1.2.3 吸附試驗 CMUT3G40和CMUT3G0的EB感染24孔板中單層HeLa細胞，參考文獻[13]進行：預冷DMEM培養(yǎng)基對EB進行適當稀釋以確保CMUT3G40和CMUT3G0的EB量(IFU數(shù)值)相當，預冷DMEM培養(yǎng)基洗滌單層HeLa細胞，每孔加入EB稀釋液200 μL，培養(yǎng)板置于4 ℃孵育1 h，隨后吸棄衣原體感染液，預冷DMEM培養(yǎng)基充分洗滌細胞，按前述方法進行IFA，熒光顯微鏡觀察計數(shù)EB數(shù)量，每張蓋玻片隨機選取5個視野計數(shù)，計數(shù)每個視野的EB和細胞數(shù)量，換算為視野中EB數(shù)量對細胞數(shù)量的比例。實驗重復三次(實驗結果以均值±標準差表示)。

1.2.4 CM基因組DNA的提取 將CMUT3G40、CMUT3G0和CMG0的EB感染細胞后擴大培養(yǎng)，大規(guī)模感染培養(yǎng)于6孔板的HeLa 細胞，按前述“輔助感染”方法采用DEAE-葡聚糖預處理單層HeLa細胞和室溫1000 r/min離心1 h的方法進行衣原體感染，離心結束后吸棄感染液，加入4 mL衣原體培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)24～28 h，PBS洗滌細胞后胰蛋白酶消化并收獲感染HeLa細胞，4 ℃下500×g離心10 min收集細胞沉淀，PBS重懸，冰上超聲裂菌，裂解物4 ℃下500×g 離心10 min去除較大的細胞殘骸，上清液于4℃下14 000 r/min離心30 min，細胞沉淀物重懸于PBS中，再次超聲裂菌，加入RNaseA和 DNaseⅠ后于37 ℃孵育1 h以去除宿主細胞DNA和RNA，轉移上清至超速離心管，密度梯度離心法分離純化EB，PBS洗滌后EB置于含100 mg/L 蛋白酶K的EB裂解緩沖液 (10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，1 mmmol/L EDTA，0.1% TritonX-100，0.5% SDS)中50 ℃孵育過夜，參考操作說明，QIAamp DNA抽提試劑盒提取CM基因組DNA，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 基因組測序、注釋和生物信息學分析 采用Illumina Hiseq2000測序技術平臺完成CMUT3G40、CMUT3G0和CMG0的基因組深度測序，由UTHSCSA格里希兒童癌癥研究中心(GCCRI)基因組測序小組完成；其實驗步驟如下：使用Covaris S220超聲波破碎儀超聲打斷基因組DNA而形成DNA片段，隨后采用TruSeq DNA樣品制備試劑盒構建 DNA-Seq 測序文庫，DNA-Seq測序文庫在Illumina Hiseq2000平臺采用50 bp的單端測序模塊進行測序，測序得到的原始數(shù)據(jù)經過CASAVA程序分用(demultiplexing)后，序列讀取信息采用FASTQ格式輸出，利用BWA-MEM計算程序[14]與CM染色體基因組參考序列(GenBank accession No.NC_002620.2)和質?；蛐蛄?NC_002182.1)進行比對分析，此時產生的SAM(Sequence alignment map)文件轉換成BAM(Binary aligment map)格式，利用Samtools[15]排序。插入和缺失(indels)使用默認參數(shù)的基因組分析工具包(Genome analysis toolkit)[16]進行重新排列。隨后參考文獻方法對所有突變及對應的基因、蛋白進行數(shù)據(jù)處理與分析[13]。

1.3統(tǒng)計方法采用Kruskal-Wallis檢驗方法進行檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1離心因素對CM體外培養(yǎng)的影響CMUT3G0菌株感染宿主細胞時在離心“輔助感染”條件下較“無輔助感染”條件形成較多包涵體，IFU比值在70左右，與質粒攜帶菌株CMG0的 IFU比值(40左右) 比較，二者差異有統(tǒng)計學意義(圖1)。傳代菌株CMUT3G40在離心“輔助感染”條件下包涵體形成情形與“無輔助感染”條件下差距不大，IFU比值在6左右，與CMG0菌株或CMUT3G0菌株的IFU比值比較，差異有統(tǒng)計學意義(圖1)。

