賴(lài)曉健，熊 靜，張 哲，李忠琴

( 1. 集美大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，福建 廈門(mén) 361021； 2. 鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心，福建 廈門(mén) 361021； 3. 福建省水產(chǎn)研究所，福建 廈門(mén) 361000 )

多子小瓜蟲(chóng)滋養(yǎng)體糖蛋白殘基的種類(lèi)和分布研究

賴(lài)曉健1,2，熊 靜1,2，張 哲3，李忠琴1,2

( 1. 集美大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，福建 廈門(mén) 361021； 2. 鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心，福建 廈門(mén) 361021； 3. 福建省水產(chǎn)研究所，福建 廈門(mén) 361000 )

應(yīng)用伴刀豆凝集素A、麥胚凝集素、大豆凝集素和荊豆凝集素Ⅰ，檢測(cè)寄生于金魚(yú)皮膚、鰓和鰭上的多子小瓜蟲(chóng)滋養(yǎng)體糖蛋白殘基的種類(lèi)和分布。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，伴刀豆凝集素A和麥胚凝集素免疫陽(yáng)性染色在金魚(yú)皮膚、鰓和鰭寄生的滋養(yǎng)體上均有分布，麥胚凝集素免疫陽(yáng)性染色強(qiáng)于伴刀豆凝集素A，未見(jiàn)有大豆凝集素和荊豆凝集素Ⅰ免疫陽(yáng)性染色。鰓上寄生的滋養(yǎng)體伴刀豆凝集素A免疫陽(yáng)性染色最強(qiáng)，皮膚次之，鰭最弱。鰭上寄生的滋養(yǎng)體麥胚凝集素免疫陽(yáng)性染色最強(qiáng)，皮膚次之，鰓最弱。研究結(jié)果表明，滋養(yǎng)體有單糖D-甘露糖和D-葡萄糖，以及氨基衍生物乙酰氨基葡萄糖。寄生于鰓上的滋養(yǎng)體D-甘露糖和D-葡萄糖可能較多，寄生在鰭上的滋養(yǎng)體乙酰氨基葡萄糖可能較多。

植物凝集素；多子小瓜蟲(chóng)；糖基；金魚(yú)

多子小瓜蟲(chóng)(Ichthyophthiriusmultifiliis)隸屬原生動(dòng)物門(mén)、寡膜纖毛綱、膜口目、凹口科、小瓜蟲(chóng)屬。多子小瓜蟲(chóng)的生活史分為滋養(yǎng)體、包囊體和掠食體3個(gè)階段。多子小瓜蟲(chóng)能夠破壞宿主魚(yú)呼吸、排泄和滲透機(jī)能，導(dǎo)致魚(yú)體死亡[1-2]，從而減少魚(yú)的種群數(shù)量。多子小瓜蟲(chóng)是一種世界性分布的淡水魚(yú)類(lèi)專(zhuān)性寄生蟲(chóng)，對(duì)宿主沒(méi)有嚴(yán)格的選擇性，大多數(shù)淡水魚(yú)類(lèi)都受其危害，該病流行面廣，患病魚(yú)死亡率很高，隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖集約化程度的不斷提高、養(yǎng)殖密度的不斷加大，該問(wèn)題日益突出，已造成極大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。

