鮑 相 渤

( 遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院，遼寧省海洋水產(chǎn)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023 )

皮氏蛾螺和水泡蛾螺線粒體基因組及核糖體ITS2的比較研究

鮑 相 渤

( 遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院，遼寧省海洋水產(chǎn)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023 )

利用PCR技術(shù)分別擴(kuò)增皮氏蛾螺和水泡蛾螺的線粒體全基因組以及核糖體第二轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS2，對所得序列進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，皮氏蛾螺和水泡蛾螺的線粒體基因組全序列長度分別為15 255 bp、15 265 bp，具有相似的堿基組成和AT含量，其基因排列順序完全一致，蛋白質(zhì)編碼基因長度相同，兩種螺的ITS2分別為340 bp和329 bp，一致性達(dá)83.6%。經(jīng)比對發(fā)現(xiàn)，皮氏蛾螺和水泡蛾螺的線粒體基因組及ITS2序列與已知的新腹足目動物相似。利用線粒體全基因組和核糖體序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，兩種序列的分析均顯示皮氏蛾螺和水泡蛾螺親緣關(guān)系較近。

皮氏蛾螺；水泡蛾螺；線粒體基因組；ITS2；系統(tǒng)發(fā)育

皮氏蛾螺(Volutharpaperryi)和水泡蛾螺(Bucciniumpemphigum)屬軟體動物門、腹足綱、新腹足目、蛾螺科，前者隸屬于渦蜀螺屬，后者屬于蛾螺屬[1-3]。蛾螺科動物在中國南北沿海均有分布，但多年來的調(diào)查結(jié)果表明，皮氏蛾螺和水泡蛾螺均僅見于黃海北部[2,4-5]。這兩種螺的足部可食用，價(jià)格相對于同科的香螺(Neptuneaarthriticacumingii)較為低廉且味道鮮美，近年來市場認(rèn)可度逐漸增加。因此，有必要對這兩種螺的宏觀和微觀基礎(chǔ)信息進(jìn)行探索、積累，進(jìn)而在保護(hù)種質(zhì)資源的前提下對其科學(xué)開發(fā)、合理利用。

國內(nèi)的一些專著中已對皮氏蛾螺、水泡蛾螺的分類地位、形態(tài)和習(xí)性等進(jìn)行了較為系統(tǒng)的描述[1-2,6]，也有學(xué)者先后開展了蛾螺科分類學(xué)研究[7-9]和系統(tǒng)學(xué)分析[10-12]。在分子生物學(xué)領(lǐng)域，有研究獲得了蛾螺科一些種類的12S rRNA、16S rRNA、18S rRNA、28S rRNA、H3、COⅠ等基因的序列并以此為基礎(chǔ)進(jìn)行了系統(tǒng)分析[10-11,13]，但鮮見線粒體基因組全序列和核糖體ITS的報(bào)道。動物線粒體基因組DNA是核外遺傳物質(zhì)，在新陳代謝、疾病、衰亡過程中發(fā)揮重要作用，具有結(jié)構(gòu)簡單、母系遺傳、進(jìn)化速度快等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于物種鑒定、類群系統(tǒng)分析等研究[14-16]。ITS區(qū)是位于編碼核糖體的18S rRNA、5.8S rRNA 、28S rRNA基因間的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，承受的選擇壓力較小，進(jìn)化速度快，具有很高的可變性，因此近年來對ITS序列進(jìn)行分析成為探討近緣種類遺傳關(guān)系的有效方法[17-19]。

