，，2#， ，，，， ，利軍，3， ，，， ，*

(1.南華大學(xué)心血管疾病研究所 動脈硬化學(xué)湖南省重點實驗室，湖南 衡陽 421001；2.南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院檢驗科；3.南華大學(xué)兒科學(xué)院 湖南省兒童醫(yī)院科教科)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

FGF-2上調(diào)Survivin蛋白的表達(dá)拮抗心肌細(xì)胞凋亡

李國華1，劉米華1，2#，彭娟1，肖衛(wèi)晉1，屈順林1，唐之晗1，郭芳1，彭利軍1，3，任重1，危當(dāng)恒1，劉錄山1，王佐1，姜志勝1*

(1.南華大學(xué)心血管疾病研究所 動脈硬化學(xué)湖南省重點實驗室，湖南 衡陽 421001；2.南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院檢驗科；3.南華大學(xué)兒科學(xué)院 湖南省兒童醫(yī)院科教科)

目的探討成纖維細(xì)胞生長因子-2(FGF-2)拮抗心肌細(xì)胞凋亡的作用機制。方法以H9c2大鼠心肌細(xì)胞作為實驗對象，用無血清培養(yǎng)基同步化培養(yǎng)24小時，心肌細(xì)胞隨機分為正常組(Control)、缺氧/復(fù)氧(H/R)組和H/R+FGF-2組。采用CCK-8比色法檢測心肌細(xì)胞存活率，Hoechst染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測心肌細(xì)胞凋亡。采用Western blot檢測生存素(Survivin)蛋白的表達(dá)。結(jié)果與正常組相比，H/R明顯抑制心肌細(xì)胞活力，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡(均P<0.01)；與H/R組相比，F(xiàn)GF-2顯著改善H/R心肌細(xì)胞活力，拮抗H/R心肌細(xì)胞凋亡，同時上調(diào)Survivin蛋白的表達(dá)(均P<0.05)。結(jié)論FGF-2拮抗心肌細(xì)胞凋亡的作用與其上調(diào)Survivin蛋白表達(dá)有關(guān)。

成纖維細(xì)胞生長因子-2； 細(xì)胞凋亡； 生存素

成纖維細(xì)胞生長因子-2(Fibroblast growth factor-2，F(xiàn)GF-2)是廣泛分布在體內(nèi)各個組織的多功能生長因子，具有極強的促有絲分裂作用，能促進細(xì)胞增殖、分化和遷移，具有強大的促血管新生作用。本課題組和國外其他學(xué)者的研究都表明，F(xiàn)GF-2是一種重要的內(nèi)源性細(xì)胞保護物質(zhì)，具有明顯的心肌保護作用，能夠拮抗心肌細(xì)胞凋亡[1-4]。FGF-2拮抗心肌細(xì)胞凋亡的作用主要與其結(jié)合FGF受體1(FGFR1)，激活蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular-signal regulated protein kinase，ERKs)和蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)，抑制c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)和蛋白激酶p38 (p38MAPK)，促進NO、Bcl-2和間隙連接蛋白43(Connexin 43，CX43)等蛋白表達(dá)，抑制Bax、Bim和p53等蛋白表達(dá)相關(guān)[2,4,5]。然而，F(xiàn)GF-2抑制心肌細(xì)胞凋亡的機制仍未完全闡明。

生存素(Survivin)是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein，IAP)家族中最小成員，是目前發(fā)現(xiàn)的效應(yīng)最強的抑凋亡基因之一，具有調(diào)控細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞凋亡，促進細(xì)胞增殖，促進血管形成等功能，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色[6-7]。近期研究表明，Survivin在心血管疾病中也扮演著重要的角色，主要發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡，促進損傷修復(fù)及重構(gòu)，促血管新生和細(xì)胞增殖等作用[8]。研究發(fā)現(xiàn)，缺血預(yù)處理(Ischemic preconditioning，IPC)[9-10]、阿片受體激動劑[11]、胰島素[12-13]、右丙亞胺(Dexrazoxane，DRZ)[14]均可上調(diào)心肌細(xì)胞Survivin蛋白的表達(dá)，抑制心肌細(xì)胞凋亡。但是Survivin是否在缺氧/復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)心肌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，以及FGF-2對H/R心肌細(xì)胞中Survivin表達(dá)的影響及意義，尚不明確。本研究以H9c2大鼠心肌細(xì)胞為研究對象，初步探討Survivin是否在FGF-2拮抗H/R心肌細(xì)胞凋亡中發(fā)揮作用，為缺血性心臟病的治療提供新思路和新的干預(yù)環(huán)節(jié)。

