王志平，胡慶玲，郝 轉(zhuǎn)

( 1. 渭南師范學(xué)院 陜西省河流濕地生態(tài)與環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 渭南 714099； 2. 陜西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 陜西 西安710062 )

細(xì)菌脂多糖處理對(duì)斑馬魚(yú)免疫球蛋白亞型表達(dá)水平的影響

王志平1,2，胡慶玲1，郝 轉(zhuǎn)1

( 1. 渭南師范學(xué)院 陜西省河流濕地生態(tài)與環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 渭南 714099； 2. 陜西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 陜西 西安710062 )

以20 μg/mL的細(xì)菌脂多糖溶液對(duì)斑馬魚(yú)進(jìn)行浸泡處理24 h，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析斑馬魚(yú)IgM、IgD和IgZ基因表達(dá)水平的變化。對(duì)照組斑馬魚(yú)中IgD和IgZ的表達(dá)水平相當(dāng)，且均低于IgM，說(shuō)明IgM可能具有更重要的生物學(xué)作用。細(xì)菌脂多糖處理后，斑馬魚(yú)3種Ig亞型的表達(dá)水平均表現(xiàn)出先升后降趨勢(shì)，而且均在12 h達(dá)到最高值。然而，IgM和IgZ的升高幅度顯著高于IgD，而且IgM和IgZ在處理24 h后表達(dá)水平仍然顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明IgM和IgZ在魚(yú)類(lèi)病原防御中具有更重要的免疫作用。另外，IgM對(duì)細(xì)菌脂多糖處理的應(yīng)答速度比IgZ更快，說(shuō)明體液免疫系統(tǒng)能夠更快地對(duì)細(xì)菌脂多糖處理作出有效應(yīng)答，而黏膜免疫系統(tǒng)則反應(yīng)較慢。

斑馬魚(yú)；補(bǔ)體；細(xì)菌脂多糖處理；表達(dá)水平; 熒光定量PCR

免疫球蛋白(Ig)是適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在疾病與機(jī)體免疫中具有主要作用。目前，圍繞傳統(tǒng)模式動(dòng)物人和鼠的免疫球蛋白已開(kāi)展了大量研究，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物的免疫球蛋白主要有5種亞型(IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)。相比之下，僅在斑馬魚(yú)(Daniorerio)[1-3]、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[4-5]、鯉魚(yú) (Cyprinuscarpio)[6-8]和少量其他魚(yú)類(lèi)[9-11]中發(fā)現(xiàn)了3種Ig亞型，即IgD、IgM、IgZ，其中 IgZ被認(rèn)為是硬骨魚(yú)特有的Ig亞型[2]。

斑馬魚(yú)個(gè)體小，易于養(yǎng)殖、觀察和操作，而且具有較完善的基因組信息和遺傳學(xué)操作技術(shù)，成為研究魚(yú)類(lèi)免疫系統(tǒng)的新型模式生物[2,12]。Li等[13]曾研究了IgLC(Ig輕鏈恒定區(qū))、mIg(膜結(jié)合IgM的μ鏈)、sIg(分泌型IgM的μ鏈)以及IgZ(ζ鏈恒定區(qū))等基因在斑馬魚(yú)個(gè)體發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)水平及其對(duì)細(xì)菌脂多糖(LPS)處理的應(yīng)答，從而對(duì)斑馬魚(yú)適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的個(gè)體發(fā)育過(guò)程進(jìn)行了分析。Zimmerman等[2]則設(shè)計(jì)了一系列適于定量PCR分析的Ig亞型重鏈基因引物并研究了3種Ig亞型重鏈基因在個(gè)體發(fā)育過(guò)程的表達(dá)模式，他們發(fā)現(xiàn)在斑馬魚(yú)個(gè)體發(fā)育過(guò)程中IgM 的表達(dá)水平高于IgD和IgZ，說(shuō)明IgM在個(gè)體發(fā)育過(guò)程中可能具有更重要的生物學(xué)作用。有報(bào)道稱(chēng)，哺乳動(dòng)物不同Ig亞型的相對(duì)表達(dá)水平變化是機(jī)體免疫反應(yīng)的重要標(biāo)志之一[2]。本文采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)分析細(xì)菌脂多糖浸泡處理對(duì)斑馬魚(yú)不同Ig亞型基因表達(dá)水平的影響，旨在探討不同Ig亞型在魚(yú)類(lèi)機(jī)體免疫中的功能差異。

1 材料與方法

1.1 斑馬魚(yú)的飼養(yǎng)與處理

試驗(yàn)用斑馬魚(yú)購(gòu)自本地花鳥(niǎo)蟲(chóng)魚(yú)市場(chǎng)，在大玻璃缸內(nèi)馴化2周后用于試驗(yàn)。缸內(nèi)溫度為25～27 ℃，自然光周期并連續(xù)充氣，日投喂2次。取15尾健康斑馬魚(yú)放入質(zhì)量濃度為20 μg/mL 的細(xì)菌脂多糖溶液中[13]，3、6、12、24 h后各取3尾，用于提取RNA以檢測(cè)基因表達(dá)水平。取3尾未進(jìn)行處理的斑馬魚(yú)做對(duì)照。

