馬燕，謝式云，易永紅，金樁，陳俊波

（1.羅牛山股份有限公司，海南?？?70125；2.海南羅牛山畜牧有限公司，海南?？?70100；3.海南職業(yè)技術(shù)學(xué)院，海南?？?70126）

乳糖乳桿菌的培養(yǎng)條件優(yōu)化研究

馬燕1，謝式云1，易永紅1，金樁2，陳俊波3

（1.羅牛山股份有限公司，海南?？?70125；2.海南羅牛山畜牧有限公司，海南海口570100；3.海南職業(yè)技術(shù)學(xué)院，海南?？?70126）

研究通過單因子優(yōu)化和正交試驗(yàn)對乳糖乳桿菌培養(yǎng)條件進(jìn)行初步的優(yōu)化。結(jié)果表明，乳糖乳桿菌屬于厭氧菌，在改良MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)最佳條件是：溫度為35℃，培養(yǎng)時(shí)間為48 h，初始pH為9.0，接種量為2.0%；乳糖乳桿菌最適合生長培養(yǎng)基成分為蛋白胨8 g，酵母提取物6 g，牛肉膏8 g，葡萄糖16 g，乙酸鈉5 g，檸檬酸銨2.15 g，Tween 80 1 mL，七水硫酸鎂（MgSO4·7H2O）0.58 g，四水硫酸錳（MnSO4·4H2O）0.05 g，磷酸氫二鉀（K2HPO4）2 g，瓊脂粉17 g，水1 000 mL。此時(shí)OD值能達(dá)到1.638，活菌數(shù)能達(dá)到1.88×109cfu/mL。

乳糖乳桿菌；培養(yǎng)條件；培養(yǎng)基成分；優(yōu)化；OD值；活菌數(shù)

從20世紀(jì)60年代開始人們發(fā)現(xiàn)在動物飼養(yǎng)業(yè)中使用抗生素的種種弊端。由于在飼料中抗生素的廣泛應(yīng)用，導(dǎo)致動物胃腸道正常菌群失調(diào)，產(chǎn)生耐藥性和藥物殘留等副作用，給動物和作為動物產(chǎn)品消費(fèi)者的人類健康都帶來了危害[1-2]。于是人們關(guān)注和尋找能夠克服上述弊端的抗生素替代物，乳糖乳桿菌制劑就是其中一種重要的研究對象[3]。大量研究表明，乳酸菌具有改善飼料適口性，調(diào)節(jié)腸道菌群，抑制腸道內(nèi)腐敗菌生長繁殖，消除體內(nèi)有毒物質(zhì)的產(chǎn)生，改善便秘、肝功能和維生素代謝，提高免疫功能等作用[4-6]。但是，在實(shí)際生產(chǎn)中乳酸菌制劑的飼用效果不完全一致[7-9]。筆者認(rèn)為，目前乳酸菌制劑生產(chǎn)還沒有國家標(biāo)準(zhǔn)，市場上的產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，進(jìn)而影響產(chǎn)品使用效果。本研究對飼用乳糖乳桿菌的培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化研究，給乳酸菌發(fā)酵飼料的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)提供優(yōu)質(zhì)一級菌種。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn)

2016年5—6月在羅牛山股份有限公司博士后科研工作站實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 菌種

由羅牛山股份有限公司博士后科研工作站菌種保藏中心提供。

1.3 試驗(yàn)設(shè)備

振蕩培養(yǎng)箱（SHZ-A型，上海躍進(jìn)醫(yī)療機(jī)械廠）；生化培養(yǎng)箱（DHP120型，上海實(shí)驗(yàn)儀器總廠）；高壓滅菌器（MLS-3750型，日本三洋電子有限公司）；磁力攪拌器（JB-3型，上海智光儀器儀表有限公司）；便攜式pH計(jì)（PHB-3型，上海偉業(yè)儀器廠）；生物潔凈工作臺（SA-960-2型，上海上凈凈化設(shè)備有限公司）；721可見紫外分光光度計(jì)（上海菁華科技儀器有限公司）。

1.4 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基（MRS培養(yǎng)改良基）[10]：蛋白胨10 g，酵母提取物5g，牛肉膏10g，葡萄糖20g，乙酸鈉5g，檸檬酸銨2.15g，Tween801mL，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4· 4H2O 0.05 g，K2HPO42 g，瓊脂粉17 g，水1 000 mL。

1.5 培養(yǎng)條件優(yōu)化

菌種活化：從冰箱中取出乳糖乳桿菌斜面菌種，室溫靜置活化40 min。而后用接種環(huán)取種兩環(huán)接種于裝有10 mL MRS改良液體培養(yǎng)基的試管中，37℃靜止培養(yǎng)12 h，備用。

1.5.1 靜置培養(yǎng)和搖床培養(yǎng)對比（培養(yǎng)時(shí)間X的確定）按1.0%接種量將活化的種子接種于裝有100 mL MRS改良液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，37℃靜置培養(yǎng)和60 r/min振蕩培養(yǎng)60 h，每隔12 h取1次樣（先搖勻后取樣），在610 nm處測定培養(yǎng)液OD值。