相比單純使用線粒體基因片段而言，用線粒體基因組全序列進(jìn)行比較分析更為全面、更具說服力[20]，但線粒體DNA系母系遺傳，具有一定的局限性，因此本研究結(jié)合線粒體和核糖體序列，比較分析皮氏蛾螺和水泡蛾螺的線粒體基因組全序列及核糖體ITS2序列基本信息，探討其在系統(tǒng)發(fā)育分析中的應(yīng)用，旨在為研究蛾螺科演化關(guān)系提供分子領(lǐng)域論證，亦為這兩種螺的保護(hù)、開發(fā)和利用提供分子生物學(xué)理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究使用的皮氏蛾螺共6個(gè)個(gè)體，3個(gè)于2015年6月采自大連市長?？h獐子島，3個(gè)于2015年9月采自大連市長?？h海洋島；水泡蛾螺共5個(gè)個(gè)體，3個(gè)于2015年6月采自獐子島，2個(gè)于2015年10月采自大長山島，取足切成小塊置于95%乙醇固定保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取

試驗(yàn)時(shí)取固定的組織約50 mg，放入純凈水中漂洗去除乙醇，采用海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]，按說明書步驟操作提取基因組DNA。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增

使用無脊椎動物COⅠ擴(kuò)增通用引物[21]COⅠF和COⅠR擴(kuò)增皮氏蛾螺、水泡蛾螺的COⅠ基因片段(表1)。按照Takara LA Taq說明書的建議體系配制50 μL反應(yīng)液，具體反應(yīng)條件為：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，48 ℃ 30 s， 72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，凝膠成像系統(tǒng)顯示產(chǎn)物約500 bp，委托生工生物工程(上海)有限公司克隆測序。對測序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，確定種后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

表1 皮氏蛾螺和水泡蛾螺序列擴(kuò)增引物信息

根據(jù)GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)已公布的皮氏蛾螺、水泡蛾螺線粒體COⅠ和16S rRNA部分序列，每個(gè)物種設(shè)計(jì)兩對引物(表1)，采用兩步法分別擴(kuò)增COⅠ和16S rRNA基因間的長片段。按Takara LA Taq說明書建議體系配制50 μL反應(yīng)液，PCR條件為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，68 ℃ 9 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，皮氏蛾螺和水泡蛾螺的PCR產(chǎn)物大小十分相近，COⅠ至16S基因間約5000 bp，16S至COⅠ基因間約10 000 bp，委托生工生物工程(上海)有限公司對PCR產(chǎn)物采用引物步移法測序。

采用通用引物BTS2F、BTS2R[22]擴(kuò)增皮氏蛾螺和水泡蛾螺的ITS2片段(表1)。使用Takara La Taq并按說明書配制50 μL反應(yīng)液，具體反應(yīng)條件為：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s， 72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示產(chǎn)物約500 bp，委托生工生物工程(上海)有限公司對PCR產(chǎn)物克隆測序。

所有樣本均用于擴(kuò)增ITS2片段，線粒體全序列的擴(kuò)增和測定使用取自獐子島的皮氏蛾螺、水泡蛾螺樣本各1個(gè)完成。試驗(yàn)用引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.2.3 序列拼接及分析

結(jié)合已知的COⅠ和16S基因部分序列，利用Bioedit 7.0.1軟件對測序所得的皮氏蛾螺、水泡蛾螺序列進(jìn)行分析、輔助拼接，得到完整的線粒體基因組全序列。通過DNAMAN軟件、ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)和tRNAScan-SE(http://130.235.46.10/ARWEN/)在線工具，加之在GenBank中與近緣物種線粒體基因組相比較，分析定位蛋白編碼基因、rRNA基因和tRNA基因；用Mega 5軟件統(tǒng)計(jì)計(jì)算序列的堿基組成、密碼子使用情況，AT偏斜和GC偏斜分別根據(jù)公式(A-T)/(A+T)和(G-C)/(G+C)計(jì)算，DnaSP軟件確定ITS2序列的核苷酸多樣性參數(shù)。

1.2.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

在GenBank中檢索近緣序列，下載13個(gè)物種線粒體基因組全序列，與本研究得到的皮氏蛾螺、水泡蛾螺線粒體基因組全序列共同分析；下載8個(gè)物種的ITS2序列，與本研究得到的皮氏蛾螺、水泡蛾螺ITS2序列共同分析。用ClustalX 1.83軟件進(jìn)行比對，Phylip 3.695軟件最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析皮氏蛾螺、水泡蛾螺與近緣種的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 線粒體基因組概況