1.2 RNA提取及cDNA制備

用DEPC水將斑馬魚(yú)洗3次，除去多余水分。加入液氮后迅速研磨，將組織粉末轉(zhuǎn)入離心管中并加入TRIZOL試劑(每0.1 g組織加1 mL)，充分振蕩搖勻后提取總RNA，并用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。將總RNA用DNase Ⅰ(Promega)消化，以消除基因組污染。之后，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。

為檢測(cè)反轉(zhuǎn)錄質(zhì)量，以跨內(nèi)含子的β-actin基因引物(上下游引物分別為5′-CTCCGGTATGTGCAAGGC-3′和5′-GCTGGGCTGTTGAAGGTC-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)(長(zhǎng)度應(yīng)為354 bp)。若僅有特異性目的片段，說(shuō)明無(wú)基因組污染，該模板cDNA可用于定量PCR分析；否則需對(duì)RNA進(jìn)一步消化并重新反轉(zhuǎn)錄。

1.3 Real-time PCR分析

本試驗(yàn)以β-actin基因作內(nèi)參基因[14-16]。所有引物序列引自Zimmerman等[2]，引物序列及擴(kuò)增子長(zhǎng)度見(jiàn)表1。引物由上海生物工程有限公司合成，以無(wú)菌水溶解，稀釋至15 μmol/L。

表1 定量PCR分析中所用引物

按照SYBR GREEN Real-time PCR Master Mix(TAKARA)說(shuō)明書(shū)在MiniOpticon PCR儀(伯樂(lè))進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增。每個(gè)反應(yīng)3個(gè)重復(fù)，反應(yīng)條件如下：

95℃3min1個(gè)循環(huán)95℃5s60℃15s72℃30s40個(gè)循環(huán)*熔解曲線分析

注：在每個(gè)循環(huán)的延伸階段收集熒光信號(hào).

1.4 數(shù)據(jù)分析

定量PCR結(jié)束后，根據(jù)目的基因和β-actin的Ct值，采用相對(duì)Ct法(2-ΔΔCt)法計(jì)算不同Ig亞型的相對(duì)表達(dá)量[17]，其中ΔCt=(Ct目的基因-Ctβ-actin)，ΔΔCt=(ΔCt目的基因-ΔCtIgM對(duì)照組)。結(jié)果以對(duì)照組IgM的表達(dá)量作參照。之后，對(duì)上述數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05認(rèn)為差異顯著。

2 結(jié) 果

電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)斑馬魚(yú)總RNA比較完整(圖1)，以跨內(nèi)含子的β-actin引物對(duì)cDNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增后所得產(chǎn)物單一且大小合適(約354 bp)(圖2)，說(shuō)明cDNA質(zhì)量很好。另外，定量PCR的熔解曲線僅有一個(gè)峰，再次證明擴(kuò)增的特異性。

圖1 斑馬魚(yú)總RNA的電泳檢測(cè)

圖2 斑馬魚(yú)反轉(zhuǎn)錄cDNA的β-actin擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)

2.1 細(xì)菌脂多糖處理對(duì)斑馬魚(yú)IgM基因表達(dá)水平的影響

IgM通常是動(dòng)物血液中含量最豐富的Ig亞型，主要功能是抑制、凝集、溶解入侵血液的細(xì)菌。以細(xì)菌脂多糖處理斑馬魚(yú)后，IgM的表達(dá)水平自6 h開(kāi)始顯著升高(1.58)(P<0.05)，12 h達(dá)到峰值(2.51)，隨后開(kāi)始降低，但24 h時(shí)其表達(dá)水平(2.05)仍然顯著高于對(duì)照組(1.00)(P<0.05)(圖3)。

圖3 細(xì)菌脂多糖處理對(duì)斑馬魚(yú)IgM基因表達(dá)水平的影響*表示與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)，其他圖同.

2.2 細(xì)菌脂多糖處理對(duì)斑馬魚(yú)IgD基因表達(dá)水平的影響

IgD可在個(gè)體發(fā)育的任何時(shí)候產(chǎn)生，與B細(xì)胞分化和發(fā)生密切相關(guān)。對(duì)照組斑馬魚(yú)中IgD的表達(dá)水平僅為0.63，顯著低于IgM。IgD對(duì)細(xì)菌脂多糖處理的應(yīng)答比較慢，直到12 h其表達(dá)水平才顯著升高(1.14)(P<0.05)，隨后其表達(dá)水平開(kāi)始降低，24 h時(shí)降到與對(duì)照組相當(dāng)?shù)乃?0.57)(圖4)。

