吳富華，黃建盛，陳桂鑫，鄭雷鳴，徐華當

（廣東海洋大學水產學院，廣東 湛江 524088）

響應曲面法分析溫度與pH對虎斑烏賊受精卵孵化率的聯合效應

吳富華，黃建盛，陳桂鑫，鄭雷鳴，徐華當

（廣東海洋大學水產學院，廣東 湛江 524088）

為探討虎斑烏賊受精卵最佳孵化條件，根據中心復合試驗設計，在單因子試驗基礎上，用響應曲面法分析溫度（24～32℃）與pH（7.0～8.5）對受精卵孵化率的聯合效應，獲得溫度與pH的最佳組合。結果表明：在本試驗條件下，溫度和pH的一次、二次效應及兩者的互作效應對孵化率影響均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；隨著溫度或pH的上升，孵化率呈先升后降的變化趨勢，對數據進行二次多元回歸擬合，得孵化率（Y）對實際自變量溫度（X1）和pH（X2）的二次回歸方程 ?=85.27 - 6.74 X1+ 5.22 X2+ 9.42 X12-12.43 X12- 8.18 X22，回歸方程的相關指數為0.978 6，校正系數為0.963 3，精密度達22.974，可用于預測與分析?；貧w方程優(yōu)化顯示，溫度為27.5℃和pH 7.9時，孵化率最大值為86.46%，模型的可信度高達0.949。驗證結果表明，該組合條件與預測值相符。

虎斑烏賊；溫度；pH；孵化率；響應曲面

虎斑烏賊（Sepia pharaonis）個體大，肉細嫩，味道鮮美，營養(yǎng)豐富，是重要的近岸水產經濟動物。人工種苗培育是發(fā)展虎斑烏賊人工養(yǎng)殖的關鍵。近年來，學者對虎斑烏賊的養(yǎng)殖模式[1]、不同時期骨板生長變化[2]、胚胎耗氧率[3]、視葉谷氨酸表達[4]、胚胎毒性[5]等均有研究。關于生態(tài)因子對虎斑烏賊受精卵孵化的影響，劉建勇等[6]認為其最適孵化溫度范圍為24～30℃，黃建盛等研究表明，其適宜孵化鹽度為27.0～33.0[7]，經中心復合試驗設計及響應曲面法分析，認為在溫度26～28℃、鹽度29～31條件下進行孵化可提高生產效率[8]。

水生動物胚胎發(fā)育過程發(fā)生的一系列生理、生化反應通常需要在適宜的外界環(huán)境條件下進行。水體中的溫度、鹽度、pH、溶解氧及光照等生態(tài)因子對胚胎發(fā)育的正常發(fā)育和是否成功孵化至關重要。溫度對受精卵孵化的影響主要表現為對孵化酶活性的影響[9]，通常是高于適宜溫度會造成酶活性破壞，低于則抑制酶活性。pH是養(yǎng)殖水質檢測的重要指標之一，直接對海洋生物的代謝機能影響，還能通過影響水體的其他理化因子，間接影響海洋生物的生長發(fā)育[3]。關于溫度與 pH對虎斑烏賊受精卵孵化率是否存在交互作用尚未見有報道。本研究中擬通過建立溫度、pH與孵化率之間的回歸模型，研究溫度與pH對虎斑烏賊受精卵孵化率的一次、二次及互作效應，并通過優(yōu)化分析找到溫度與 pH的最佳組合，旨在優(yōu)化孵化條件，建立更為合理與高效的孵化技術體系，為完善其人工孵化技術工藝提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

虎斑烏賊親體來源于2014年3月湛江沿海海域捕獲的野生群體，挑選性腺成熟的親體飼養(yǎng)在湛江硇洲島海上網箱，表層水溫24～27℃，鹽度27～30，pH 7.7～8.1，DO≥6mg/L。每天投喂1次冰鮮雜魚，在網箱飼養(yǎng)條件下親體自然產卵。當日產出的受精卵用薄膜袋充氧運輸回廣東海洋大學魚類增養(yǎng)殖實驗室，挑選處于原腸后期的發(fā)育正常的受精卵用于實驗。