皮氏蛾螺線粒體基因組全序列長度為15 255 bp(GenBank登錄號：KT382829)，水泡蛾螺線粒體基因組全序列長度為15 265 bp(GenBank登錄號：KT962044)，兩者均為閉合環(huán)狀分子，長度在已測知的軟體動物線粒體基因組長度范圍內(nèi)。兩者全序列長度非常接近，編碼區(qū)長度完全相同，差異存在于非編碼區(qū)。這兩種蛾螺的線粒體基因組都包含了13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因、2個(gè)rRNA基因和22個(gè)tRNA基因(表2)，基因排列的順序和位置與GenBank中公布的大多數(shù)新腹足目動物相同，除了8個(gè)tRNA基因外的其余基因都編碼于H鏈。皮氏蛾螺與水泡蛾螺的線粒體基因組堿基組成也非常接近，4種堿基所占比例相仿(表3)。

注：Vp，皮氏蛾螺；Bp，水泡蛾螺. 表3同.

表3 皮氏蛾螺和水泡蛾螺線粒體堿基組成信息

2.2 蛋白質(zhì)編碼基因

皮氏蛾螺和水泡蛾螺的線粒體基因組各包含13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因：3個(gè)細(xì)胞色素氧化酶亞基基因(COX1、COX2、COX3)、7個(gè)NADH脫氫酶亞基基因(ND1、ND2、ND3、ND4、ND4L、ND5、ND6)、2個(gè)ATP合成酶亞基基因(ATP8、ATP6)、1個(gè)細(xì)胞色素b編碼基因(CYTB)，編碼區(qū)長度均為11 244 bp。皮氏蛾螺的13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因均以ATG作為起始密碼子，水泡蛾螺除ND4基因外也均以ATG作為起始密碼子；兩種蛾螺的ND4L、ND4、ND5和ND3基因終止密碼子為TAG，其余基因終止密碼子均為TAA(表2)。

2.3 tRNA和rRNA基因

皮氏蛾螺、水泡蛾螺的線粒體12S rRNA位于tRNA-Glu和tRNA-Val間，長度分別為881、876 bp，16S rRNA位于tRNA-Val和tRNA-Leu間，分別為1357、1270 bp，2個(gè)rRNA基因一致性均超過90%(表2)。皮氏蛾螺和水泡蛾螺的線粒體基因組都含有22個(gè)tRNA基因，其中tRNA-Met、tRNA-Tyr、tRNA-Cys、tRNA-Trp、tRNA-Gln、tRNA-Gly、tRNA-Glu和tRNA-Thr位于L鏈上。tRNA-Ser缺少D臂，剩余的tRNA都能折疊成典型的三葉草二級結(jié)構(gòu)。

2.4 ITS2核苷酸組成及序列分析

對皮氏蛾螺、水泡蛾螺ITS2的PCR產(chǎn)物的測序結(jié)果進(jìn)行分析，比對近緣物種去除兩端的5.8S和28S區(qū)域，發(fā)現(xiàn)不同采樣地的同種螺ITS2序列一致性均達(dá)99.7%以上，未見片段插入或缺失。得到皮氏蛾螺ITS2序列340 bp，A、T、C、G 4種堿基的平均含量為14.4%、21.3%、34.2%、30.1%，共檢測到3個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，其中簡約信息位點(diǎn)2個(gè)；水泡蛾螺ITS2的A、T、C、G平均含量分別為16.7%、22.2%、31.6%、29.5%，329個(gè)位點(diǎn)中共檢測到2個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，均為簡約信息位點(diǎn)。取擴(kuò)增線粒體全基因組的皮氏蛾螺、水泡蛾螺個(gè)體為例，兩者ITS2序列一致性達(dá)83.62%，堿基組成較相似，GC含量(64.1%、61.1%)均明顯高于AT含量(35.9%、38.9%)。

