李 威,張益蒴,匡洪影△,馮文婷

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040;3.山西省太原市第三人民醫(yī)院，山西 太原 030000)

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電針對(duì)多囊卵巢綜合征模型大鼠糖、脂代謝紊亂的影響*

李 威1,張益蒴2,匡洪影1△,馮文婷3

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040;3.山西省太原市第三人民醫(yī)院，山西 太原 030000)

目的：探討電針治療對(duì)糖、脂代謝紊亂型多囊卵巢綜合征(PCOS)模型大鼠的療效及影響。方法：24日齡SD大鼠隨機(jī)分組為空白對(duì)照組、PCOS模型組、電針治療組，分組后使用雄激素脫氫表雄酮(DHEA)頸背部注射進(jìn)行造模。采用HE染色法、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法、實(shí)時(shí)PCR和WESTENBLOT蛋白印跡進(jìn)行檢測(cè)并觀察結(jié)果。結(jié)果：經(jīng)電針治療后卵巢多囊狀態(tài)得到了改善；電針使血清激素LH/FSH比值下降，全身血清脂代謝HLD-C、TG、CHO均降低，LDL升高；電針治療后PCOS模型大鼠卵巢局部GLUT1、GLUT4mRNA的表達(dá)和蛋白水平明顯升高。結(jié)論：電針能夠調(diào)節(jié)PCOS模型大鼠全身糖、脂代謝和卵巢局部GLUT1、GLUT4的mRNA表達(dá)量和蛋白的含量。

電針;多囊卵巢綜合征;糖、脂代謝

多囊卵巢綜合征(PolycysticOvarySyndrome,PCOS)，是一類異質(zhì)性內(nèi)分泌失調(diào)性疾病，其發(fā)病原因與神經(jīng)內(nèi)分泌、脂質(zhì)代謝、葡萄糖代謝及蛋白質(zhì)代謝等多因素相關(guān)。PCOS的臨床表現(xiàn)主要為月經(jīng)功能紊亂和高雄激素血癥，具體表現(xiàn)包括月經(jīng)失調(diào)、不孕、多毛、痤瘡、肥胖等代謝異常特征。同時(shí)PCOS患者患2型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)和心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)的發(fā)生率顯著提高[1]。胰島素抵抗和糖、脂代謝功能障礙存在于雌性PCOS大鼠。此外，存在于卵巢局部組織的異常胰島素信號(hào)傳導(dǎo)途徑，可能與調(diào)節(jié)胰島素信號(hào)傳導(dǎo)分子的蛋白表達(dá)相關(guān)[2]。近年來，糖、脂代謝紊亂存在于PCOS患者中，針刺作為傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)的一部分，應(yīng)用涉及很多領(lǐng)域[3]。

電針(Electroacupuncture,EA)作為一種替代療法得到了廣泛的認(rèn)可，研究發(fā)現(xiàn)電針刺激是一種有前途、有療效的治療多囊卵巢綜合征(PCOS)的方法，為治療多囊卵巢綜合征提供了重要臨床經(jīng)驗(yàn)，增加了知識(shí)基礎(chǔ)[4]。研究表明針刺治療多囊卵巢綜合征的療效較好[5]。針刺治療PCOS具有一定優(yōu)勢(shì)，與目前處方藥物治療、手術(shù)治療和生活方式相比較，可降低費(fèi)用及多胎妊娠的風(fēng)險(xiǎn)[6]。同時(shí)針刺治療可適度改善PCOS女性抑郁和焦慮評(píng)分，提高相關(guān)健康生活質(zhì)量分?jǐn)?shù)[7]。

針刺治療多囊卵巢綜合征有效，但尚不完全明確，證據(jù)水平也相對(duì)較低,需要更多的高質(zhì)量的證據(jù)。本實(shí)驗(yàn)研究宗旨在于探討電針對(duì)于PCOS模型大鼠GLUT1和GLUT4基因表達(dá)量的差異，從而為電針對(duì)多囊卵巢綜合征中糖、脂代謝異常型改變提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