已有的研究表明，魚(yú)類(lèi)寄生蟲(chóng)的外膜含有糖蛋白殘基，包括多子小瓜蟲(chóng)[4]。這些糖類(lèi)和寄生蟲(chóng)的宿主識(shí)別和貼附宿主細(xì)胞有關(guān)，也能夠調(diào)控入侵寄生蟲(chóng)的行為[5]。植物凝集素由于其特異性識(shí)別和結(jié)合糖基的基本功能，可應(yīng)用于抗植物病毒、動(dòng)物病毒、真菌和昆蟲(chóng)等[6]。外源植物凝集素能特異性識(shí)別魚(yú)類(lèi)寄生蟲(chóng)膜上的糖基，且由于糖結(jié)合域的保守性，植物凝集素一般只能結(jié)合一種單糖或寡聚糖[7]。有學(xué)者應(yīng)用外源植物凝集素封閉寄生蟲(chóng)表面的糖基后，發(fā)現(xiàn)寄生蟲(chóng)對(duì)魚(yú)類(lèi)宿主細(xì)胞的黏附作用和入侵受到抑制[8-9]。本研究選用的伴刀豆凝集素A、麥胚凝集素、大豆凝集素和荊豆凝集素Ⅰ能夠與大多數(shù)已發(fā)現(xiàn)的寄生蟲(chóng)糖基結(jié)合，應(yīng)用這4種植物凝集素可以查明多子小瓜蟲(chóng)滋養(yǎng)體糖蛋白殘基的種類(lèi)和分布[10]。多子小瓜蟲(chóng)對(duì)宿主的識(shí)別、貼附和入侵以及宿主病理學(xué)過(guò)程中糖基和凝集素相互作用的研究可以對(duì)多子小瓜蟲(chóng)病害的防治提供新思路，還可為病原寄生蟲(chóng)抗原合成的特異阻斷劑的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

感染多子小瓜蟲(chóng)的金魚(yú)(Carassiusauratus)購(gòu)自水族店。將病魚(yú)投入含30 mg/L 間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽的麻醉液中。取受感染的金魚(yú)組織皮膚、鰓和鰭，用新配的4%多聚甲醛固定8～12 h，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。連續(xù)切片6 μm，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑藥品

間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，生物素化植物凝集素購(gòu)自美國(guó)Sigma和Vector公司。特異結(jié)合糖類(lèi)和工作濃度等見(jiàn)表1。糖類(lèi)購(gòu)自Acros和阿拉丁公司，鏈霉菌抗生物素蛋白—過(guò)氧化物酶和DAB試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。其他化學(xué)試劑為國(guó)藥化學(xué)分析純。

表1 試驗(yàn)使用的植物凝集素、來(lái)源物種、使用量、特異性結(jié)合糖類(lèi)、封閉糖類(lèi)及濃度

1.3 免疫組織化學(xué)試驗(yàn)

切片脫蠟復(fù)水后, 按常規(guī)方法進(jìn)行免疫組織化學(xué)反應(yīng)。滴加新鮮配制的1%H2O2，室溫孵育20 min。蒸餾水浸洗，TTBS緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，pH 7.2，含0.05%Tween20)浸泡5 min。一抗采用生物素化凝集素20 ℃孵育1 h。使用生物素化凝集素前，先將生物素化凝集素和與之特異性結(jié)合的糖類(lèi)在20 ℃中孵育1 h，以去除非特異性結(jié)合的干擾。TTBS浸洗3次×5 min后滴加鏈霉菌抗生物素蛋白—過(guò)氧化物酶，20 ℃孵育30 min。TTBS浸洗3次×5 min。二氨基聯(lián)苯胺顯色3～8 min，蒸餾水沖洗,蘇木精輕度復(fù)染、脫水、透明、封片。陰性對(duì)照片采用相鄰組織切片，用磷酸鹽緩沖液代替凝集素進(jìn)行孵育，進(jìn)行上述免疫組織化學(xué)反應(yīng)程序。

2 結(jié) 果

2.1 多子小瓜蟲(chóng)的感染部位

多子小瓜蟲(chóng)感染的金魚(yú)體表，皮膚和鰭均可見(jiàn)“白點(diǎn)”。揭開(kāi)病魚(yú)鰓蓋，也見(jiàn)鰓絲上有“白點(diǎn)”。寄生于金魚(yú)的多子小瓜蟲(chóng)滋養(yǎng)體直徑超過(guò)600 μm，明顯可見(jiàn)馬蹄形大核。取受感染金魚(yú)皮膚、鰓和鰭組織，進(jìn)行切片觀察，多子小瓜蟲(chóng)滋養(yǎng)體大核明顯，食物泡中有大量的魚(yú)體細(xì)胞。滋養(yǎng)體已侵入表皮層(圖1c)，表皮破裂、脫落，有的已進(jìn)入真皮層，接近肌肉層(圖1a)，在鰓組織中多子小瓜蟲(chóng)侵入鰓小片之間，破壞鰓絲上皮和鰓小片上皮，兩個(gè)鰓小片之間的上皮細(xì)胞幾乎完全脫落，部分鰓小片殘缺不全，斷裂、脫落，鰓絲和鰓小片結(jié)構(gòu)模糊(圖1b)。