1 材料與方法

1.1藥物與試劑H9c2大鼠心肌細(xì)胞系購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清為美國HyClone公司；Recombinant Rat FGF-2購于美國PeproTech公司；CCK-8試劑盒為廣州奕源生物科技有限公司；胰蛋白酶、Hoechst33258凋亡檢測試劑盒、兔抗大鼠Survivin多克隆抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗均為江蘇碧云天生物技術(shù)研究所；BCA蛋白定量試劑盒和兔抗大鼠β-actin多克隆抗體均為北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；FITC Annexin V Apoptosis Detection KitI購于美國BD pharmingen公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2心肌細(xì)胞的培養(yǎng)與實驗分組H9c2大鼠心肌細(xì)胞接種于含12%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，放在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞用胰蛋白酶消化傳代、收集，取生長狀態(tài)良好的心肌細(xì)胞進行實驗。每次實驗前用無血清培養(yǎng)基同步化培養(yǎng)24小時，再加藥物預(yù)處理。心肌細(xì)胞隨機分為：正常組(Control)；H/R組；H/R+FGF-2組，心肌細(xì)胞預(yù)孵育10 ng/mL FGF-2 30分鐘，缺氧90分鐘，復(fù)氧120分鐘。

1.3心肌細(xì)胞H/R模型的建立根據(jù)文獻所報道的方法，建立心肌細(xì)胞H/R損傷模型：同步化的心肌細(xì)胞，更換為無糖和無血清的Hanks’平衡鹽溶液(1.3 mM CaCl2，5 mM KCl，0.3 mM KH2PO4，0.5 mM MgCl2， 0.4 mM MgSO4，69 mM NaCl，4 mM NaHCO3和0.3 mM Na2HPO4)，Hanks’平衡鹽溶液預(yù)先用95% N2～5% CO2飽和，將培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板置于持續(xù)95%N2～5% CO2平衡的缺氧孵育容器中(O2濃度≤1%)，37 ℃，90分鐘后，更換為預(yù)平衡(37 ℃、95% O2～5% CO2)的無血清DMEM培養(yǎng)基，放入37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)120分鐘，結(jié)束實驗。

1.4 CCK-8比色法檢測心肌細(xì)胞存活率根據(jù)CCK-8試劑盒說明書，將H9c2大鼠心肌細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，計數(shù)，接種于96孔培養(yǎng)板中，100 μL/孔，每孔細(xì)胞數(shù)大于1000個，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜或大于5個小時。當(dāng)細(xì)胞生長到培養(yǎng)孔的70%～80% 面積時，加入不同的處理因素，每個處理因素至少設(shè)3個復(fù)孔和1個空白孔。終止處理后，每孔加10μlCCK-8溶液，避免產(chǎn)生氣泡，37C 孵育1.5小時，用酶標(biāo)儀(λ= 450 nm )測定各孔的吸光度(OD)。取3孔OD值的平均數(shù)，按公式計算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率(%)=(處理組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%，至少重復(fù)3次。

1.5 Hoechst染色觀察心肌細(xì)胞凋亡將心肌細(xì)胞懸浮液接種于6孔板內(nèi)，待細(xì)胞貼壁后，按實驗設(shè)計給予不同藥物處理，實驗結(jié)束后，棄去培養(yǎng)液。PBS清洗3遍，每次3～5分鐘，加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞15分鐘，棄去固定液，用PBS清洗3遍，Hoechst33258染色液染色20分鐘，去離子水沖洗3遍，每次3～5分鐘。在熒光顯微鏡下，以紫外光340 nm波長激發(fā)，觀察并攝片。

1.6流式細(xì)胞術(shù)檢測心肌細(xì)胞凋亡率取生長狀態(tài)良好的心肌細(xì)胞，以2×105個/mL的細(xì)胞密度接種于50 mL的培養(yǎng)瓶，放在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長至70%～80%融合狀態(tài)時，更換為含0.1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基同步化培養(yǎng)24小時，再按實驗分組加入不同的處理因素繼續(xù)孵育，最后收集細(xì)胞。

