肖家翔 文婷 姚瑩

?

·實驗研究·

雙芍護睛散對實驗性外傷性視神經(jīng)損傷保護作用的超微結構觀察

肖家翔 文婷 姚瑩

目的 觀察雙芍護睛散對實驗性外傷性視神經(jīng)損傷保護作用的超微結構變化。方法 將實驗SD大鼠60只隨機抽取15只為空白對照組,其余45只造模后隨機分為模型對照組、生理鹽水組及中藥治療組,每組15只?？瞻讓φ战M及模型對照組造模24小時后,生理鹽水組及中藥治療組(雙芍護睛散)用藥4周后取左眼觀察視神經(jīng)的超微結構變化。結果 模型對照組視神經(jīng)纖維排列紊亂,部分軸突腫脹,呈空泡樣變性,髓鞘部分出現(xiàn)板層分離;生理鹽水組視神經(jīng)纖維排列紊亂,軸突變性而且數(shù)量減少,可見軸突脫髓鞘;而中藥治療組視神經(jīng)纖維排列較規(guī)則,軸突數(shù)量輕度減少,可見髓鞘包裹軸突。結論 以養(yǎng)血行血法組方的雙芍護睛散能抗視神經(jīng)的損傷,促進視神經(jīng)纖維的修復而保護視神經(jīng)。

雙芍護睛散; 視神經(jīng)/外傷; 疾病模型; 動物

視神經(jīng)萎縮(optic atrophy,OA)是視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞及其軸索、視神經(jīng)纖維由于各種原因所導致的功能障礙,是多種疾病的病理結果,為眼科常見的致盲眼病之一[1,2]。本病病因以外傷性、炎癥性居多[3]。外傷性視神經(jīng)損傷導致視神經(jīng)萎縮的研究既往主要集中在解除視神經(jīng)受壓方面,而“神經(jīng)保護”未得到足夠的重視。臨床上相當多的患者在視神經(jīng)解壓后已存在視功能的損害,表明在視神經(jīng)受壓時需及時對視神經(jīng)進行保護性治療,故本研究采用臨床治療視神經(jīng)萎縮行之有效,以養(yǎng)血行血為法組方制成的雙芍護睛散用于實驗性外傷性視神經(jīng)損傷,通過視神經(jīng)的超微結構觀察,以證實養(yǎng)血行血方有抗視神經(jīng)損傷的作用,為開發(fā)有效治療視神經(jīng)萎縮中藥制劑提供理論依據(jù)及實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

選用健康3月齡SD大鼠60只,雌雄不限,體重200～250g,由貴州醫(yī)科大學動物實驗中心提供(合格證號:SCXK(黔)2013-017)。購進大鼠經(jīng)手持裂隙燈檢查雙眼角膜透明,虹膜血管清晰,瞳孔對光反射靈敏,晶狀體無混濁者納入實驗。將60只大鼠抽取15只為空白對照組,其余45只采用右眼視神經(jīng)鉗夾法建立視神經(jīng)擠壓傷模型,造模后隨機分為模型對照組、生理鹽水組及中藥治療組,每組15只。

1.1.2 藥物

以養(yǎng)血行血法組方(白芍、赤芍、茺蔚子、桑葚、澤蘭、牛膝、雞血藤、川芎等),按現(xiàn)代中藥制劑工藝制成雙芍護睛散,由貴陽中醫(yī)學院中藥制劑室制備。

1.1.3 儀器

瑞典產(chǎn)LKBⅢ型超薄切片機;日本產(chǎn)JEM-1200EX透射電鏡。

1.2 方法

1.2.1 造模

參照李云琴[4]方法進行造模:將需造模的45只大鼠于造模前3天用0.25%氯霉素眼藥水滴眼,每日3次。造模時以3.5%水合氯醛作右下腹腔注射麻醉,并以1%鹽酸丙美卡因對大鼠左眼進行表面麻醉。麻醉后,將大鼠固定于動物手術臺上,沿左眼顳側角膜緣將球結膜環(huán)形剪開,分離球結膜和鞏膜,分離時避開外直肌,然后繼續(xù)向后分離,打開肌錐后將視神經(jīng)暴露出來,用鉗夾力相等的視神經(jīng)鉗夾器夾于球后視神經(jīng)2mm處,30秒后松開鉗夾器,用8-0尼龍線縫合球結膜,造模完后以慶大霉素做球結膜下注射,以0.3%妥布霉素眼膏涂于結膜囊內,然后將大鼠保溫至蘇醒。觀察造模眼的瞳孔情況,以瞳孔直接對光反射消失,間接對光反射存在者作為造模成功的實驗動物納入實驗。