2.5 系統(tǒng)發(fā)育分析

基于線粒體基因組全序列和ITS2序列，分別采用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，得到的系統(tǒng)進(jìn)化拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與各物種的分類學(xué)地位基本一致。線粒體基因組全序列發(fā)育樹中，以綿竹擬釘螺(Triculahortensis)和湖北釘螺(Oncomelaniahupensis)為外群，各超科的物種均形成了不同分支，皮氏蛾螺、水泡蛾螺與織紋螺科的Ilyanassaobsolete、Nassariusreticulatus和蛾螺科的Babylonialutosa、B.areolata聚到一起(圖1)；在ITS2發(fā)育樹中，以艷尖耳螺(Melampusluteus)為外群，各超科聚類清晰，皮氏蛾螺、水泡蛾螺與蛾螺屬的B.striatissimum聚為一支(圖2)。

圖1 線粒體基因組全序列最大似然法系統(tǒng)發(fā)育樹

圖2 ITS2核苷酸序列最大似然法系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討 論

在研究生物起源及進(jìn)化研究領(lǐng)域，線粒體基因組發(fā)揮著很大作用[23]。對皮氏蛾螺和水泡蛾螺的分析表明，這兩種蛾螺線粒體的基因組成、排列順序與大多數(shù)新腹足目動物較為相似[24]，說明了線粒體基因組在進(jìn)化上的保守性。關(guān)于海產(chǎn)軟體動物的各項(xiàng)研究中，雙殼貝類的相關(guān)報(bào)道更為詳細(xì)、深入，其線粒體基因組的分析也更為成熟。在已公布的雙殼綱貝類中，簾蛤目、珍珠貝目、貽貝目均有部分物種出現(xiàn)了線粒體ATP8基因的缺失，也有不同科、屬間出現(xiàn)編碼基因及tRNA基因排列順序發(fā)生變化的情況[25]；本研究得到的皮氏蛾螺、水泡蛾螺，以及GenBank中檢索到的新腹足目線粒體全基因組序列，均未發(fā)現(xiàn)缺少ATP8基因的情況，tRNA排列順序也變化不大。有學(xué)者在比對海洋與淡水雙殼類線粒體基因組結(jié)構(gòu)后，認(rèn)為海洋貝類ATP8基因的缺失有可能與其生存環(huán)境條件和能量代謝相關(guān)[26]，但現(xiàn)已公布線粒體全基因組的海洋新腹足目動物未出現(xiàn)ATP8基因缺失現(xiàn)象，推測該基因在一些雙殼貝類中的缺失并非受環(huán)境影響，可能與進(jìn)化有關(guān)。雖然目前腹足綱的線粒體基因組研究與雙殼綱還有很大距離，但已知的序列亦提供了有價(jià)值的參考信息，對兩個(gè)綱的具體進(jìn)化和基因功能研究具有特殊意義。

后生動物中線粒體AT含量普遍高于GC含量[27]，本研究獲取的皮氏蛾螺和水泡蛾螺也是如此，無論是基因編碼區(qū)還是rRNA都表現(xiàn)出這個(gè)特征。兩種蛾螺蛋白質(zhì)編碼基因密碼子第3位的AT含量分別高達(dá)81.3%和84.1%，這一結(jié)果與很多海洋軟體動物線粒體堿基組成相似，在巨牡蠣(Crassostrea)、竹蟶(Solen)等貝類中均有過報(bào)道[28-29]；而在ITS2的堿基組成上，GC含量則大于AT含量，均超過60%，這一高GC含量與雙殼貝類中的文蛤(Meretrixmeretrix)、雜色蛤(Ruditapesvariegata)、西施舌(Coelomactraantiquata)等較為類似[30-31]。值得注意的是，水泡蛾螺線粒體ND4基因以GTG作為起始密碼子，真核生物和原核生物里均出現(xiàn)過以GTG作為起始密碼的情況，如雞和一些魚類的COⅠ基因、鼠的ND1和ATP8基因、果蠅的ND5基因等[32-34]，但目前海洋腹足類動物中尚未見類似信息。