1.2 試驗設計與分組

在實驗設計前先進行溫度與pH的單因子預實驗，獲得虎斑烏賊受精卵適宜的溫度和pH范圍。根據預實驗結果采取中心復合試驗設計和二因素五水平的響應曲面分析方法，因子為溫度（24～32℃）和pH（7.0～8.5），分別以X1和X2表示，響應指標為孵化率，以Y表示。試驗設計見表1，共13個試驗點，其中8個為析因點，5個為中心點，中心點重復5次，以估計誤差[10]。次序隨機，每個試驗組合設置3個平行組。

1.3 試驗方法

試驗在39只裝有30 L過濾自然海水的塑料桶中進行。用1 mol/L的氫氧化鈉或鹽酸調pH分別為7.0、7.2、7.8、8.3及8.5，曝氣3 d待用。用電子恒溫棒（AT-350W，創(chuàng)星電器有限公司）和冰袋調溫度分別為 24.0、25.2、28.0、30.8、32.0℃，溫差±0.1℃，用pH計（PHS-3C型，上海精密儀器儀表有限公司）測定pH。

將受精卵放入直徑30cm、高10cm塑料籃，每籃100粒，懸浮于塑料桶中孵化。孵化過程中連續(xù)充氣，溶氧保持在5mg/L以上，自然光周期，水體鹽度30，每天換水50%，換水前后溫差±0.5℃。每天觀察胚胎發(fā)育，記錄每桶孵出幼體數。以各組最后1粒卵孵化后7 d內不再有幼體孵出為試驗結束時間[11]。

2015年3月和4月分別在同一地方獲得虎斑烏賊受精卵，在最優(yōu)溫度–pH組合條件下進行孵化驗證試驗，孵化方法同上，設置5個重復組。

1.4 響應值測定

響應值即孵化率，是指孵出幼體數與受精卵總數的比值。

1.5 數據處理

結果用平均值±標準差表示。通過最小二乘法擬合因子與響應值之間的二次多項回歸方程為：

式中，?為響應預測，在此響應為孵化率；b0為回歸系數，b1為溫度的一次效應，b2為 pH的一次效應，b3為溫度與pH聯合效應，b4為溫度的二次效應，b5為pH的二次效應。

試驗設計、數據分析和模型建立采用軟件Design Expert（8.0v），并通過軟件進行回歸方程解析以及響應曲面分析，獲得最佳溫度、pH組合。顯著水平為0.05，極顯著水平為0.01。

2 結果與分析

2.1 溫度與pH對虎斑烏賊受精卵孵化率的影響

溫度與pH對虎斑烏賊受精卵孵化率的影響結果見表1。利用Design-Expert軟件對表1數據進行多元回歸擬合，得到二次方程的響應曲面及其等高線（圖1）。由圖1及表1可知，隨著溫度或pH的上升，虎斑烏賊受精卵孵化率呈先上升后下降的變化趨勢，在溫度24～28℃和pH 7.0～7.8范圍內呈上升變化，溫度28～32℃和pH 7.8～8.5范圍內則呈下降趨勢。在本研究條件下，響應曲面形狀較陡，等高線形狀為橢圓形，說明溫度、pH對虎斑烏賊受精卵孵化率有顯著影響，兩因子的交互作用對孵化率有顯著影響。

2.2 模型的建立及其顯著性檢驗

表 1數據經回歸擬合，得孵化率（Y）與溫度（X1）、pH（X2）間的二次多項回歸模型為

方程的相關指數R2=0.978 6，校正系數 R2adj=0.963 3，說明模型可解釋97.86%的響應值變化，僅總變異 2.14%不能解釋；精密度 (Adeq precision)是有效信號與噪聲的比值，大于4.0視為合理，模型中精密度達22.974，說明模型擬合程度良好。

表1 溫度與pH的試驗設計及結果Table1 Experimental design of temperature and pH combinations and results (Mean±SD)

圖1 溫度與pH及其交互作用對虎斑烏賊受精卵孵化率影響的響應曲面和等高線Fig.1 Response of surface plot and its contour plot of the effects of temperature and pH and their mutual interactions on hatchability of Sepia pharaonis embryos

上述回歸模型顯著性檢驗結果（表2）表明，F=63.98，P=0.0001＜0.01，說明回歸模型極顯著；失擬項F=1.13，P=0.437 6＞0.05，說明所建模型有效。因此，可用該模型分析和預測溫度與pH對虎斑烏賊受精卵孵化率影響。模型系數的顯著性檢驗結果（表3）表明，模型95%置信區(qū)間的截距編碼值局限均大于零，說明所建模型有意義；溫度的一次、二次效應及pH的一次、二次效應均對孵化率影響有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），溫度與pH的聯合效應對孵化率影響也有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