PBS液清洗1次后，根據(jù)美國BD pharmingen公司的FITC Annexin V Apoptosis Detection KitI說明書，采用FITC-Annexin V/PI雙染色，結(jié)合流式細(xì)胞儀，檢測心肌細(xì)胞凋亡率。

1.7 Western blot檢測蛋白表達(dá)按照哺乳動物蛋白抽提試劑盒說明書提取細(xì)胞總蛋白，利用BCA 蛋白定量試劑盒進行蛋白定量；在蛋白上清溶液加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，在100℃沸水，加熱10分鐘，使蛋白質(zhì)變性；采用12.5%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳1.5小時，接著220 mA電流轉(zhuǎn)膜2小時，使蛋白由凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜；含5%脫脂奶粉的TBST封閉2 h；用含有抗Survivin(1∶1000)、β-actin(1∶2000)一抗的 TBST溶液，4℃孵育過夜，TBST洗滌3次；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗 (1:1000)，室溫孵育2小時，TBST洗滌3次；用ECL化學(xué)發(fā)光劑進行曝光顯影，采用完全自動的化學(xué)發(fā)光圖像拍攝和分析系統(tǒng)，攝像和分析目的蛋白和內(nèi)參蛋白的灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 FGF-2對H/R心肌細(xì)胞活力的影響心肌

細(xì)胞活力變化如圖1所示，H/R顯著抑制心肌細(xì)胞活力，與正常組(96.0±2.8%)相比，差異具有顯著性(P<0.01)。H/R+FGF-2組(89.0±3.0%)心肌細(xì)胞活力明顯增強，與H/R組(81.3±2.6%)相比，差異具有顯著性(P<0.05)。以上結(jié)果提示FGF-2能明顯改善H/R心肌細(xì)胞的活力。

圖1 FGF-2改善H/R心肌細(xì)胞的活力 與Control比較，*：P<0.05，**：P<0.01；與H/R比較，#:P<0.05，n=3

2.2 FGF-2對H/R心肌細(xì)胞凋亡的影響首先采用Hoechst染色，觀察H9c2心肌細(xì)胞凋亡的核形態(tài)變化(圖2)。Hoechst染色后，正常心肌細(xì)胞的細(xì)胞核大小形態(tài)較為均一，多呈圓形或橢圓形，形態(tài)清晰完整，熒光染色呈勻質(zhì)狀，而凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核染色較亮，核濃染，核固縮，或呈半月形和圓形凝聚。正常組存在少量心肌細(xì)胞凋亡，H/R可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，與正常組相比，H/R組凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增多，但加入FGF-2預(yù)孵育后，H/R所誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡數(shù)明顯減少。

圖2 FGF-2對H/R心肌細(xì)胞凋亡的影響 (200×)

進一步采用FITC-Annexin V/PI雙染色流式細(xì)胞術(shù)，檢測各組心肌細(xì)胞的凋亡率。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果如圖3所示，正常組心肌細(xì)胞凋亡率為3.1±0.8%。H/R組心肌細(xì)胞凋亡率為13.6±1.4%，與正常組相比，差異具有顯著性(P<0.01)。H/R+FGF-2組心肌細(xì)胞凋亡率降低至7.5±1.2%，與H/R組相比，差異具有顯著性(P<0.05)。此結(jié)果與Hoechst染色的結(jié)果吻合。以上結(jié)果說明FGF-2明顯拮抗H/R所誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。

圖3 FGF-2抑制H/R心肌細(xì)胞的凋亡 與Control比較，**：P<0.01；與H/R比較，#:P<0.05，n=3

2.3 FGF-2對H/R心肌細(xì)胞Survivin蛋白表達(dá)的影響Survivin是一個抗凋亡蛋白，從圖4可以看出，H/R對心肌細(xì)胞Survivin蛋白表達(dá)不會造成什么影響，與正常組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。但在H/R的基礎(chǔ)上加入FGF-2后，Survivin蛋白表達(dá)明顯增加，與H/R組相比，差異具有顯著性(P<0.01)，這提示FGF-2能促進H/R心肌細(xì)胞Survivin蛋白的表達(dá)。