圖1 感染多子小瓜蟲(chóng)的金魚(yú)組織蘇木精·伊紅染色圖a，皮膚；b，鰓；c，鰭；m，肌肉；gl，鰓小片；e，表皮.箭形所示為多子小瓜蟲(chóng). 標(biāo)尺：50 μm.

2.2 植物凝集素免疫陽(yáng)性染色在多子小瓜蟲(chóng)滋養(yǎng)體的分布

免疫組織化學(xué)試驗(yàn)結(jié)果表明，陰性對(duì)照均未見(jiàn)免疫陽(yáng)性染色(圖2,a1～c1)。滋養(yǎng)體上有伴刀豆凝集素A和麥胚凝集素免疫陽(yáng)性染色分布，伴刀豆凝集素A免疫陽(yáng)性染色主要集中在滋養(yǎng)體的表面和細(xì)胞核周?chē)?圖2,a2～c2)，麥胚凝集素免疫陽(yáng)性染色在滋養(yǎng)體的表面、細(xì)胞核周?chē)图?xì)胞質(zhì)內(nèi)均有分布(圖2,a3～c3)，麥胚凝集素免疫陽(yáng)性染色強(qiáng)于伴刀豆凝集素A。滋養(yǎng)體上均未見(jiàn)大豆凝集素和荊豆凝集素Ⅰ免疫陽(yáng)性染色(圖2, a4～c5)。

在伴刀豆凝集素A免疫組織化學(xué)染色中，鰓上寄生的多子小瓜蟲(chóng)滋養(yǎng)體免疫陽(yáng)性染色最強(qiáng)，皮膚次之，鰭最弱；而在麥胚凝集素免疫組織化學(xué)染色中，鰭上寄生的多子小瓜蟲(chóng)滋養(yǎng)體免疫陽(yáng)性染色最強(qiáng)，皮膚次之，鰓最弱。

圖2 伴刀豆凝集素A，麥胚凝集素，大豆凝集素和荊豆凝集素I免疫染色圖縱向：1，陰性對(duì)照；2，伴刀豆凝集素A免疫染色；3，麥胚凝集素免疫染色；4，大豆凝集素免疫染色；5，荊豆凝集素Ⅰ免疫染色.橫向：a，皮膚；b，鰓；c，鰭.箭形所示為免疫陽(yáng)性染色位點(diǎn). 標(biāo)尺:20 μm.

3 討 論

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，伴刀豆凝集素A和麥胚凝集素能夠與寄生在魚(yú)體的多子小瓜蟲(chóng)滋養(yǎng)體表面結(jié)合。結(jié)果表明，滋養(yǎng)體表面有單糖D-甘露糖和D-葡萄糖，氨基衍生物乙酰氨基葡萄糖。Xu等[4]對(duì)多子小瓜蟲(chóng)掠食體與植物凝集素的結(jié)合試驗(yàn)表明，質(zhì)量濃度為50 μg/mL的小扁豆凝集素、大豆凝集素、荊豆凝集素Ⅰ和麥胚凝集素能夠與50%以上的掠食體結(jié)合。此結(jié)果提示掠食體表面有，單糖D-半乳糖、L-巖藻糖、D-甘露糖和D-葡萄糖；氨基衍生物乙酰氨基半乳糖和乙酰氨基葡萄糖。本研究發(fā)現(xiàn)的多子小瓜蟲(chóng)滋養(yǎng)體與Xu等[4]發(fā)現(xiàn)的掠食體表面糖基種類(lèi)有差異，其表面不同的糖基組成可能對(duì)滋養(yǎng)體和掠食體完成不同的生理功能起著不同的作用。伴刀豆凝集素A和麥胚凝集素分布不同，表明不同部位滋養(yǎng)體表面糖基可能存在差異。寄生于鰓上的滋養(yǎng)體表面D-甘露糖、D-葡萄糖較多，而寄生于鰭上的滋養(yǎng)體表面乙酰氨基葡萄糖可能較多。不同糖基對(duì)多子小瓜蟲(chóng)的寄生可能起不同的作用。