表2 溫度與pH對虎斑烏賊受精卵孵化率的回歸模型方差分析Table 2 Analysis of variance for the effect of temperature and pH on hatchability of S.pharaonis embryos

表3 溫度與pH對虎斑烏賊受精卵孵化率的模型回歸方程系數顯著性檢驗Table 3 Test of significance for regression coefficient of model of temperature (X1) and pH (X2) on hatchability of S.pharaonis embryos

2.3 模型優(yōu)化

根據 Deniz的方法[13]對虎斑烏賊受精卵孵化率的回歸模型進行優(yōu)化，結果顯示，孵化率估計最優(yōu)預測的95%置信區(qū)間下限為83.65，上限為89.27，獲得溫度和pH最優(yōu)組合為27.5℃和pH 7.9，在此最優(yōu)條件下，孵化率為86.46%，可信度達到0.949。

2.4 模型驗證

以27.5℃和pH 7.9為條件的驗證結果見表4。由表4可知，2批次受精卵孵化率均接近預測數據，認為響應曲面獲得的最優(yōu)組合數據可靠。

表4 結果驗證Table 4 Results of demonstration test

3 討 論

3.1 溫度對虎斑烏賊受精卵孵化影響

溫度是影響受精卵孵化的重要因素之一。蔣霞敏等[11]研究表明，擬目烏賊（Sepia lycidas）胚胎發(fā)育適宜溫度為21～30℃，最適溫度為24℃，溫度對擬目烏賊胚胎發(fā)育影響顯著（P＜0.05）；劉建勇等[6]研究表明，虎斑烏賊胚胎發(fā)育最適溫度為24～30℃；本研究發(fā)現，在鹽度30、溫度24～28℃條件下，虎斑烏賊受精卵孵化率隨溫度升高而上升，當溫度高于28℃時，孵化率呈下降趨勢。這可能與溫度影響孵化酶活性有關。在適宜溫度條件下，受精卵孵化酶活性較高，細胞內各種生化反應和代謝效率高[14]，因此，孵化速度較快，孵化率較高；但高溫可能抑制孵化酶的活性，長時間的高溫使胚胎內積累的能量過早消耗[15]，導致胚胎無法破膜而出，孵化率降低。王鵬帥等[3]測定不同溫度下虎斑烏賊受精卵期、原腸胚期、器官形成期和內骨骼出現期耗氧率，發(fā)現水溫27℃時耗氧率有高峰值，而胚胎耗氧率通常在最適宜溫度條件下達到峰值。黃建盛等[8]采用中心復合試驗設計及響應曲面法獲得影響其孵化率最佳溫度和鹽度最優(yōu)組合為 27.6℃和31.1，結合本研究結果，認為虎斑烏賊受精卵孵化最適溫度為27～28℃。

3.2 pH對虎斑烏賊受精卵孵化影響

虎斑烏賊屬于卵生水生動物，其受精卵孵化過程受水體pH影響，卵膜對pH有一定調節(jié)能力，在一定范圍內，不會對胚胎發(fā)育造成顯著影響。王鵬帥等[3]測定不同水體 pH條件虎斑烏賊胚胎受精卵期、原腸胚期、器官形成期和內骨骼出現期等 4個發(fā)育時期的耗氧率，發(fā)現pH在7.0～9.0時的耗氧率差異不顯著，認為虎斑烏賊胚胎對水體pH的調節(jié)能力較強。本研究表明，pH 7.0～7.8時孵化率上升，pH 7.8～8.5時則下降，方差分析表明，pH的一次、二次效應對孵化率影響均有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.01），推測其原因是pH變化雖不影響胚胎的新陳代謝，但會影響孵化酶活性，或改變酶與底物的結合，從而影響孵化率，具體原因有待進一步研究。

3.3 溫度與pH對虎斑烏賊受精卵孵化的聯合效應

生態(tài)因子對頭足類胚胎發(fā)育有重要影響[12,16]，更應關注各生態(tài)因子對孵化的交互作用[8]。本研究考察溫度與水體pH對虎斑烏賊受精卵孵化率的交互作用，發(fā)現兩者間存在顯著的聯合效應（P ＜0.05）。近年來，生態(tài)因子聯合效應對水產經濟動物生長發(fā)育影響研究越來越受到重視。如在尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）生長及抗氧化酶活力[17]、尼羅羅非魚飼料利用率[18]、大菱鲆(Scophthalmus maximus)飼料轉化率[19]、菲律賓蛤（Ruditapes philippinarum）仔稚貝生長環(huán)境條件[20]、馬氏珠母貝（Pinctada martensii）受精率及孵化率[21]、尼羅羅非魚性別分化[22]等領域均有發(fā)現生態(tài)因子之間存在聯合效應。Montgomery[23]明確指出，聯合效應比單純主效應更重要，更具有實際意義。