圖4 FGF-2促進H/R心肌細(xì)胞Survivin蛋白的表達(dá) 與H/R比較，**:P<0.01，n=3

3 討 論

缺血性心臟病已成為嚴(yán)重威脅人類健康的常見病、多發(fā)病。盡量縮短組織缺血時間，及時有效的恢復(fù)心肌血液供應(yīng)是挽救缺血性心臟病的最有效辦法。但是再灌注治療不可避免的會給心肌帶來缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，IRI)。心肌IRI的機制復(fù)雜，而心肌細(xì)胞凋亡是其主要病理機制之一[15]。

本課題組前期研究[1]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF-2可以減少大鼠離體再灌注心臟細(xì)胞色素C(cytochrome c)的釋放，提示FGF-2很可能具有抗心肌細(xì)胞凋亡作用。本實驗采用H9c2大鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷模型，缺氧90分鐘，復(fù)氧120分鐘，采用Hoechst染色及FITC-Annexin V/PI雙染色流式細(xì)胞術(shù)，發(fā)現(xiàn)FGF-2顯著降低心肌細(xì)胞凋亡率。本課題組[2]最近研究發(fā)現(xiàn)FGF-2拮抗H2O2所誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞凋亡。Iwai-Kanai，等[16]發(fā)現(xiàn)FGF-2可以拮抗LPS或H2O2所誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。Wang等[17]發(fā)現(xiàn)FGF-2可以對抗阿霉素所誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。Wang，等[5]發(fā)現(xiàn)FGF-2可以拮抗過氧化氫叔丁醇(tert-Butyl hydroperoxide solution，TBHP)所誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果表明FGF-2具有抗心肌細(xì)胞凋亡作用。

Survivin是分子量最小的IAP成員，其基因位于染色體17q25，可編碼產(chǎn)生由142個氨基酸組成的胞漿蛋白，分子量約為16.5kD。它主要表達(dá)于胚胎組織和腫瘤組織，而在終末分化成熟的正常成人組織中無表達(dá)或低表達(dá)。但是Santini[18]等人采用免疫組化檢測急性心肌梗死患者的心肌組織，發(fā)現(xiàn)Survivin在遠(yuǎn)離梗死部位心肌的表達(dá)比梗死周圍心肌表達(dá)的比例高，并且高于正常對照。Survivin的表達(dá)與心肌凋亡和心室重構(gòu)呈負(fù)性相關(guān)，并且Survivin的表達(dá)與受威脅心肌的存活相關(guān)，并預(yù)示急性心肌梗死后良性重構(gòu)的發(fā)生。有研究發(fā)現(xiàn)，在充血性心衰患者，心肌細(xì)胞Survivin蛋白的表達(dá)與細(xì)胞大小和DNA含量相關(guān)，并且在減輕心臟負(fù)荷后表達(dá)明顯下降，提示Survivin蛋白很可能減輕心室肥厚的發(fā)生[19]。在自發(fā)性高血壓大鼠，Survivin蛋白表達(dá)指數(shù)與心肌凋亡和不良性心肌重構(gòu)呈負(fù)相關(guān)，提示Survivin很可能抑制心肌細(xì)胞凋亡，改善不良性心肌重構(gòu)[20]。本實驗采用Western blot方法觀察FGF-2對H/R心肌細(xì)胞Survivin蛋白表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)FGF-2能促進H/R心肌細(xì)胞Survivin蛋白的表達(dá)。

