張 媛,李 建,張 磊,王秀麗,張立春,丁家波
(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,北京100081)
兔多殺性巴氏桿菌病是家兔養(yǎng)殖業(yè)嚴(yán)重的常見病之一[1-2],為預(yù)防控制該病中國許多學(xué)者開展了大量的疫苗研發(fā)工作,已經(jīng)獲得新獸藥證書的產(chǎn)品有兔病毒性出血癥、多殺性巴氏桿菌病、產(chǎn)氣莢膜梭菌病(A型)三聯(lián)滅活疫苗(皖阜株+C51-17株+蘇84-A株)等11個產(chǎn)品。這些產(chǎn)品的效力檢驗均采用免疫攻毒法進行,C51-17株是其常用的攻毒用菌株。該菌株1~5 CFU活菌皮下注射可致死家兔,攻擊的菌數(shù)對疫苗效力檢驗結(jié)果影響很大,因此,攻毒劑量的準(zhǔn)確性在以C51-17株為攻毒菌株的效力檢驗中顯得尤為重要。為了保證攻毒劑量準(zhǔn)確,必須對攻毒菌液濃度有準(zhǔn)確的把握。傳統(tǒng)采用將菌液4℃保存過夜計算菌存率及測定菌液吸光值估算菌液濃度的方法,在實際檢驗中發(fā)現(xiàn),采用這兩種方法估算的菌液濃度往往與攻毒菌液的實際濃度偏差較大,需要檢驗工作的重復(fù),造成人力、財力的浪費。本試驗擬采用將菌液分裝后置-80℃凍存的方法對菌液進行預(yù)數(shù),并比較了菌液3種不同處理方法對實際計數(shù)結(jié)果的影響。
1.1 材料
1.1.1 菌株 兔多殺性巴氏桿菌 C51-17株,由中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心提供。
1.1.2 培養(yǎng)基 馬丁肉湯、改良馬丁瓊脂,購自北京中海動物保健科技公司。
1.1.3 試劑 裂解血細(xì)胞全血,由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。新生牛血清,購自美國Hyclone實驗室公司。
1.1.4 實驗動物 兔多殺性巴氏桿菌病陰性的健康家兔,2月齡,1.5 kg左右,三批,購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。
1.1.5 主要儀器設(shè)備 GNP-9270型隔水式恒溫培養(yǎng)箱購自上海精宏實驗設(shè)備有限公司。THZ-C型恒溫振蕩器購自太倉市實驗設(shè)備廠。Herasafe KS生物安全柜購自德國Heraeus公司。酶標(biāo)儀購自美國BIO-RAD公司。低溫冰箱購自日本日立公司。
1.2 方法 本試驗將C51-17菌液分別采用置4℃保存過夜計算菌存率、測定菌液吸光值及置-80℃凍存三種處理方法估算菌液濃度,并將上述三種方法獲得的菌液濃度估值與實值分別通過t檢驗進行統(tǒng)計分析,以確定菌液濃度估值與實值最為接近的方法,此方法視為攻毒菌液最佳處理方法。對采用此方法處理過的菌液的穩(wěn)定性及毒力進行了測定,并將此方法應(yīng)用于疫苗效力檢驗,具體試驗方法如下:
1.2.1 攻毒菌液最佳處理方法的篩選 按處理方法的不同,試驗分A、B、C 3組,每組試驗重復(fù)5次。
A組采用4℃過夜保存法,對C51-17菌液進行活菌計數(shù)后將其放置4℃保存過夜,然后再對其進行一次活菌計數(shù),與第一次計數(shù)結(jié)果比較,計算出菌液放置4℃過夜后的菌存率,此過程為預(yù)數(shù)過程。按照與第一次培養(yǎng)菌液相同的培養(yǎng)條件再次培養(yǎng)C51-17菌液,對其進行活菌計數(shù)后將其放置4℃保存過夜,根據(jù)菌數(shù)結(jié)果及預(yù)數(shù)計算的菌存率估算出菌液濃度,同時對菌液進行活菌計數(shù),計算出菌液濃度實值。
B組采用測定菌液吸光值法,用相同的培養(yǎng)條件培養(yǎng)5份C51-17菌液,對其分別進行活菌計數(shù),同時分別測定OD450nm值,此過程為預(yù)數(shù)過程。按照與第一次培養(yǎng)菌液相同的培養(yǎng)條件再次培養(yǎng)C51-17菌液,測定其OD450nm值,根據(jù)預(yù)數(shù)菌液OD450nm值對應(yīng)的菌液濃度,估算出此菌液濃度,同時對菌液進行活菌計數(shù),計算出菌液濃度實值。