21只正常SD健康，清潔級(jí)，雌性大鼠(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，體質(zhì)量(50±5)g，21日齡大小，適應(yīng)性喂養(yǎng)2天飼養(yǎng)在黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)婦科藥理實(shí)驗(yàn)室。于24日后隨機(jī)分組。隨機(jī)分為空白對(duì)照組(CON)、PCOS模型組(PCOS)和電針治療組(EA)。

1.2PCOS模型大鼠的構(gòu)建與評(píng)定

構(gòu)建：隨機(jī)分組后PCOS模型組和電針治療組大鼠每日用脫氫表雄酮(DHEA，北京百靈威科技有限公司)60mg/100g體重溶于0.2ml注射藥用級(jí)大豆油(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)中，經(jīng)由大鼠頸背部皮下注射，空白對(duì)照組的大鼠，作為對(duì)照每日注射0.2ml注射藥用級(jí)大豆油，連續(xù)注射21日。

評(píng)定：造模后每日上午8:00～9:00陰道涂片，然后直接在普通顯微鏡下觀看細(xì)胞的形態(tài)，觀察大鼠的動(dòng)情周期變化。參照施新猷主編的《現(xiàn)代醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)》標(biāo)準(zhǔn)：動(dòng)情前期、動(dòng)情期、動(dòng)情后期、動(dòng)情間期。觀察出現(xiàn)連續(xù)的動(dòng)情周期紊亂說明造模成功。

1.3 電針針刺治療

電針治療組大鼠于造模21日后進(jìn)行針刺治療，選取穴位參照大鼠標(biāo)準(zhǔn)穴位圖譜，具體選穴為：子宮、中極、關(guān)元和三陰交穴。1次/天，5天/周，連續(xù)4～5周電針刺激治療。電針針刺治療的第1周15min/次，第2、3周20min/次，第4、5周25min/次。大鼠被固定后，按腧穴定位針刺，針柄連接低頻電針治療儀，連續(xù)波，2Hz電流輸出，以大鼠局部肌肉輕度抖動(dòng)而不產(chǎn)生掙扎為度，一對(duì)導(dǎo)線接同側(cè)兩個(gè)穴位。

空白對(duì)照組與PCOS模型組大鼠只固定不做任何針刺處理。

1.4 標(biāo)本制備

組織標(biāo)本保存：治療結(jié)束禁食12h后，將處于動(dòng)情期的大鼠眼眶迅速取血，靜置1h后3500Rpm分離血清，-70℃冰箱保存?zhèn)溆?；雙側(cè)卵巢經(jīng)稱重后去除表面脂肪組織，一側(cè)卵巢組織固定于10%中性福爾馬林液中，切片后進(jìn)行HE染色，剩余組織置于-70℃冰箱保存。

1.5 檢測(cè)方法

血清學(xué)檢測(cè)：血清激素FSH、LH等的檢測(cè)采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)(試劑盒購自由武漢云克隆科技股份有限公司)。脂代謝指標(biāo)由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科生化組采用酶法測(cè)定。

實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR(quantitativereal-timePCR)法檢測(cè)卵巢組織中GLUT1及GLUT4的表達(dá)水平，實(shí)時(shí)熒光試劑選用美國ThermoScientific的BRGreenqpcrMasterMix(2x)ROXsolution，按照試劑盒說明進(jìn)行操作。引物序列參照NCBI基因庫的基因序列來設(shè)計(jì)引物，該實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為100～250bp，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

WESTENBLOT蛋白印跡(westernblot)：冷凍保存卵巢組織加入蛋白裂解液后充分破碎，而后12000rpm離心10mins后取上清進(jìn)行定量。蛋白樣品加buffer上樣，經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上采用相應(yīng)的一抗及對(duì)應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗進(jìn)行孵育。孵育完成并充分洗脫后，采用放射自顯影的方法檢測(cè)目的條帶化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

全部數(shù)據(jù)使用SPSS19.0軟件系統(tǒng)統(tǒng)計(jì)和數(shù)據(jù)分析，行正態(tài)性分布檢驗(yàn)后，使用單因素ANOVA均值比較，其中方差齊者使用Bonferroni(B)檢驗(yàn)，不符合者采用Dunnett’sT3(3)檢驗(yàn)，以P<0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表示組間具有顯著差異性。

