羅少杰，張鵬飛，焦 鈺，王慶恒,2，杜曉東,2，鄧岳文,2

（1.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524088；2.廣東省珍珠養(yǎng)殖與加工工程技術(shù)研究中心，廣東 湛江 524025）

馬氏珠母貝近交與雜交家系的DNA甲基化多態(tài)性比較

羅少杰1，張鵬飛1，焦 鈺1，王慶恒1,2，杜曉東1,2，鄧岳文1,2

（1.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524088；2.廣東省珍珠養(yǎng)殖與加工工程技術(shù)研究中心，廣東 湛江 524025）

采用甲基化敏感多態(tài)性擴(kuò)增技術(shù)（MSAP）檢測(cè)馬氏珠母貝（Pinctada fucata martensii）近交（F1）與雜交（Z1）家系閉殼肌的 DNA甲基化修飾水平，對(duì)部分甲基化修飾片段進(jìn)行回收、測(cè)序和注釋分析。結(jié)果表明：使用20對(duì)引物進(jìn)行選擴(kuò)增PCR，最終F1和Z1分別獲得（632.20 ± 22.58）和（588.60 ± 25.09）條條帶，差異顯著（P＜0.05）；F1和Z1之間的組織甲基化水平分別為（9.93 ± 1.60）%和（8.04 ± 1.25）%，差異顯著（P＜0.05）。對(duì)回收片段進(jìn)行注釋，F(xiàn)1家系共獲得9條甲基化修飾片段，其中8條為功能蛋白，分別為E3泛素連接酶、逆轉(zhuǎn)錄病毒多聚蛋白、神經(jīng)肽受體、交叉結(jié)點(diǎn)核酸內(nèi)切酶、磷酸糖器、苯丙氨酸解氨酶、隱花色素蛋白、脆性位點(diǎn)相關(guān)蛋白；Z1家系共獲得5條甲基化修飾片段且均為功能蛋白，分別為脆性位點(diǎn)相關(guān)蛋白、神經(jīng)元乙酰膽堿受體α亞基、無(wú)調(diào)性的同源蛋白、麥芽糖酶、甲基胞嘧啶雙加氧酶。初步闡明馬氏珠母貝近交家系F1與雜交家系Z1間的DNA甲基化修飾水平和部分具甲基化修飾位點(diǎn)。

馬氏珠母貝；近交家系；雜交家系；MSAP

在育種學(xué)中，雜交是改良動(dòng)、植物種質(zhì)的重要手段，能使兩個(gè)具不同遺傳背景的親本產(chǎn)生的雜種子一代在生長(zhǎng)勢(shì)、生活力、生殖力、產(chǎn)量和品質(zhì)等方面優(yōu)于雙親或親本的一方，即雜種優(yōu)勢(shì)[1]。目前，越來(lái)越多的研究表明雜種子一代的優(yōu)良性狀表現(xiàn)與基因表達(dá)有直接聯(lián)系[2-3]，而基因表達(dá)又受到諸如基因組 DNA甲基化分布及水平[4]、組蛋白修飾等的協(xié)同調(diào)控。其中，DNA甲基化是真核生物DNA最常見的復(fù)制后調(diào)控方式之一。其由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase，DNMT）起介導(dǎo)作用，以S-腺苷甲硫氨酸（SAM）作為甲基供體，提供硫代蛋氨酸，將甲基轉(zhuǎn)移到其他的化合物上，進(jìn)而隨著DNA甲基化水平的變化而改變DNA穩(wěn)定性、構(gòu)象或染色體結(jié)構(gòu)等，最終達(dá)到調(diào)控基因表達(dá)的目的。此外，Hepburn[5]等指出自交會(huì)導(dǎo)致甲基化水平逐步積累，而雜交則能夠解除基因組的甲基化修飾。這意味著DNA甲基化、基因表達(dá)與雜種優(yōu)勢(shì)的表現(xiàn)間存在著一定的內(nèi)在聯(lián)系。