已有的研究表明，很多魚(yú)類(lèi)寄生蟲(chóng)的外膜含有糖基，如多子小瓜蟲(chóng)掠食體[4]，隱鞭蟲(chóng)屬(Cryptobia)[11]，侵襲內(nèi)阿米巴(Entamoebainvadens)[12]，香魚(yú)微孢子蟲(chóng)(Glugeaplecoglossi)[9]，利什曼原蟲(chóng)屬(Leishmania)[13]和球孢蟲(chóng)屬(Sphaerospora)[14]種類(lèi)。本研究發(fā)現(xiàn)的多子小瓜蟲(chóng)滋養(yǎng)體膜上有與外源植物凝集素特異性結(jié)合的糖基分布的現(xiàn)象，亦在兩種魚(yú)類(lèi)腸道寄生蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)。伴刀豆凝集素A能夠識(shí)別黏孢子蟲(chóng)(Enteromyxumscophthalmi)膜上的葡萄糖—甘露糖；大豆凝集素，西非單豆葉凝集素Ⅰ，麥胚凝集素以及荊豆凝集素能夠識(shí)別N-乙酰氨基葡萄糖，N-乙酰氨基半乳糖和α-D-半乳糖[15]。而伴刀豆凝集素A和荊豆凝集素Ⅰ能夠分別識(shí)別金頭鯛(Sparusaurata)上李氏腸黏蟲(chóng)(E.leei)膜上的葡萄糖—甘露糖和海藻糖[7]。

本研究還發(fā)現(xiàn)，除在滋養(yǎng)體表面，滋養(yǎng)體的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核周?chē)灿忻庖哧?yáng)性染色，表明有糖基的分布。在寄生的黏孢子蟲(chóng)和李氏腸黏蟲(chóng)蟲(chóng)體內(nèi)的孢子中也發(fā)現(xiàn)有植物凝集素的免疫陽(yáng)性染色[7,15]。據(jù)此推測(cè)，可能由于寄生在魚(yú)體的滋養(yǎng)體體內(nèi)已經(jīng)合成相關(guān)的糖蛋白，為后面的包囊體生活史階段做好準(zhǔn)備。

體外試驗(yàn)已表明，多子小瓜蟲(chóng)掠食體對(duì)宿主血清和黏液的成分具有選擇性，其中掠食體很可能首先通過(guò)打開(kāi)宿主的黏液細(xì)胞而進(jìn)入黏液細(xì)胞豐富的皮層[16]，而血清能夠吸引掠食體對(duì)宿主的穿透行為[17]。寄生蟲(chóng)外膜糖蛋白的糖基很可能參與了寄生蟲(chóng)的宿主識(shí)別和貼附作用[5]，所以這些寄生蟲(chóng)的糖基對(duì)于宿主魚(yú)類(lèi)來(lái)說(shuō)是重要的抗原[18]，用外源植物凝集素封閉寄生蟲(chóng)表面的糖基后，發(fā)現(xiàn)一些寄生蟲(chóng)對(duì)魚(yú)類(lèi)宿主細(xì)胞的黏附作用和入侵受到抑制[8-9,19]，大豆凝集素等植物凝集素能夠抑制多子小瓜蟲(chóng)掠食體的運(yùn)動(dòng)和掠食體向滋養(yǎng)體的發(fā)育[4]。所以利用寄生蟲(chóng)的糖基與凝集素特異性結(jié)合的特點(diǎn)研制出特異性封閉寄生蟲(chóng)糖基或抑制其合成的藥物有很大的應(yīng)用前景[20]。這個(gè)想法在人類(lèi)醫(yī)學(xué)上已有成功實(shí)現(xiàn)的例子。Mahalingam等[21]人工合成了一種外源性凝集素，這種凝集素能夠與人類(lèi)免疫缺陷病毒包膜上的糖結(jié)合，阻止人類(lèi)免疫缺陷病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞，從而阻止該病毒的感染。本研究應(yīng)用外源性的植物凝集素發(fā)現(xiàn)了滋養(yǎng)體糖蛋白殘基，可為人工合成能夠與滋養(yǎng)體糖基特異性結(jié)合的外源性凝集素的研發(fā)提供理論依據(jù)。