C組采用-80℃分裝凍存法,將C51-17菌液分裝置2支試管中,每支裝量3 mL,同時放置-80℃凍存。取出1支室溫融化后進行活菌計數(shù),此過程為預(yù)數(shù)過程。至少間隔1 d,將第2支試管取出,室溫融化,預(yù)數(shù)的菌液濃度即為此菌液濃度的估值,對其進行活菌計數(shù),計算出菌液濃度實值。
采用t檢驗分析不同處理方法獲得的菌液濃度估值與其實值間是否存在顯著差異。首先根據(jù)檢驗數(shù)據(jù)求出平均值ˉx及樣本標(biāo)準(zhǔn)偏差s,將有關(guān)數(shù)據(jù)代入計算公式中計算t值。其次,根據(jù)選定的顯著性水準(zhǔn)α=0.05及df值,由t分布表查得t臨界值。最后,將計算得到的t值與查表得到的t臨界值比較,如果前者小于后者,則認(rèn)為二者之間無顯著性差異[3]。t值計算公式:
式中:x1—第一次檢驗測量數(shù)據(jù)的平均值;x2—第二次檢驗測量數(shù)據(jù)的平均值;s1— 第一次檢驗測量數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差;s2—第二次檢驗測量數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差;n1—第一次檢驗測量的測量次數(shù);n2—第二次檢驗測量的測量次數(shù)。1.2.2 攻毒菌液最佳處理方法的檢定 方法處理過的菌液的穩(wěn)定性試驗:將C51-17菌液分裝置5支試管中,每支裝量3 mL,置-80℃凍存。于凍存后1、5、15、25、35 d 分別各取出1 支,室溫融化后進行活菌計數(shù)。
采用穩(wěn)健統(tǒng)計方法,測定Z比分值,用于分析菌液置-80℃保存不同時間后濃度變化程度。Z比分值采用X、XM、Norm IQR來確定。Z比分值計算公式:Z=(X-XM)/Norm IQR,式中:Z為穩(wěn)健比分值;X為檢驗數(shù)據(jù);XM為中位值;Norm IQR為標(biāo)準(zhǔn)化四分位距,Norm IQR=0.7413×四分位間距(IQR)。
判定標(biāo)準(zhǔn)為:︱Z︱≤2表示菌液濃度變化不顯著;2<︱Z︱<3時,表示結(jié)果可疑;︱Z︱≥3表示菌液濃度變化顯著。
方法處理過的菌液的毒力測定:將置-80℃凍存過的 C51 -17 菌液稀釋為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12 CFU/mL共12個劑量組,每個劑量組頸部皮下注射家兔2只,每只注射1 mL,注射后觀察10 d。
方法應(yīng)用于疫苗效力檢驗進行MLD測定:用C51-17菌株制備三批氫氧化鋁膠滅活疫苗,每批用兔4只,每只皮下注射疫苗1.0 mL,21 d后與對照兔4只,各皮下注射 C51-17株1MLD,觀察10 d。三批疫苗效力檢驗使用不同批次家兔進行,每次攻毒前均需重新測定C51-17株對此批家兔的MLD。采用菌液分裝置-80℃凍存法測定MLD。
2.1 攻毒菌液最佳處理方法篩選試驗結(jié)果 3種處理方法獲得菌液濃度估值及實值計算方法見表1。
按照與表1相同的方法,每組試驗均重復(fù)5次,結(jié)果見表2。
表1 3種處理方法第一次試驗獲得菌液濃度估值及實值結(jié)果
表2 三種處理方法獲得菌液濃度估值與實值結(jié)果及統(tǒng)計分析
菌液3種處理方法的自由度f均為n1+n2-2=8,經(jīng)查 t值表,臨界值均為 t0.05(8)=2.306 。采用將菌液分裝置-80℃凍存法測定的t值為2.130,小于臨界值2.306,這表明在α=0.05顯著性水平時,菌液濃度估值與實值差異不顯著。采用將菌液置4℃保存過夜法和測定菌液吸光值法測定的t值分別為2.437和2.357,均大于臨界值,這表明在α=0.05顯著性水平時,兩種方法獲得的菌液濃度估值與其實值間差異顯著。僅將此兩種方法相比較,采用測定菌液吸光值法測定的t值較將菌液置4℃保存過夜法與臨界值更為接近,表明采用測定菌液吸光值法較將菌液置4℃保存過夜法更為準(zhǔn)確。
2.2 攻毒菌液最佳處理方法檢定試驗結(jié)果
2.2.1 凍存菌液穩(wěn)定性試驗結(jié)果 菌液凍存時間及活菌計數(shù)結(jié)果見表3,穩(wěn)健統(tǒng)計參數(shù)見表4。
表3 菌液凍存時間及活菌計數(shù)結(jié)果