圖4 細(xì)菌脂多糖處理對(duì)斑馬魚(yú)IgD基因表達(dá)水平的影響

2.3 細(xì)菌脂多糖處理對(duì)斑馬魚(yú)IgZ基因表達(dá)水平的影響

IgZ可能與哺乳動(dòng)物IgA存在一定的進(jìn)化關(guān)系，主要參與黏膜免疫反應(yīng)，而黏膜免疫系統(tǒng)是病原微生物入侵魚(yú)體的最初屏障。對(duì)照組斑馬魚(yú)中IgZ的表達(dá)水平(0.70)與IgD相當(dāng)(圖5)。斑馬魚(yú)經(jīng)細(xì)菌脂多糖處理后，IgZ的早期應(yīng)答模式與IgD十分相似，均自12 h開(kāi)始升高(1.80)，隨后逐漸降低，區(qū)別在于24 h時(shí)IgZ的表達(dá)水平(1.28)仍顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

3 討 論

與哺乳動(dòng)物類(lèi)似，魚(yú)類(lèi)的Ig亞型在形態(tài)學(xué)、結(jié)構(gòu)、基因型以及生理生化特征等方面存在諸多差異。目前，關(guān)于魚(yú)類(lèi)3種Ig亞型功能差異的研究還很有限。

細(xì)菌脂多糖是構(gòu)成革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的一種脂多糖，能夠引起一系列的生物學(xué)效應(yīng)，包括免疫刺激活性等。本文通過(guò)檢測(cè)Ig亞型對(duì)細(xì)菌脂多糖處理的應(yīng)答方式來(lái)比較3種魚(yú)類(lèi)Ig亞型的功能差異。研究表明，對(duì)照組斑馬魚(yú)中IgM的表達(dá)水平顯著高于IgD和IgZ，且后2種Ig亞型的表達(dá)水平相當(dāng)，這與Zimmerman等[2]的研究基本相似。

Hu等[3,8]發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌脂多糖刺激可引起斑馬魚(yú)IgZ和鯉魚(yú)IgT (IgZ同源物)的表達(dá)水平顯著升高。本文則進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，以細(xì)菌脂多糖浸泡處理斑馬魚(yú)后，3種Ig亞型的表達(dá)水平均顯著升高，其中IgM 和IgZ 的上升幅度顯著高于IgD(3種亞型的基因表達(dá)最高值分別是對(duì)照組的2.51、2.57和1.81倍)，而且24 h時(shí)IgM 和IgZ的表達(dá)水平仍顯著高于對(duì)照組，進(jìn)一步證明了IgM 和 IgZ 在抵抗病原入侵中具有更重要的免疫功能。

另外，從不同Ig亞型對(duì)細(xì)菌脂多糖處理的應(yīng)答時(shí)間看，IgM的應(yīng)答速度最快，其基因表達(dá)水平在6 h即顯著升高，而IgD和IgZ則從12 h開(kāi)始升高。說(shuō)明IgM參與的體液免疫系統(tǒng)能夠更快地對(duì)細(xì)菌脂多糖處理作出有效應(yīng)答，相比之下，IgZ參與的黏膜免疫系統(tǒng)則反應(yīng)較慢。

綜上，本文首次報(bào)道了低等脊椎動(dòng)物斑馬魚(yú)受到細(xì)菌脂多糖處理后3種Ig亞型基因表達(dá)水平的變化。關(guān)于魚(yú)類(lèi)3種Ig亞型的生物學(xué)功能和作用機(jī)制等尚需要深入研究，以進(jìn)一步比較魚(yú)類(lèi)和哺乳動(dòng)物的免疫球蛋白差異并闡明免疫球蛋白從魚(yú)類(lèi)向高等脊椎動(dòng)物的進(jìn)化過(guò)程。

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EffectofLipopolysaccharideTreatmentonExpressionofIgIsotypesInZebrafish

WANG Zhiping1,2, HU Qingling1, HAO Zhuan1

( 1. Key Laboratory for Ecology and Environment of River Wetlands in Shaanxi Province, Weinan Normal University, Weinan 714099, China; 2. Department of Life Science, Shaanxi Normal University, Weinan 710062, China )

The healthy zebrafish were immersed in 20 μg/mL LPS solution for 24 h, and the expressions of IgM, IgD and IgZ were analyzed by real-time fluorescent quantitative PCR. In the control group, the expression levels of IgZ and IgD were similar, lower than that of IgM, indicating a possible heighted role for the IgM isotype. After LPS challenge, the expression of all Ig isotypes was significantly increased with a peak in 12 h. However, the increase range of IgM and IgZ significantly exceeded that of IgD, and their expression remained higher level than that in the control until 24h, indicating that IgM and IgZ played more important immunological role in response to antigen invasion. Moreover, IgM up-regulated its expression a bit more rapidly than IgZ did, hinting at the clue that the humoral immune system might respond to LPS challenge a bit faster than the mucosal immune system.

zebrafish; Ig isotype; LPS treatment; expression; real-time fluorescent quantitative PCR

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.06.0023

S917.4

A

1003-1111(2016)06-0731-04

2015-12-02；

2016-03-08.

國(guó)家自然科學(xué)基金(31000410)；渭南市科技局科研計(jì)劃項(xiàng)目(2015KYJ-2-5)；渭南師范學(xué)院學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(14TSXK05).

王志平(1978—)，女，副教授，博士；研究方向：魚(yú)類(lèi)免疫學(xué). Email：wzhp1978@126.com.