[1] Ewing M S, Black M C, Blazer V S,et al. Plasma chloride and gill epithelium response of channel catfish to infection withIchthyophthiriusmultifiliis[J]. Journal of Aquatic Animal Health,1994, 6(3):187-196.

[2] Hines R S,Spira D T.Ichthyophthiriusmultifiliis(Fouquet) in the mirror carp,CyprinuscarpioL. Ⅰ. Course of infection [J]. Journal of Fish Biology, 1973,5(3):385-392.

[3] Dickerson H W,Dawe D L.IchthyophthiriusmultifiliisandCrypotocaryonirritans(Phylum Ciliophora) [G]//Woo P. Fish diseases and disorders, Wallingford: CAB International, 1995:181-227.

[4] Xu D H, Klesius P H, Shoemaker C A. Effect of lectins on the invasion ofIchthyophthiriustheront to channel catfish tissue [J]. Diseases of Aquatic Organisms, 2001,45(2):115-120.

[5] Haas W, Haberl B, Hofmann M, et al. Theronts ofIchthyophthiriusmultifiliisfind their fish hosts with complex behavior patterns and in response to different chemical signals [J]. The Tokai Journal of Experimental and Clinical Medicine, 1999,23(6):329-331.

[6] 鮑錦庫(kù). 植物凝集素的功能[J]. 生命科學(xué), 2011,23(6):533-540.

[7] Redondo M J, Alvarez-Pellitero P. Lectin histochemical detection of terminal carbohydrate residues in the enteric myxozoanEnteromyxumleeiparasitizing gilthead seabreamSparusaurata(Pisces: Teleostei): a study using light and transmission electron microscopy [J]. Folia Parasitologica, 2009,56(4):259-267.

[8] Bray R S.Leishmaniamexicanamexicana: attachment and uptake of promastigotes to and by macrophagesinvitro[J]. The Journal of Protozoology, 1983,30(2):314-322.

[9] Kim J H, Ogawa K, Wakabayashi H. Lectin-reactive components of the microsporidianGlugeaplecoglossiand their relation to spore phagocytosis by head kidney macrophages of ayuPleoglossusaltivelis[J]. Diseases of Aquatic Organisms, 1999,39(1):59-63.

[10] 賴(lài)曉健，熊靜，于海振. 應(yīng)用植物凝集素研究魚(yú)類(lèi)寄生蟲(chóng)病原生物學(xué)的進(jìn)展[J]. 水產(chǎn)科學(xué), 2013,32(10):616-620.

[11] Vommaro R C, Attias M, Silva Filho F C, et al. Surface charge and surface carbohydrates ofCryptobiasalmositicavirulent and avirulent forms and ofC.bullocki(Kinetoplastida: Cryptobiidae)[J]. Parasitology Research, 1997,83(7):698-705.

[12] Ribeiro S, Soares R M, Alviano C S, et al. Cell-surface carbohydrates ofEntamoebainvadens[J]. Parasitology Research, 1997,83(8):801-805.

[13] Grogl M, Franke E D, McGreevy P B, et al.Leishmaniabraziliensis: protein, carbohydrate and antigen differences between log phase and stationary phase promastigotesinvitro[J]. Experimental Parasitology, 1987,63(3):352-359.

[14] de Mateo M M, Bovo G, Comuzzi M, et al. Lectin histochemical studies onSphaerosporasp. (Myxosporea) from Italian brown trout,SalmotruttaL [J]. Journal of Fish Diseases, 1997,20(1):51-58.