Survivin可以拮抗心肌細(xì)胞凋亡，發(fā)揮心肌保護作用。研究發(fā)現(xiàn)，IPC可以通過激活PI3k-Akt-GSK-3β-β-catenin信號通路，上調(diào)Survivin、Bcl-2和VEGF的表達(dá)，促進心肌梗死后大鼠血管新生，拮抗大鼠心肌細(xì)胞凋亡[10]；當(dāng)沉默β-catenin表達(dá)后，IPC對缺血大鼠心臟心功能的改善作用及對心肌細(xì)胞凋亡的抑制作用被消弱，這很可能與Survivin、Bcl-2和VEGF蛋白表達(dá)受抑制有關(guān)[9]。阿片受體激動劑嗎啡和δ阿片受體激動劑DADLE均能通過激活MEK1/2-ERK1/2信號通路，上調(diào)Survivin蛋白的表達(dá)，拮抗饑餓所誘導(dǎo)的原代大鼠心肌細(xì)胞凋亡[11]。胰島素可以通過激活PI3K-Akt-mTOR信號通路，上調(diào)大鼠缺血/再灌注心肌Survivin蛋白的表達(dá)，拮抗心肌細(xì)胞凋亡和縮小心肌梗死面積，通過上調(diào)H/R心肌細(xì)胞Survivin蛋白表達(dá)，拮抗原代大鼠心肌細(xì)胞凋亡[12]；胰島素可以通過激活PI3K-Akt-mTORC1信號通路，阻止轉(zhuǎn)錄因子Sp1的降解，促進心肌細(xì)胞Survivin蛋白的表達(dá)，抑制心肌細(xì)胞凋亡，拮抗阿霉素對心肌細(xì)胞的毒性[13]。DRZ通過增加HIF-1a和HIF-2a的表達(dá)及增強其轉(zhuǎn)錄活性，促進Survivin、Mcl-1和HO蛋白的表達(dá)，拮抗阿霉素對H9c2心肌細(xì)胞的毒性[14]。因此，以上研究表明FGF-2通過上調(diào)Survivin蛋白的表達(dá)，改善H/R心肌細(xì)胞活力，拮抗H/R心肌細(xì)胞凋亡。本課題組[2]最近研究發(fā)現(xiàn)FGF-2可拮抗氧化應(yīng)激引起的H9c2心肌細(xì)胞凋亡，其機制與激活PI3K-Akt-FoxO3a信號通路有關(guān)。所以我們推測FGF-2很可能通過激活PI3K-Akt信號通路，上調(diào)Survivin蛋白的表達(dá)，拮抗H/R心肌細(xì)胞凋亡，這需要下一步研究證實。

總之，本實驗結(jié)果表明，F(xiàn)GF-2拮抗心肌細(xì)胞凋亡的作用與其上調(diào)Survivin蛋白表達(dá)有關(guān)。這進一步充實了FGF-2拮抗心肌細(xì)胞凋亡，發(fā)揮心肌保護作用的作用機制，可為缺血性心臟病的防療提供新思路。

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FGF-2InhibitsCardiomyocytesApoptosisInducedbyHypoxia/reoxygenationviaUpregulatingtheExpressionofSurvivininH9c2cells

LI Guohua,LIU Mihua,PENG Juan,et al
(InstituteofCardiovascularDisease,KeyLabforArteriosclerologyofHunanProvince,UniversityofSouthChina,Hengyang,Hunan421001,China)

ObjectiveTo investigate the mechanism of FGF-2’s fighting against H9c2 cardiomyocytes apoptosis induced by Hypoxia/reoxygenation(H/R).MethodsH9c2 cardiomyocytes was employed as the experimental object,cells were incubated by free serum for 24 h for synchronous cell cycle,then,H9c2 cardiomyocytes were randomly divided into 3 groups:Normal group(Control)，H/R group, H/R+FGF-2 group.The viability of cardiomyocytes was measured by CCK-8.The apoptosis rate of cardiomyocytes was detected by Hoechst and Armexin-V/PI assays with flow cytometry.Survivin expression were analyzed by western Blot.ResultsCompared to the Contrd group,H/R significantly decreased the viability of cardiomyocytes and induced cardiomyocytes apoptosis(P<0.01).Treatment with FGF-2 for H/R significantly increased the viability of cardiomyocytes subjected to H/R,suppressed cardiomyocytes apoptosis induced by H/R and up-regulated the expression of Survivin (P<0.05).ConclusionFGF-2 inhibits cardiomyocytes apoptosis induced by H/R in H9c2 cells,which the mechanism may be related to the up-regulation of Survivin expression.

fibroblast growth factors-2； apoptosis； survivin

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2016.04.006

2016-05-08；

2016-06-29

國家自然科學(xué)基金項目(81470435、81541005)、湖南省衛(wèi)生廳科研計劃課題(B2011-041).

*通訊作者，E-mail：zsjianglab@aliyun.com.

#同為第一作者

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秦旭平)