1.2.2 給藥方法

中藥治療組及生理鹽水組造模成功24小時后開始每日給藥,劑量參照徐叔云主編的《藥理實驗方法學》[5]中關于人和動物間按體表面積折算的等效劑量比值表擬定,治療組以雙芍護睛散混懸液(每100ml含散劑30g)灌胃,劑量為5ml/Kg.d,每天2次;生理鹽水組以等劑量生理鹽水灌胃,每天2次。2周為一個療程,停藥2天后繼續(xù)第二個療程,共2個療程。

1.2.3 標本制作及觀察

空白對照組及模型對照組在造模成功24小時后;中藥治療組以及生理鹽水組給藥2個療程后采用完全隨機法隨機抽取各組中的10只大鼠以10%水合氯醛過量腹腔注射處死,摘取左眼眼球,在冰上沿角膜緣剪開眼球后,去除晶體、玻璃體,保留球后視神經(jīng)2mm,取過視盤約2cm×2cm的全層眼球壁。立即放于2.5%的戊二醛溶液中固定1h,磷酸鹽緩沖液沖洗2h,用1%鋨酸固定2 h,系列乙醇脫水,Epon環(huán)氧樹脂812包埋,聚合350C、400C、550C各12 h,半薄切片(1μm)光學定位,以超薄切片機切片(70 nm),醋酸雙氧鈾枸櫞酸鉛染色,透射電鏡主要觀察視神經(jīng)組織的超微結構。

2 結果

如圖1所示,大鼠視神經(jīng)的超微結構表現(xiàn)為:正常對照組視神經(jīng)排列整齊,粗細均勻,軸突外有髓鞘包繞,髓鞘密度均勻,板層無分隔無斷裂,軸漿分布均勻,膠質細胞胞漿內有大量線粒體及粗面內質網(wǎng)(圖1A)。模型對照組視神經(jīng)纖維排列紊亂,部分軸突腫脹,呈空泡樣變性,軸突與髓鞘之間出現(xiàn)縫隙,髓鞘部分出現(xiàn)板層分離,結構紊亂,軸突內微絲顯著減少,膠質細胞內線粒體重度腫脹,呈圓形或球形(圖1B)。生理鹽水組視神經(jīng)纖維排列紊亂,軸突變性,數(shù)量減少,軸突內微絲明顯減少,可見軸突脫髓鞘(圖1C)。中藥治療組視神經(jīng)纖維排列較規(guī)則,軸突數(shù)量輕度減少,可見部分正常的軸突,軸突內微絲輕度減少,可見髓鞘包裹軸突,形成新的神經(jīng)纖維(圖1D)。

3 討論

視神經(jīng)萎縮是由于各種病因造成視神經(jīng)纖維變性喪失傳導功能的最終結局。視神經(jīng)由視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞所發(fā)出的軸突纖維匯集而成。當視神經(jīng)受損時,神經(jīng)纖維會出現(xiàn)部分變細或者全部變細的形態(tài)學改變。外傷性視神經(jīng)損傷引起視功能損害主要為視神經(jīng)血流灌注不良而缺血,導致視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡,軸突數(shù)量減少,視神經(jīng)軸索運輸中斷,導致神經(jīng)纖維受損,甚至萎縮。

視神經(jīng)萎縮一度被認為是不可逆視神經(jīng)損害結果,近年的研究改變了這種看法,有研究顯示適當而積極的治療對視神經(jīng)萎縮的視功能可以得到一定的改善,并提出了殘余視覺激活理論[6]。對視神經(jīng)萎縮的治療中西醫(yī)均進行了較為廣泛的探索。相關實驗證明[7],受損的軸突在一定條件下,可得到一定程度的修復,從而促進神經(jīng)纖維的再生?？紫槊返萚8]通過實驗觀察甲鈷胺治療視神經(jīng)鉗夾傷后大鼠,光鏡和電鏡下可見視神經(jīng)軸突和神經(jīng)節(jié)細胞異性改變明顯減少,能有效減少視神經(jīng)的退變及喪失。徐朝偉等[9]以明目復元湯聯(lián)合中藥穴位貼敷治療急性視神經(jīng)萎縮,其顯效及總有效率高于口服肌苷片、腺苷鈷胺片及維生素B12者。

圖1 為視神經(jīng)透射電鏡照片(醋酸雙氧鈾枸櫞酸鉛染色×20000)。圖1A為空白對照組,視神經(jīng)排列整齊,軸突外有髓鞘包繞,軸漿分布均勻;圖1B為模型對照組,視神經(jīng)纖維排列紊亂,部分軸突腫脹,呈空泡樣變性,髓鞘部分出現(xiàn)板層分離;圖1C為生理鹽水組,視神經(jīng)纖維排列紊亂,軸突變性,可見軸突脫髓鞘;圖1D為中藥治療組,視神經(jīng)纖維排列較規(guī)則,軸突數(shù)量輕度減少,可見髓鞘包裹軸突