[15] Redondo M J, Cortadellas N, Palenzuela O, et al. Detection of carbohydrate residues in the enteric parasiteEnteromyxumscophthalmi(Myxozoa) and possible interactions with its fish hostPsettamaxima[J]. Parasitology Research, 2008,102(6):1257-1267.

[16] Buchmann K, Nielsen M E. Chemoattraction ofIchthyophthiriusmultifiliis(Ciliophora) theronts to host molecules [J]. International Journal for Parasitology, 1999, 29(9):1415-1423.

[17] Lom J, Cerkosovova A. Host finding in invasive stages ofIchthyophthiriusmultifiliis[J]. Journal of Protozoology, 1974,21(3):457.

[18] Woo P T K. Protective immune response of fish to parasitic flagellates [J]. Annual Review of Fish Diseases, 1996(6):121-131.

[19] Redondo M J, Alvarez-Pellitero P. The effect of lectins on the attachment and invasion ofEnteromyxumscophthalmi(Myxozoa) in turbot (PsettamaximaL.) intestinal epitheliuminvitro[J]. Experimental Parasitology, 2010,126 (4):577-581.

[20] Mendo?a-Previato L, Todeschini A R, Heise N, et al. Protozoan parasite-specific carbohydrate structures [J]. Current Opinion in Immunology, 2005,15(5):499-505.

[21] Mahalingam A, Geonnotti A R, Balzarini J, et al. Activity and safety of synthetic lectins based on benzoboroxole-functionalized polymers for inhibition of HIV entry [J]. Molecular Pharmaceutics, 2011,8(6):2465-2475.

DetectionofCarbohydrateTerminalsinParasiteIchthyophthiriusmultifiliisTrophont

LAI Xiaojian1,2, XIONG Jing1,2, ZHANG Zhe3, LI Zhongqin1,2

( 1.College of Fisheries, Jimei University, Xiamen 361021, China; 2. Engineering Research Center of Modern Eel Technical Industry, Ministry of Education, Xiamen 361021, China; 3. Fisheries Research Institute of Fujian, Xiamen 361000, China )

In the present study, parasiteIchthyophthiriusmultifiliisinvaded into skin, gill and fin of gold fish (Crassiusauratus) was sampled, and the special binding sites of the parasitic trophont′s carbohydrate residues were pinpointed using plant lectins Con A, WGA, SBA and UEA-Ⅰ. The results showed Con A and WGA immunostainings were observed in the parasite trophonts, and Con A immunostaining was stronger than WGA. SBA and UEA-Ⅰ immunostainings were not found in the tissues. Trophonts in the gill showed stronger Con A immunostaining than those in the skin and fin. The trophonts in the fin showed stronger WGA immunostaining than those in the skin and gill. There were mannose/glucose residues and also N-acetylglucosamine residues in the trophonts. It is inferred that trophonts in the gill had more mannose/glucose residues than those in the skin and fin, and trophont in the fin had more N-acetylglucosamine residues than those in the skin and gill.

plant lectin;Ichthyophthiriusmultifiliis; carbohydrate residue;Carassiusauratus

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.06.019

S941.5

A

1003-1111(2016)06-0713-05

2015-11-09；

2016-03-11.

鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心開(kāi)放基金資助項(xiàng)目(RE201308)；福建省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2013J05052)；福建省科技廳重點(diǎn)項(xiàng)目(2013Y0089)；廈門(mén)市科技局項(xiàng)目(3502Z20133015)；集美大學(xué)科研啟動(dòng)金資助項(xiàng)目(ZQ2012001)．

賴(lài)曉健(1984—)，男，助理研究員，博士；研究方向：水產(chǎn)養(yǎng)殖與病害防治．E-mail: laixj@jmu.edu.cn．通訊作者：熊靜(1979—)，女，助理研究員，博士；研究方向：水產(chǎn)動(dòng)物免疫與病害防治．E-mail: xiongjing@jmu.edu.cn．