圖1 離心因素對CM體外培養(yǎng)的影響 CMUT3G0與CMG0相比，*：P<0.05；CMUT3G40與CMG0或CMUT3G0比較，**：P<0.01

2.2吸附情況分析比較CMUT3G40菌株和CMUT3G0菌株等量EB對HeLa細胞的吸附能力，EB與HeLa細胞在4 ℃條件下孵育1 h后，HeLa細胞表面有較多CMUT3G40的EB，與CMUT3G0比較差異有統(tǒng)計學意義(圖2)，提示傳代菌株CMUT3G40對HeLa細胞有較好的吸附能力。

圖2 CMUT3對HeLa細胞的吸附力分析 A:IFA檢測CMUT3對HeLa細胞的吸附情況(×1000)；B：統(tǒng)計學分析(與CMUT3G0比較，*：P<0.01)

2.3全基因組測序結果分析以CM染色體基因組參考序列(GenBank accession No.NC_002620.2)和質?；蛐蛄?NC_002182.1)為參照，質粒攜帶菌株CMG0的質?；蛐蛄信c參考質?；蛐蛄型耆恢拢旧w基因也基本一致(tc0412基因在CMG0中存在多種突變類型)。與CMG0比較，質粒缺失株CMUT3G0表現(xiàn)為質?；蛉笔?，染色體基因tc0412的主要類型為“-472842 T”插入突變(頻率為96%)。比較基因組學分析傳代菌株CMUT3G40和親代CMUT3G0，二者的差別在于染色體基因tc0237，在CMUT3G40的基因組中tc0237基因存在點突變，即第277313位堿基由“G”變成“C”，相對應的氨基酸由TC0237的117位谷氨酰胺(Q)突變?yōu)楣劝彼?E)，而TC0237Q117E的突變現(xiàn)象并未發(fā)生于CMUT3G0(表1)。

表1質粒缺失株CMUT3在選擇壓力的核苷酸突變

基因組變異影響基因核苷酸變異密碼子變化氨基酸變化頻率(%)CMUT3G40CMUT3G0CMG0突變類型-G277313CTC0237G349Ccaa117GaaQ117E99．700錯義突變-472842TTC0412-84Tact28acTC29Lfs47?95．79612移碼突變-472923CTC0412-165Ctat28taCS56?fs56?007．4移碼突變C472963TTC0412c205Tcag69TagQ69?0016．9無義突變

fs：移碼突變，*：終止信號

3 討 論

衣原體缺乏主動穿入宿主細胞的能力，在體外培養(yǎng)過程離心通過促使衣原體與細胞接觸而有利于衣原體進入細胞，DEAE-葡聚糖可通過改變細胞表面電荷而促進衣原體與宿主細胞更好地接觸，從而提高其感染率；多年來，離心和DEAE-葡聚糖預處理宿主細胞這兩種“輔助感染”手段一直被用來最大限度地提高衣原體的感染率，并借此傳代培養(yǎng)并保存衣原體菌種。上述培養(yǎng)方式，除了標準化的養(yǎng)分供應及宿主細胞來源差異，不存在其他的選擇壓力，因此各實驗室保存的衣原體菌株基因組相對穩(wěn)定；但突變總是存在的，并隨著時間的推移而累積[17]，探尋這些基因突變及與之相關聯(lián)的表型，不僅可規(guī)范不同實驗室的標準菌株，使各實驗室的實驗結果具有可比性，而且可能為深入研究衣原體生物學特性奠定基礎。

設置選擇壓力，可有效關聯(lián)基因突變與表型改變的關系。沙眼衣原體D血清型陰道感染C3H/HeJ小鼠后，部分小鼠在感染后49天左右才能終止排菌，部分小鼠卻在感染后23天左右完全清除衣原體，分離培養(yǎng)上述兩種不同表型的Ct(分別命名為D-LC和D-EC)，研究發(fā)現(xiàn)上述表型與ct153基因的移碼突變有關[18]，以上結果表明Ct在體內培養(yǎng)過程中，某些基因可以發(fā)生突變，這種發(fā)生突變的衣原體菌株可以被累積并被分離培養(yǎng)出來。