1.5.2 培養(yǎng)基起始pH的篩選以6 mol/L的HCl或NaOH溶液將MRS改良培養(yǎng)基的起始pH分別調(diào)節(jié)為4.5、5.5、6.5、7.5、8.5和9.0，接入1.0%的乳糖乳桿菌活化菌液，37℃下恒溫培養(yǎng)X h，在610 nm處測定菌液OD值。

1.5.3 培養(yǎng)溫度的篩選將100 mL的MRS改良液體培養(yǎng)基中接入1.0%的乳糖乳桿菌活化菌液，分別于30、35、40、45℃下恒溫培養(yǎng)X h，在610 nm處測定菌液OD值。

1.5.4 接種量的確定按0.5%、1.0%、1.5%、2.0%的接種量接乳糖乳桿菌活化菌液后靜置培養(yǎng)X h取樣，測定培養(yǎng)液OD值。

1.6 培養(yǎng)基成分的優(yōu)化

蛋白胨、酵母提取物、牛肉膏和葡萄糖是影響培養(yǎng)基成本的主要成分。因此，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)L16（45）正交試驗(yàn)，確定乳糖乳桿菌培養(yǎng)基成分，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 L16（45）正交設(shè)計(jì)因素

1.7 試驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)

用Excel 2007對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和圖表處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳糖乳桿菌靜置培養(yǎng)和搖床培養(yǎng)對比及培養(yǎng)時(shí)間的確定

從表2和圖1可知，靜置和搖床培養(yǎng)的菌液起始OD值一樣，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長OD值逐漸變大。靜置和搖床培養(yǎng)在0～12 h內(nèi)生長比較緩慢，12～48 h內(nèi)生長較快，菌種生長進(jìn)入對數(shù)生長期，48 h時(shí)OD值幾乎接近峰值，靜置培養(yǎng)可以達(dá)到1.260，優(yōu)于搖床培養(yǎng)，48 h后逐漸接近平穩(wěn)。試驗(yàn)結(jié)果說明，乳糖乳桿菌是厭氧菌，符合乳酸菌多數(shù)屬于厭氧菌或微好氧菌的結(jié)論[11]，該乳糖乳桿菌的最佳培養(yǎng)時(shí)間是48 h。

表2 靜置和搖床培養(yǎng)乳糖乳桿菌菌液OD值對比

圖1 靜置和搖床培養(yǎng)乳糖乳桿菌菌液OD值對比

2.2 培養(yǎng)基起始pH的確定

將乳糖乳桿菌接種于不同起始pH的培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)48 h，測定菌液OD值結(jié)果見表3。從表3可以看出，乳糖乳桿菌對酸堿環(huán)境的適應(yīng)能力較強(qiáng)，pH 4.5～9.0都可以生長。當(dāng)pH小于5.5或大于8.5時(shí)生長較好，而在pH 5.5～7.5范圍內(nèi)生長較慢。pH 4.5與pH 9.0時(shí)生長較好，pH 9.0時(shí)OD值達(dá)到1.568，相對最高。許多研究表明[12-15]，乳酸菌在pH 4.5～8.0范圍內(nèi)生長良好。而本試驗(yàn)結(jié)果最適初始pH約在9.0時(shí)乳糖乳桿菌生長最好，應(yīng)該是該菌特性。

表3 不同起始pH乳糖乳桿菌菌液的OD值

2.3 培養(yǎng)溫度的確定

將乳糖乳桿菌培養(yǎng)液分別置于30、35、40、45℃下恒溫培養(yǎng)48 h，測定的OD值結(jié)果見表4。

表4 不同溫度下乳糖乳桿菌培養(yǎng)液OD值

從表4可以看出，隨著溫度的提高乳糖乳桿菌菌液的OD值先增高后降低。李艾黎等[16]用嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌為對象，研究了不同培養(yǎng)溫度（37、42、45℃）對其混合生長的影響。試驗(yàn)證實(shí)培養(yǎng)環(huán)境為42℃時(shí)，不僅有利于酸奶菌種混合培養(yǎng)時(shí)的球桿菌比例平衡，其生長速率也有顯著提高。李志成等[17]以脫脂乳為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，選用保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌混合菌種在30、34、37、42℃發(fā)酵，研究發(fā)酵溫度對凍干酸奶發(fā)酵劑活菌數(shù)的影響。結(jié)果表明，不同發(fā)酵溫度下制得的凍干發(fā)酵劑活菌數(shù)有顯著差異，尤其是在30℃發(fā)酵制得的凍干發(fā)酵劑其活菌數(shù)顯著高于其他發(fā)酵溫度，其凍干發(fā)酵劑活菌數(shù)高達(dá)4.2×1011cfu/g。熊素玉等[18]用改良MC培養(yǎng)基為載體，對分離到的24株菌進(jìn)行最適培養(yǎng)條件的研究。結(jié)果表明，最適生長溫度大概在40℃左右，但在各菌株間略有差異。張建國等[19]研究表明，試驗(yàn)用乳酸菌在40℃時(shí)效果略好于20和30℃。張?zhí)m威等[20]研究了培養(yǎng)溫度（38、41、44℃）對保加利亞桿菌嗜熱鏈球菌混合培養(yǎng)的影響。結(jié)果表明，較高溫度（44℃）有利于中利亞桿菌生長，且混合培養(yǎng)的總菌數(shù)多。即高溫度（44℃）可以促進(jìn)混合培養(yǎng)中保加利亞桿菌和嗜熱鏈球菌快速生長。綜合上述，乳酸菌最適溫度在30～44℃之間，因菌株不同而各異。本試驗(yàn)用的飼用乳糖乳桿菌在35與40℃時(shí)生長OD值相差不大，根據(jù)試驗(yàn)實(shí)際需要，本試驗(yàn)最終選用35℃作為飼用乳糖乳桿菌的培養(yǎng)溫度。