響應曲面法可研究因子與響應值之間、因子與因子之間的相互關系，并優(yōu)化得最佳因子組合[10]。本研究采用響應曲面法建立溫度與pH對孵化率的連續(xù)變量曲面模型，回歸模型均極顯著（P＜0.01），回歸方程決定系數高，失擬項檢驗結果不顯著（P＞0.05），模型中各項效應的估算可靠，說明所建模型有意義，可用于分析與預測。優(yōu)化得影響孵化率最佳溫度和pH最優(yōu)組合27.5℃、7.9，最優(yōu)孵化率為86.46%，可信度達 0.949。驗證試驗結果與預測相近，證明所構建模型可靠。

胚胎孵化前須達到特定發(fā)育階段方可進入孵化進程，然而，僅具備完全成熟的孵化腺細胞并不足以引起孵化，因為完全發(fā)育的胚胎須受內部或外部刺激后方分泌孵化酶[24]。提高虎斑烏賊人工種苗培育效果，還需進一步系統(tǒng)研究水體溶解氧、光照、氨氮等生態(tài)因子影響及因子間聯合影響，以便建立更為合理與高效的孵化技術體系。

[1]蔣霞敏,羅江,彭瑞冰,等.水泥池養(yǎng)殖條件下虎斑烏賊的生長特性 [J].寧波大學學報:理工版,2014,27(2):1-6.

[2]CHUNG M T,WANG C H.Age validation of the growth lamellae in the cuttlebone from cultured Sepia pharaonis at different stages [J].Journal of Experimental Marine Biology Ecology,2013,447:132-137.

[3]王鵬帥,蔣霞敏,阮鵬，等.虎斑烏賊的胚胎耗氧率[J/OL].應用生態(tài)學報,2016,27(7).http://www.cnki.net/kcms/detail/21.1253.q.20160418.1431.022.html

[4]LEE Y H,CHANG Y C,YAN H Y,et al.Early visual experience of background contrast affects the expression of NMDA-like glutamate receptors in the optic lobe of cuttlefish,Sepia pharaonis [J].Journal of Experimental Marine Biology and Ecology,2013,447:86-92.

[5]徐彬曉,劉建勇,譚永勝.甲醛對虎斑烏賊受精卵和幼體的毒性試驗 [J].海洋湖沼通報,2011 (2):86-90.

[6]劉建勇,許光林,簡潤超,等.溫度對虎斑烏賊受精卵孵化及幼體存活的影響[J].廣東海洋大學學報,2010,30(6):87-90.

[7]黃建盛,陳剛,張健東,等.鹽度對虎斑烏賊 (Sepia pharaonis) 受精卵孵化及幼體活力的影響[J].廣東海洋大學學報,2012,32(1):35-38.

[8]黃建盛,陳剛,張健東,等.基于響應面法分析溫度和鹽度對虎斑烏賊受精卵孵化的聯合影響[J].生態(tài)學雜志,2016,35(2):446-452.

[9]王宏田,張培軍.環(huán)境因子對海產魚類受精卵及早期仔魚發(fā)育的影響[J].海洋科學,1998,22(4):50-52.

[10]國蓉,李劍君,國亮,等.采用響應曲面法優(yōu)化甘草飲片中甘草酸的超聲提取工藝[J].西北農林科技大學學報(自然科學版),2006,34(9):187-192.

[11]蔣霞敏,彭瑞冰,羅江,等.溫度對擬目烏賊胚胎發(fā)育及幼體的影響[J].應用生態(tài)學報,2013,24(5):1453-1460.

[12]蔣霞敏,陸珠潤,何海軍,等.幾種生態(tài)因子對曼氏無針烏賊野生和養(yǎng)殖卵孵化的影響[J].應用生態(tài)學報,2010,21(5):1321-1326.

[13]BA? D,BOYACⅠ ? H.Modeling and optimizationⅠ:Usability of response surface methodology[J].Journal of Food Engineering,2007,78(3):836-845.

