鄭雯琳 張銘 袁薇 陳依江

(貴州省疾病預(yù)防控制中心，貴州 貴陽(yáng) 550004)

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線性探針技術(shù)在貴州地區(qū)耐藥結(jié)核病診斷中的應(yīng)用價(jià)值

鄭雯琳 張銘 袁薇 陳依江

(貴州省疾病預(yù)防控制中心，貴州 貴陽(yáng) 550004)

結(jié)核分枝桿菌； 線性探針； 耐藥性

結(jié)核病是全球嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一，據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)報(bào)告[1]，每年有約145萬(wàn)人死于該病。我國(guó)近年來(lái)結(jié)核病的發(fā)病率也日趨上升，現(xiàn)已有結(jié)核病人450萬(wàn)例，且每年病死13萬(wàn)例。其中耐多藥結(jié)核病是我國(guó)現(xiàn)階段結(jié)核病防控工作面臨的最大挑戰(zhàn)之一[2]。為了進(jìn)一步推進(jìn)耐多藥結(jié)核病防治工作，近年來(lái)我國(guó)已經(jīng)開(kāi)始引進(jìn)耐藥結(jié)核分枝桿菌分子生物學(xué)快速檢測(cè)技術(shù)以代替耗時(shí)的需借助于培養(yǎng)基的常規(guī)檢測(cè)方法。本研究對(duì)貴州本地200例分離培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌菌株進(jìn)行檢測(cè)，與傳統(tǒng)比例法結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，探討該方法針對(duì)貴州地區(qū)的耐藥結(jié)核分枝桿菌的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 貴州羅甸200株痰培養(yǎng)陽(yáng)性菌株。

1.2 研究方法

1.2.1 傳統(tǒng)藥物敏感性試驗(yàn) 利用傳統(tǒng)藥物敏感試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌對(duì)利福平、異煙肼兩種一線抗結(jié)核藥物的耐藥性，作為診斷試驗(yàn)的金標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 線性探針技術(shù)提取DNA 取500 μL處理后痰標(biāo)本加入1.5 mL離心管內(nèi)，10 000×g 離心15 min；棄上清，加入500 μL去離子水，渦旋震蕩重懸沉淀物。10 000×g離心15 min；95 ℃水浴中孵育20 min；超聲裂解15 min。12 000×g 離心10 min，取5 μL上清液用于PCR檢測(cè)。

1.2.3 擴(kuò)增 采用德國(guó)Hain LifescienceGmbH 公司生產(chǎn)的GenoType MTBDRplus試劑盒在PCR儀上對(duì)結(jié)核桿菌DNA 模板進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增體系：35 μL PNM，5 μL 10×buffer，0.2 μL DNA聚合酶，2 μL MgCl2溶液，2.8 μL ddH2O，5 μL DNA模板，最終容積達(dá)到50 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃，15 min;(95 ℃，30 s，58 ℃，2 min)，10個(gè)循環(huán)；(95 ℃，25 s，53 ℃，40 s，70 ℃，40 s)，30個(gè)循環(huán)；70 ℃，8 min，4 ℃，1 h。

1.2.4 雜交 將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物和變性裂解液(DEN)各20 μL混勻加入雜交反應(yīng)板，孵育5 min,然后加入雜交緩沖液(HYB)1 mL，混勻，將標(biāo)記好的探針試條加入槽中，在雜交儀上45 ℃孵育30 min后將雜交液徹底吸出，再加入1 mL嚴(yán)格漂洗液(STR)，45 ℃雜交儀孵育15 min。在每個(gè)槽中加入1 mL按1∶100稀釋的標(biāo)志物，雜交儀振動(dòng)平臺(tái)上孵育30 min。再向每個(gè)槽中1∶100稀釋的底物并靜止避光孵育5～10 min。將試條取出置于吸水紙上干燥，然后粘貼在判讀表上。

1.3 結(jié)果判讀 線性雜交技術(shù)結(jié)果試紙條共有27 個(gè)反應(yīng)條帶，分為4個(gè)區(qū)域，第一區(qū)為對(duì)照質(zhì)控帶，其他區(qū)為耐藥相關(guān)基因探針區(qū)，其中第二區(qū)是利福平耐藥相關(guān)rpoB 基因探針區(qū)，第三和第四區(qū)分別為異煙肼耐藥相關(guān)的KatG、inhA 基因探針區(qū)，當(dāng)野生條帶均顯色而突變條帶無(wú)顯色時(shí)為藥物敏感，野生條帶缺失、突變條帶顯色或不顯色均為耐藥。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，檢測(cè)結(jié)果的真實(shí)性采用敏感度和特異度對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 比例法藥敏結(jié)果 利福平耐藥27例，利福平敏感173例，異煙肼耐藥18例，異煙肼敏感182例。