2.4 接種量的確定

按0.5%、1.0%、1.5%、2.0%的接種量，接種乳糖乳桿菌活化菌靜置培養(yǎng)48 h，測定OD值結(jié)果見表5。

從表5可以看出，隨著接種量的增多，OD值也逐漸變大。當(dāng)接種量為0.5%時(shí)OD值平均值為0.583，接種量為2.0%時(shí)OD值平均值為1.430，明顯高于0.5%的接種量，所以本次試驗(yàn)采用了2.0%的接種量。

表5 不同接種量乳糖乳桿菌菌液的OD值

李劍芳等[21]通過正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)確定乳酸菌最優(yōu)接種量為1.0%。邵亞東等[22]為制備高濃度乳酸菌發(fā)酵劑，按1.0%接種量接種乳酸菌，可以使乳酸菌活菌數(shù)的對數(shù)值達(dá)到108～109cfu/mL以上。趙玲艷等[23]從辣椒中提取的乳酸菌用于辣椒發(fā)酵時(shí)的最佳接種量為1.0%。

2.5 最適培養(yǎng)基成分的確定

從表6試驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，在乳糖乳桿菌生長最佳條件（溫度35℃，時(shí)間48 h，接種量為2.0%）下，組合A2B1C2D3（蛋白胨8 g，酵母提取物3 g，牛肉膏8 g，葡萄糖20 g）測出的OD值最大，即1.614。但經(jīng)過分析結(jié)果，乳糖乳桿菌實(shí)際最佳的培養(yǎng)基組合應(yīng)為A2B4C2D1（蛋白胨8 g，酵母提取物6 g，牛肉膏8 g，葡萄糖16 g）。因該組合不在實(shí)際操作組合中，所以進(jìn)行了1次驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果表明，A2B4C2D1組OD值為1.638，大于A2B1C2D3組合OD值，即乳糖乳桿菌最適合生長培養(yǎng)基成分為蛋白胨8 g，酵母提取物6 g，牛肉膏8 g，葡萄糖16 g。影響生長因子次序?yàn)榻湍柑崛∥铮酒咸烟牵镜鞍纂耍九Ｈ飧唷?/p>

表6 乳糖乳桿菌培養(yǎng)基成分正交試驗(yàn)結(jié)果

2.6 乳糖乳桿菌生長曲線

在上述最優(yōu)培養(yǎng)條件下，乳糖乳桿菌生長情況見表7和圖2。由表7和圖2可知，優(yōu)化培養(yǎng)后OD值能達(dá)到1.638，活菌數(shù)為1.88×109cfu/mL。

表7 不同時(shí)間乳糖乳桿菌培養(yǎng)液OD值和活菌數(shù)

圖2 乳糖乳桿菌生長曲線

3 結(jié)論

（1）飼用乳糖乳桿菌屬于厭氧菌，其最佳培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為35℃，培養(yǎng)時(shí)間為48 h，接種量為2.0%，初始pH為9.0。

（2）最佳培養(yǎng)基成分為：蛋白胨8 g，酵母提取物6 g，牛肉膏8 g，葡萄糖16 g，乙酸鈉5 g，檸檬酸銨2.15 g，Tween 80 1 mL，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4· 4H2O 0.05 g，K2HPO42 g，瓊脂粉17 g，水1 000 mL。

（3）在最優(yōu)培養(yǎng)條件下，48 h時(shí)乳糖乳桿菌OD值能達(dá)到1.638，活菌數(shù)1.88×109cfu/mL。

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（編輯：郭玉翠）

TS252

A

1002-1957(2016)05-0017-04

2016-08-09

馬燕（1984-），女，海南?？谌耍硇竽翈?，主要從事畜牧生產(chǎn)相關(guān)方面的試驗(yàn)與科研工作研究.E-mail:435526209@qq.com

金樁（1967-），研究員，博士后，研究方向?yàn)閯游餇I養(yǎng)與飼料加工.E-mail:414726948@qq.com