本研究采用“無輔助感染”和“輔助感染”交替方式對CMUT3菌株進行體外傳代培養(yǎng)，這種人為因素造成的選擇壓力可促進高吸附力衣原體菌株的富集及分離。實驗室新分離的質粒缺失株CMUT3菌株在體外培養(yǎng)過程中明顯依賴于離心“輔助感染”因素，在離心條件下CMUT3菌株易與宿主細胞接觸，進而感染宿主細胞形成較多包涵體；傳代菌株CMUT3G40對離心因素的依賴程度顯著降低，同時對HeLa細胞的吸附能力顯著提高；這一表型變化對CMUT3菌株而言意義重要，作為候選疫苗，吸附能力增強的CMUT3菌株能更好地模擬自然條件下CM菌株感染宿主細胞的情形；然而吸附能力改變這一表型是否涉及基因型的改變需要進一步認識。全基因組測序及分析為揭示表型-基因型關聯(lián)提供可能，通過NGS技術對CMG0、CMUT3G0和CMUT3G40菌株進行全基因組測序，比較基因組學分析表明，在CMUT3G40菌株中，存在著TC0237Q117E的突變，而在CMUT3G0以及CMG0菌株不存在TC0237Q117E突變類型。

TC0237蛋白由159個氨基酸組成，含一個未知功能結構域-720(DUF720)的基序，這一基序也見于鄰近的TC0236蛋白(172 aa)和TC0235蛋白(170 aa)中，這三種蛋白質是同源的、由同一個操縱子編碼。TC0237、TC0236和TC0235在衣原體中高度保守，在沙眼衣原體D血清型與之對應的同源物是CT849、CT848和CT847。已有研究[19]表明TC0236Q119K置換突變可增強CM在細胞培養(yǎng)中的感染力和在小鼠下生殖道組織中的感染性，但目前還不清楚這是否有助于致病性的提高。結合本實驗結果，TC0237或TC0236蛋白可能參與了CM與宿主細胞的相互作用，其中某些位點的突變如TC0237Q117E可增強CMUT3菌株對宿主細胞的吸附能力。對比分析TC0237/TC0237Q117E蛋白的空間構象，可為宿主細胞中對應靶標分子的探尋提供依據(jù)從而進一步明確CM的粘附機制。

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EffectofInvitroPassagewithSelectionPressureonFitnessofPlasmid-freeChlamydiaMuridarumStrainCMUT3

CHEN Chaoqun,REN Lin,LU Chunxue,et al
(DepartmentofMedicalImmunology,InstituteofPathogenicBiology,UniversityofSouthChina,Hengyang,Hunan421001,China)

ObjectiveTo unravel the effect of passage selection pressure on fitness of plasmid-free Chlamydia muridarum strain CMUT3 and uncover the correlation between genetic and phenotypic signatures.MethodsCMUT3 organisms were in vitro passaged for 40 generations under the alternating unassisted/assisted-infection cycle conditions and the infectivity of initial and final generation organisms in cell culture was measured by comparing their attachment efficiency phenotype in the presence or absence of centrifugation.Next-generation sequencing technology was then used to sequence the genomes of passaged CMUT3G40 and the parental CMUT3G0.ResultsPassaged CMUT3G40 organisms became less dependent on centrifugation and more efficient for infecting HeLa cells in the absence of centrifugation compared to the parental CMUT3G0.Comparative genomes analysis of CMUT3G40 and CMUT3G0 revealed that a G to C substitution at position 277313,resulting in a glutamine to glutamic acid amino acid change in the protein product of TC0237 (99.7% in CMUT3G40 versus 0% in CMUT3G0 genomes).ConclusionThe TC0237Q117E missense mutation under in vitro passage selection pressure can be attributed to an in vitro attachment enhancement phenotype of plasmid-free C.muridarum CMUT3 organisms.

Chlamydia muridarum; plasmid; in vitro passage; selection pressure; next generation sequencing

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2016.04.007

2016-03-20；

2016-06-13

國家自然科學基金(81072417).

*通訊作者，E-mail:yimouwu@sina.com.

R374.3

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蔣湘蓮)