2.2 線性探針技術(shù)結(jié)果 利福平耐藥27例，利福平敏感173例，異煙肼耐藥18例，異煙肼敏感182例。

2.3 兩種方法比較 兩種方法對(duì)利福平檢測(cè)結(jié)果一致的有200例，兩種方法均為耐藥的27例，均為敏感的173例; 兩種方法對(duì)異煙肼檢測(cè)結(jié)果一致的有200例，兩種方法均為耐藥的18例，均為敏感的182例。線性探針GenoType MTBDRplus方法檢測(cè)利福平耐藥的靈敏度為100%，特異度為100%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為1，陰性預(yù)測(cè)值為1 ; 檢測(cè)異煙肼的靈敏度為100%，特異度為100%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為 1 ，陰性預(yù)測(cè)值為1 。線性探針技術(shù)技術(shù)與傳統(tǒng)藥敏實(shí)驗(yàn)檢測(cè)所得利福平耐藥結(jié)核病發(fā)生率、異煙肼耐藥結(jié)核病發(fā)生率和耐多藥結(jié)核病發(fā)生率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4 基因突變頻率分布 對(duì)GenoType MTBDRplus 檢測(cè)耐利福平及耐異煙肼的突變位點(diǎn)進(jìn)行了分析，耐利福平基因突變頻率最高的是S531L(66.7%)，耐異煙肼基因突變頻率最高的為 S315T1(88.9%)。見(jiàn)表1。

表1 線性探針技術(shù)檢測(cè)利福平和異煙肼耐藥基因的突變頻率分布

3 討 論

線性探針雜交技術(shù)檢測(cè)作為分子診斷，其原理是基于對(duì)基因序列的分析而進(jìn)行的結(jié)核分枝桿菌及其耐藥性診斷。實(shí)驗(yàn)方法與傳統(tǒng)的藥物敏感性實(shí)驗(yàn)相比簡(jiǎn)單，且檢測(cè)速度較快，目前已在很多國(guó)家使用。但有研究顯示，耐藥水平的高低會(huì)影響HAIN技術(shù)的檢測(cè)效果[3]。WHO 2014 年版《耐藥結(jié)核病規(guī)劃管理指南伙伴手冊(cè)》對(duì)藥敏試驗(yàn)進(jìn)行了更新，指出藥敏試驗(yàn)包括了表型藥敏試驗(yàn)(即傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)) 和基因型藥敏試驗(yàn); 結(jié)核分枝桿菌對(duì)利福平的耐藥定義為表型或基因型藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)利福平耐藥[4]。說(shuō)明分子檢測(cè)對(duì)耐藥結(jié)核病診斷的重要性，意味著一旦發(fā)現(xiàn)利福平基因型耐藥，就需要考慮其為耐藥結(jié)核的可能性[5]。

本研究中，GenoType MTBDR plus 檢測(cè)利福平耐藥的靈敏度達(dá)100%，與此前國(guó)外的研究結(jié)果一致[6-7]。已有研究顯示利福平耐藥由編碼RNA聚合酶β亞單位的rpoB 基因核心區(qū)的基因突變引起。本研究檢測(cè)利福平耐藥表現(xiàn)出較高的靈敏度和特異度。由于不同地區(qū)結(jié)核分枝桿菌耐利福平的基因突變位點(diǎn)突變頻率均不同，本研究顯示，耐利福平基因突變頻率最高的是rpoB S531L,故提示貴州地區(qū)利福平耐藥主要以rpoB S531L 為主。異煙肼耐藥主要與katG 和inhA 基因有關(guān)，katG 基因突變與高水平耐藥相關(guān)， inhA 耐藥與低水平耐藥相關(guān)。本研究顯示，異煙肼耐藥主要基因突變?yōu)閗atG S315T1，提示貴州地區(qū)88.9%的耐異煙肼病例為高水平耐藥。

[1] World Health Organization. Global tuberculosis control: WHO report 2011[R]. Geneva: World Health Organization, 2011.

[2] 衛(wèi)生部．全國(guó)結(jié)核病耐藥性基線調(diào)查報(bào)告(2007-2008年)[M]．北京：人民衛(wèi)生出版社，2010．

[3] World Health Organization. Compannion handbook to the WHO guidelines for the programmatic management of drug-resistant tubercuosis[R]. Geneva: World Health Organization, 2014．

[4] 段鴻飛. WHO 2014 年版《耐藥結(jié)核病規(guī)劃管理指南伙伴手冊(cè)》解讀之六[J]. 中國(guó)防癆雜志,2015,37(6):658-659．

[5] Causse M, Ruiz P, Gutierrez JB,et al.Evaluation of new Geno-Type MTBDRplus for detection of resistance in cultures and direct specimens of Mycobacterium tuberculosis [J].Int J Tuberc Lung Dis,2008,12(12):1456-1460．

[6] Lacoma A, Garcia-Sierra N, Prat C, et al. GenoType MTBDRplus assay for molecular detection of rifampin and isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis strains and clinical samples [J]. J Clin Microbiol,2008,46(11):3660-3667．

[7] Miotto P, Piana F, Cirillo DM, et al.Genotype MTBDRplus: a further step toward rapid identification of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis [J]. J Clin Microbiol, 2008,46(1):393-394．

貴州省疾病預(yù)防控制中心基金項(xiàng)目(2015-E2-4)

R52

B

1000-744X(2016)11-1214-02

2016-06-08)