表4 凍存菌液濃度穩(wěn)健統(tǒng)計參數(shù)
結(jié)果顯示,將菌液等量分裝置-80℃凍存1、5、15、25、35 d 菌液濃度檢驗結(jié)果︱Z︱均≤2,說明菌液凍存35 d內(nèi)濃度變化不顯著。
2.2.2 凍存菌液毒力測定結(jié)果 12個劑量組注射兔在10個觀察日內(nèi)死亡情況見表5,可見,攻毒菌液采用-80℃凍存的方法處理對菌液毒力沒有影響,皮下注射3 CFU可致家兔2/2死亡。
表5 凍存菌液毒力測定結(jié)果
2.2.3 凍存方法應(yīng)用于疫苗效力進行MLD測定檢驗結(jié)果 3批疫苗效力檢驗結(jié)果見表6,結(jié)果表明,采用將攻毒菌液置-80℃凍存的方法進行疫苗的效力檢驗,能確保對照成立,說明在兔多殺性巴氏桿菌病滅活疫苗效力檢驗中可以采用-80℃凍存的方法進行攻毒菌液的預(yù)數(shù)。
表6 疫苗效力檢驗結(jié)果
從采用菌液分裝置-80℃凍存法與將菌液置4℃保存過夜法及測定菌液吸光值法對菌液濃度的估值與其實際濃度的偏差來看,采用菌液分裝置-80℃凍存法估算的菌液濃度與菌液實際濃度最為接近,從而保證用這種方法進行疫苗效力檢驗時,攻擊菌液的劑量與1MLD更為一致,檢驗結(jié)果更能反映疫苗質(zhì)量。兔多殺性巴氏桿菌病滅活疫苗效力檢驗周期一般為31 d,本試驗結(jié)果表明菌液在不添加任何保護劑的情況下置-80℃保存35 d,菌數(shù)變化范圍不超過5%。
為了確保試驗的準(zhǔn)確性,本研究對每組試驗進行了5個重復(fù)。理想狀態(tài)下,菌液濃度估值與實值完全一致,二者之差為0,本研究以此理論值作為標(biāo)準(zhǔn),采用t檢驗分析不同處理方法獲得的菌液濃度估值與實值之差和理論值0之間是否存在顯著差異。t檢驗是數(shù)理統(tǒng)計中一種檢驗平均值的檢驗方法,可用于檢查分析方法或操作過程是否存在較大的系統(tǒng)誤差。而在凍存菌液穩(wěn)定性試驗中,菌液濃度沒有一個標(biāo)準(zhǔn)值,故本研究采用穩(wěn)健統(tǒng)計方法,通過測定Z比分值分析不同凍存時間獲得菌液濃度的離散程度,Z值越低說明不同凍存時間獲得的菌液濃度越接近。
杜立業(yè)等[4]將酒酒球菌加入保護劑稀釋的菌體放入液氮冷凍保存6個月后,菌株存活率仍可達(dá)到99%以上。由于許多從事細(xì)菌類疫苗檢驗的實驗室不具備液氮,因此本試驗嘗試將菌液放置-80℃低溫冰箱保存,結(jié)果表明在檢驗周期內(nèi)菌液濃度變化不大,可以滿足疫苗效力檢驗需要。而且,本試驗沒有在菌液中添加任何保護劑,避免保護劑中的某些成分會對菌液毒力產(chǎn)生影響,或刺激動物出現(xiàn)某種異常反應(yīng)。
從菌液凍存后毒力測定結(jié)果來看,凍存對菌液毒力無影響,采用菌液分裝置-80℃凍存法進行兔多殺性巴氏桿菌病滅活疫苗效力檢驗,可以保證對照組兔全部死亡,檢驗成立。此方法較傳統(tǒng)的將菌液置4℃保存過夜法及測定菌液吸光值法大大減少了工作量,且攻擊劑量更準(zhǔn)確。王麗嬋等[5]將制備的百日咳攻擊菌于液氮中保存,4年中毒力無明顯變化,穩(wěn)定性良好。有液氮保存條件的實驗室可以嘗試將菌液放置液氮中長期保存,每次測毒及攻毒前取出一支融化,稀釋后進行攻擊,如果這種做法對菌株毒力沒有影響,不僅可以進一步簡化檢驗操作,而且可以提升檢驗的準(zhǔn)確性。在今后工作中將繼續(xù)摸索和探討能促使檢驗工作高效準(zhǔn)確的檢驗方法。
[1] 呂惠序,董欽正.兔巴氏桿菌病的防治[J].農(nóng)業(yè)科技通訊,1981,10:35.
[2] 蘭小兵,余長貴.兔巴氏桿菌病的綜合防治研究[C].重慶:第七屆重慶市飼料工業(yè)發(fā)展戰(zhàn)略研討會暨第八屆飼料工業(yè)協(xié)會會員大會論文集,2010.
[3] 魯秀恒,孔憲忱.如何應(yīng)有t檢驗正確評價糧油分析檢驗結(jié)果[J].糧油倉儲科技通訊,1995,(1):37 -40.
[4] 杜立業(yè),王 華,金 剛,等.酒酒球菌液氮超低溫保存[J].微生物學(xué)報,2011,51(9):129 -135.
[5] 王麗嬋,衛(wèi) 辰,張路民,等.百日咳攻擊菌液氮保存毒力穩(wěn)定性的動態(tài)監(jiān)測[J].中國生物制品學(xué)雜志,2012,25(7):118-119.