2 結(jié)果

2.1 卵巢切片HE染色

由封三彩圖1可見，空白對(duì)照組為正常發(fā)育的卵巢卵泡和卵泡顆粒細(xì)胞；PCOS模型組為多囊樣改變，包括囊性擴(kuò)大的卵巢濾泡，黃體與顆粒細(xì)胞層數(shù)減少；電針治療組與PCOS模型組相比黃體顆粒細(xì)胞層數(shù)增加。

2.2 血清激素水平檢測(cè)

表1 血清激素FSH與LH及LH/FSH水平

由表1可見，PCOS組與CON組相比較，LH/FSH比值上升，與EA組相比較，LH/FSH比值下降。在血清激素水平上，電針治療組血清激素FSH有所升高，LH有所下降，LH/FSH也有所降低，但未發(fā)現(xiàn)組間統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.3 糖脂代謝指標(biāo)

表2 全身血清脂代謝水平的變化

注：與CON比較，*P<0.05；與PCOS比較，#P<0.05

由表2可見，PCOS模型組較空白對(duì)照組，高低密度脂蛋白、甘油三酯、膽固醇方面均升高(P<0.05)，針刺治療后高低密度脂蛋白、甘油三酯、膽固醇方面均下降(P<0.05)。

2.4 實(shí)時(shí)PCR卵巢局部mRNA表達(dá)量的差異

由表3可見，PCOS模型組大鼠卵巢局部GLUT1、GLUT4的mRNA表達(dá)量升高(P<0.05)，電針治療組大鼠卵巢局部GLUT1、GLUT4的mRNA表達(dá)量明顯下降(P<0.05)。

表3 卵巢中GLUT1和GLUT4的mRNA表達(dá)差異

注：與CON比較，*P<0.05；與PCOS比較，#P<0.05

2.5Western-blot中卵巢局部GLUT1與GLUT4的蛋白表達(dá)水平

圖2 卵巢局部GLUT1、GLUT4的蛋白表達(dá)水平

由圖2可見，PCOS模型組大鼠卵巢局部GLUT1、GLUT4蛋白水平下降，電針治療組大鼠經(jīng)過針刺治療后卵巢局部GLUT1、GLUT4蛋白水平明顯升高。但組間比較P>0.05,組間沒有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 討論

代謝綜合征(Metabolicsyndrome，MS) 是一組復(fù)雜的代謝紊亂癥候群，主要是指體內(nèi)糖類、脂肪、蛋白質(zhì)這三大營養(yǎng)物質(zhì)或其他多種物質(zhì)發(fā)生異常代謝的病理狀態(tài)。其中PCOS患者最為常見,表現(xiàn)多為糖、脂代謝紊亂[8]。PCOS患者中糖代謝紊亂表現(xiàn)為胰島素抵抗和卵巢局部糖代謝異常；脂代謝紊亂常表現(xiàn)為全血脂代謝異常(TC、TG、LDL-C的水平升高，而HDL-C的水平降低)。

自針刺開始應(yīng)用于PCOS的治療，療效顯著，臨床上針刺治療PCOS收到了很好的療效[9]。研究證明針刺在改善PCOS患者的內(nèi)分泌和代謝紊亂、促排卵和胰島素抵抗等方面都具有良好作用[10]。針刺是通過激活感覺傳入神經(jīng)，進(jìn)而調(diào)節(jié)卵巢局部和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的交感神經(jīng)活動(dòng)[11]。針刺治療PCOS的理論機(jī)制是通過其自主神經(jīng)系統(tǒng)起作用，針刺使卵巢局部交感標(biāo)記物的表達(dá)和卵巢交感神經(jīng)反射應(yīng)答[12]。本實(shí)驗(yàn)探討了針刺對(duì)PCOS治療機(jī)制的進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)選用電針針刺，從根本上調(diào)節(jié)糖、脂代謝紊亂型多囊卵巢綜合征。研究結(jié)果顯示，電針針刺治療后PCOS模型大鼠卵巢的排卵情況得到了恢復(fù)，卵巢多囊改變減少，包括卵巢卵泡，卵泡顆粒細(xì)胞較黃體顆粒細(xì)胞層數(shù)增加；在血清激素水平上，針刺治療后血清激素FSH有所升高，LH有所下降，LH/FSH也有明顯變動(dòng)；全血脂代謝水平上，電針針刺治療后PCOS模型大鼠的高密度脂蛋白、甘油三酯、膽固醇方面均有所升高；卵巢局部基因表達(dá)和蛋白含量水平上，電針針刺治療后PCOS模型大鼠卵巢局部GLUT1、GLUT4的mRNA表達(dá)量和蛋白水平明顯升高。

葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GLUTs)是介導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的主要載體，其中GLUT1(glucosetransporter1)是目前已知體內(nèi)分布最為廣泛的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體，GLUT1作為機(jī)體分布最廣泛的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體，不僅與機(jī)體糖代謝疾病有關(guān)，同時(shí)與卵巢分泌的性激素有關(guān)，尤其是雌激素[13]。GLUT4 (glucosetransporter4)是循環(huán)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移的主要轉(zhuǎn)運(yùn)體，是維持機(jī)體葡萄糖穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵因素；主要負(fù)責(zé)各類細(xì)胞的基礎(chǔ)糖代謝需求。GLUT4能在胰島素的刺激下，通過易位作用將葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜上，促進(jìn)葡萄糖的攝取和代謝，GLUT4與胰島素抵抗(insulinresistance,IR)密切相關(guān)[14]；同時(shí)女性卵巢局部分泌的雌激素也可以調(diào)節(jié)GLUT4的水平。近幾年的研究中發(fā)現(xiàn)，在倉鼠卵巢細(xì)胞系中特異性激活ERβ可增加GLUT4表達(dá)，雌激素刺激對(duì)于GLUT4的相關(guān)表達(dá)影響存在矛盾性[15],說明GLUT4在mRNA的表達(dá)量和蛋白質(zhì)水平均可檢測(cè)。

糖、脂代謝紊亂可能對(duì)PCOS疾病的發(fā)生具有重要推動(dòng)作用。電針針刺可以明顯的增加胰島素分泌，達(dá)到降糖作用。這些研究均表明[16-18]，電刺針刺刺激穴位可增加胰島素分泌，降低糖代謝水平；同樣，ShapiraMY等[19]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，改善胰島素抵抗降低糖尿病動(dòng)物模型血糖可通過重復(fù)電針穴位時(shí)間達(dá)到。雖然PCOS病因尚未完全闡明，越來越多的研究表明胰島素抵抗IR是其發(fā)病的中心環(huán)節(jié)，糖脂代謝紊亂均可引起IR，胰島素抵抗可能是PCOS發(fā)生的主要病理基礎(chǔ),但也有研究持不同的觀點(diǎn)。胰島素抵抗主要是因機(jī)體糖代謝紊亂和脂代謝紊亂造成的。

綜上所述，電針針刺治療對(duì)糖脂代謝紊亂型多囊卵巢綜合征改善了卵巢多囊的形態(tài)、全血脂代謝、卵巢局部GLUT1、GLUT4mRNA的表達(dá)和蛋白的含量，由此可見，電針刺激可調(diào)節(jié)PCOS大鼠糖脂代謝紊亂，對(duì)于電針治療多囊卵巢綜合征胰島素抵抗相關(guān)指標(biāo)和作用機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。

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國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目,編號(hào)：81503610；黑龍江博士后基金項(xiàng)目，編號(hào)：061081;哈爾濱市科技創(chuàng)新人才研究專項(xiàng)資金項(xiàng)目,編號(hào)：RC2015QN003092。

李威(1979-)，男，副研究員，研究方向：生殖內(nèi)分泌代謝。

△通訊作者：匡洪影(1981-)，女，博士后，副主任醫(yī)師，研究方向：中醫(yī)婦科臨床及科研。

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2016-07-17