通常認(rèn)為動物線粒體呈母系遺傳，且種內(nèi)不同個(gè)體間存在序列差別，但線粒體基因組還存在著父系滲漏、雙單親遺傳方式，少數(shù)貽貝目、蚌目、簾蛤目的雙殼貝類中有過雙單親遺傳的報(bào)道[35-38]。新腹足目動物線粒體基因組的研究中尚未發(fā)現(xiàn)特殊的遺傳方式，為了在系統(tǒng)發(fā)育中提供更客觀的信息，本研究同時(shí)引入了核糖體ITS2綜合探討。ITS序列具有較多變異，常被用來進(jìn)行種的鑒別和近緣遺傳分析，在水產(chǎn)軟體動物的相關(guān)研究中，曾有學(xué)者將ITS序列應(yīng)用到了鮑屬(Haliotis)19個(gè)種的系統(tǒng)分類分析上[39]?；诰€粒體全序列和核糖體ITS2序列，本研究構(gòu)建的兩個(gè)系統(tǒng)發(fā)育樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本符合形態(tài)分類學(xué)結(jié)論。筆者注意到，ITS2系統(tǒng)發(fā)育樹中，水泡蛾螺與同為蛾螺屬的B.striatissimum聚為一支，之后與渦蜀螺屬的皮氏蛾螺聚到一起，可見新腹足目的分類研究中ITS2序列適用于種間及以上分階親緣關(guān)系的分析；而在線粒體系統(tǒng)發(fā)育樹中，皮氏蛾螺、水泡蛾螺組成的分支與織紋螺科的動物組成小分支，然后才與蛾螺科的B.areolata、B.lutosa聚到一起，皮氏蛾螺雖與水泡蛾螺在分類上同科不同屬，但其線粒體基因組全序列和ITS2序列的一致性都較高，皮氏蛾螺與B.areolata、B.lutosa的親緣關(guān)系還需進(jìn)一步考證。

軟體動物的親緣關(guān)系很復(fù)雜，其分類地位一直存在爭議，由外部形態(tài)和解剖學(xué)特征組成的形態(tài)特征是確定其分類地位的重要依據(jù)[40]，近年來分子層面數(shù)據(jù)的開發(fā)則為系統(tǒng)發(fā)育、物種分類提供了新的參考，但與昆蟲、脊椎動物相比，軟體動物的研究比較落后，而腹足綱動物的許多數(shù)據(jù)還很缺乏，有效信息有待開發(fā)。

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ComparisonofCompleteMitochondrialGenomesandITS2RegionsinWhelksVolutharpaperryiandBucciniumpemphigum

BAO Xiangbo

( Liaoning Key Laboratory of Marine Fishery Molecular Biology, Liaoning Ocean and Fisheries Science Research Institute, Dalian 116023, China )

In this study, we amplified the complete mitochondrial genome and ITS2 nucleotides in whelksVolutharpaperryiandBucciniumpemphigum. After the whelks were sequenced and assembled, the software Bioedit 7.0.1, Mega 5 and Phylip-3.695 were used to analyze the data. The complete mitogenome was 15 255 bp inV.perryiand 15 265 bp inB.pemphigumin length， similar in composition and AT content, and identical in gene order. The ITS2 sequences ofV.perryiandB.pemphigumwere 340 bp and 329 bp in length, with the identity of 83.6%. By comparison, both mitogenome and ITS2 sequences were found to be similar to most known Neogastropoda animals. Phylogenetic trees were constructed by the complete mitogenome and ITS2 sequences, showing a close relationship between the two species.

Volutharpaperryi;Bucciniumpemphigum; mitochondrial genome; ITS2; phylogenetic analysis

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.06.014

S917

A

1003-1111(2016)06-0686-07

2016-02-02；

2016-04-26.

國家科技基礎(chǔ)條件平臺建設(shè)運(yùn)行項(xiàng)目(2012DKA30470-012).

鮑相渤(1983—)，女，助理研究員；研究方向：海洋生物分子生物學(xué).E-mail: bobo_1325@126.com.