[14]黃永春,胡石柳,周澤斌,等.鮸狀黃姑魚早期發(fā)育特征及對溫鹽度的適應性 [J].中國海洋大學學報(自然科學版),2006,36(1):101-106.

[15]柳學周,徐永江,馬愛軍,等.溫度、鹽度、光照對半滑舌鰨胚胎發(fā)育的影響及孵化條件調控技術研究[J].海洋水產研究,2004,25(6):1-6.

[16]雷舒涵,吳常文,高天翔,等.金烏賊和曼氏無針烏賊胚胎發(fā)育及其鹽度耐受能力的比較研究[J].中國水產科學,2011,18(2):350-359.

[17]強俊,任洪濤,徐跑,等.溫度與鹽度對吉富品系尼羅羅非魚幼魚生長和肝臟抗氧化酶活力的協同影響[J].應用生態(tài)學報,2012,23(1):255-263.

[18]LⅠKONGWE J S,STECKO T D,STAUFFER J R,et al.Combined effects of water temperature and salinity on growth and feed utilization of juvenile Nile tilapia Oreochromis niloticus (Linneaus) [J].Aquaculture,1996,146(1):37-46.

[19]ⅠMSLAND A K,FOSS A,GUNNARSSON S,et al.The interaction of temperature and salinity on growth and food conversion in juvenile turbot (Scophthalmus maximus) [J].Aquaculture,2001,198(3):353-367.

[20]桑士田,閆喜武,楊鵬,等.菲律賓蛤仔稚貝最適生長環(huán)境條件的響應面法分析[J].水產學報,2012,36(9):1410-1417.

[21]WANG H,ZHU X,WANG Y,et al.Determination of optimum temperature and salinity for fertilization and hatching in the Chinese pearl oyster Pinctada martensii (Dunker) [J].Aquaculture,2012,358:292-297.

[22]王海貞,王輝,強俊,等.溫度、鹽度和 pH 對尼羅羅非魚性別分化的影響[J].應用生態(tài)學報,2012,23(10):2893-2899.

[23]Montgomery D C.Design and analysis of experiments [M].New York:John Wiley & Sons,2008.

[24]樊廷俊,史振平.魚類孵化酶的研究進展及其應用前景[J].海洋湖沼通報,2002(1):48-56.

（責任編輯：劉慶穎）

Combined Effects of Temperature and pH on Hatchability of Fertilized Egg of Sepia pharaonis by Using Response Surface Method

WU Fu-hua,HUANG Jian-sheng,CHEN Gui-xin,ZHENG Lei-ming,XUN Hua-dang
（Fisheries College,Guangdong Ocean University,Zhanjiang,524088,China）

On the basis of one-factor tests and the central composite design (CCD) principle,the method of response surface analysis was adopted to evaluate the combined effects of temperature (24–32℃) and pH (7.0–8.5) on hatchability of Sepia pharaonis.The results showed that the linear and quadratic effects of temperature and pH had a very significant effect on hatchability (P＜0.01).The interactive effect between temperature and pH also had a very significant effect (P＜0.01).Hatchability increased and then decreased as the temperature or pH increased.The model equation of hatchability (Y) towards temperature(X1) and pH (X2) were established as follows:?=85.27–6.74 X1+ 5.22 X2+ 9.42 X12–12.43 X12–8.18 X22(R2=0.978 6; adjusted R2=0.963 3; Adeq precision=22.974).The experimental results indicated that the proposed model was reasonably accurate and can be used for describing and predicting the hatchability.Solving the regression equation for temperature equals to 27.5℃ and pH equals to 7.9,the optimum predicted value for hatchability was 86.46% and the reliability peaked to 0.949.Moreover,since verification result of optimum conditions accorded with the predicted value,it is suggested that the hatching of fertilized egg of S.pharaonis can be improved by rearing at an optimal combination of temperature and pH.

Sepia pharaonis; temperature; pH; hatchability; response surface

S968.3

A

1673-9159（2016）06-0028-05

10.3969/j.issn.1673-9159.2016.06.005

2016-05-30

廣東海洋大學大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（CXXL2014010）

吳富華（1992－），男，研究方向為水產經濟動物養(yǎng)殖。Email：461416433@qq.com

黃建盛，博士，講師，研究方向為水產經濟動物養(yǎng)殖生理生態(tài)學。Email：huangjs@gdou.edu.cn