目前治療視神經(jīng)萎縮尚無確切有效療法,本研究以中醫(yī)理論為基,結合外傷性視神經(jīng)損傷主要為視神經(jīng)血流灌注不良而缺血,導致視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞及軸突損害引發(fā)視神經(jīng)萎縮的發(fā)病機制,提出目絡瘀阻,目系失養(yǎng)的立法依據(jù)。針對外傷性視神經(jīng)損傷有血 “虧滯”的關鍵環(huán)節(jié),其治血一要養(yǎng),二要行。故本研究選用臨床有效治療視神經(jīng)萎縮,以養(yǎng)血行血為法組成的雙芍護睛方制成散劑,用于實驗性外傷性視神經(jīng)損傷模型,通過視神經(jīng)超微結構的觀察以證實養(yǎng)血行血方對外傷性視神經(jīng)損傷具有保護作用。研究結果顯示,大鼠模型后視神經(jīng)纖維排列紊亂,部分軸突腫脹,呈空泡樣變性,髓鞘部分出現(xiàn)板層分離;應用生理鹽水者視神經(jīng)纖維排列紊亂,軸突變性而且數(shù)量減少,可見軸突脫髓鞘;而中藥治療組,視神經(jīng)纖維排列較規(guī)則,軸突數(shù)量輕度減少,可見髓鞘包裹軸突。提示養(yǎng)血行血法組方的雙芍護睛散能抗視神經(jīng)的損傷,促進視神經(jīng)纖維的修復而保護視神經(jīng)。

[1] 張曉君.進一步提高視神經(jīng)萎縮的診斷水平[J].眼科,2011,20(6):364-366.

[2] Dahlmann-Noor A H,Vijay S,Limb G A,et al.Strategies for optic nerve rescue and regeneration in glaucoma and other optic neuropathies[J].Drug Discovery Today,2010,15(7):287-299.

[3] 滕克禹,呂麗萍.視神經(jīng)萎縮病因分析[J].中國中醫(yī)眼科雜志,2013,23(6):428-430.

[4] 李云琴.大鼠外傷性視神經(jīng)損傷模型的建立[J].眼科新進展,2011,31(10):934-936.

[5] 徐叔云.藥理實驗方法學.1版[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2010:302-303.

[6] 魏世輝,張秀蘭.正確認識視神經(jīng)萎縮的治療價值[J].中華眼科雜志,2012,48(12):1057-1058.

[7] 張世杰,王傳富,孫為榮,等.視神經(jīng)挫傷軸漿運輸和超微結構變化的實驗研究[J].眼科研究,2003,21(6):585-587.

[8] 孔祥梅,孫興懷.甲鈷胺對鉗夾大鼠視神經(jīng)的保護作用[J].眼視光學雜志,2004,9(6):157-164.

[9] 徐朝偉,潘小玲.明目復元湯聯(lián)合中藥穴位貼敷治療急性視神經(jīng)萎縮的臨床觀察[J].中國中醫(yī)急癥,2016,25(2):309-311.

To observe the effection of Shuang Shao Hu Jing powders on ultrastructural changes of optic nerves experimental and traumatic injury

XIAOJia-xiang,WENTing,YAOYing

(GuizhouProvinceHospitalofTraditionalChineseMedicine,Guiyang,Guizhou,550001)

Objective To observe the effect of Shuang Shao Hu Jing powders on the ultrastructural changes of optic nerves in experimental traumatic models.Methods 15 SD rats were randomly drawn to the blank control group,and the other 45 were randomly divided into the model group,saline group and treatment group.we observe the optic nerves ultrastructural changes of the left eye,blank control group and model control group made after 24 hours,saline group and treatment group(treated by The Shuang Shao Hu Jing powde)for 4 weeks.Results The arrangement of optic nerve fibers of model control group were disorder,part of axons were swelling,and showed vacuolar degeneration,the part of myelin even appeared lamellar separation;The saline group,the arrangement of optic nerve fibers were also disorder,the axons were degenerate and the totall number of axon were reduced,axonal demyelination were also visible;The treatment group,the arrangedment of optic fibers were more regular,the number of axons reduced slightly,and the myelin wrapping axons could be observed.Conclusion The Shuang Shao Hu Jing powder conducted by blood nourishing and circulating method is effective to resist the damage the optic nerve,it can protect of the optic nerve by promoting the restoration of optic nerve fibers.

The Shuang Shao Hu Jing powder; Optic nerve/ traumatic injury; Disease models; Animal

貴州省社發(fā)攻關項目(黔科合SY字[2012]3087號)

550001,貴州貴陽,貴陽中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院

肖家翔,Email:kate-show@163.com

10.3969/j.issn.1674-9006.2016.03.004

R774