為深入了解DNA甲基化在生物體內(nèi)的調(diào)控機(jī)制和作用，目前已有多種方法分別從基因到基因組各個(gè)層次對(duì)之進(jìn)行研究。其中Reyna-López[6]在1997年報(bào)道的甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性技術(shù)（Methylation-Sensitive Amplification Polymorphism，MSAP）由于操作簡(jiǎn)便、條帶具高多態(tài)性等優(yōu)點(diǎn)，而成為檢測(cè)基因組DNA甲基化水平的有效手段。其原理是通過一對(duì)對(duì)胞嘧啶甲基化修飾敏感性不同的同裂酶（MspⅠ/Hpa Ⅱ）對(duì)基因組進(jìn)行酶切，通過預(yù)擴(kuò)增、選擴(kuò)增等多個(gè)步驟獲得甲基化敏感多態(tài)性譜帶，而后分析得到組織甲基化水平。目前該技術(shù)已被應(yīng)用于櫛孔扇貝（Chlamys farreri）[7]、太平洋牡蠣（Crassostrea gigas）[8]、尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）[9]、擬南芥（Arabidopsis thaliana）[10]等多個(gè)經(jīng)濟(jì)物種的基因組DNA甲基化研究中。

馬氏珠母貝（Pinctada fucata martensii）又稱合浦珠母貝，是中國(guó)重要的海水珍珠培育貝類之一。由于長(zhǎng)期的近親繁育、累代養(yǎng)殖以及養(yǎng)殖環(huán)境的惡化，導(dǎo)致了珍珠貝出現(xiàn)生長(zhǎng)緩慢、性狀下降等問題，因此通過選育出具抗逆性、高生長(zhǎng)性能的群體是珍珠貝產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的主要出路，但選育背后所隱含的分子機(jī)制尚未清楚。本研究通過分析馬氏珠母貝近交與雜交家系的DNA甲基化水平，同時(shí)對(duì)部分甲基化修飾片段進(jìn)行回收、注釋，以期探明馬氏珠母貝近交家系F1和雜交家系Z1間的DNA甲基化修飾水平和部分具甲基化修飾序列，為馬氏珠母貝遺傳育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)所用的馬氏珠母貝自交和雜交材料構(gòu)建于2012年4月，采用因子設(shè)計(jì)構(gòu)建法，親本來(lái)自于兩個(gè)全同胞家系（A與B）。A1♀ × A2♂構(gòu)成近交家系（F1）；A1♀ x B1♂構(gòu)成雜交家系（Z1）。養(yǎng)殖與管理方法按照常規(guī)技術(shù)在徐聞縣大井村珍珠養(yǎng)殖基地吊養(yǎng)。

在F1和Z1中分別選取20個(gè)大小規(guī)格較為一致的馬氏珠母貝，其中 F1（38.01 ± 7.13）g，Z1（37.52 ± 8.63）g，在清凈的海水中暫養(yǎng)2 d后取樣。MSAP分析使用閉殼肌組織，固定于體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇水溶液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 參照Xiong等[11]和于濤等[7]在玉米、扇貝中等使用的方法分別設(shè)計(jì)接頭引物、預(yù)擴(kuò)增PCR引物、選擴(kuò)增PCR接頭（表1），并在實(shí)驗(yàn)過程中分別對(duì)酶切、連接、預(yù)擴(kuò)增及選擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)體系和條件等進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.2 提取組織DNA及RNA 使用Thermo Fisher Scientific的 DNA提取試劑盒，參照貝類基因組DNA提取法[12]，分別提取F1、Z1個(gè)體閉殼肌組織DNA。挑取高質(zhì)量的DNA，按照每4個(gè)DNA混為一個(gè)樣的原則，將F1、Z1個(gè)體DNA分別混合，而后進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)操作。

1.2.3 MSAP過程 酶切反應(yīng)：分別用 EcoRⅠ + MspⅠ、EcoRⅠ + Hpa Ⅱ?qū)ν粋€(gè)DNA樣品進(jìn)行酶切。EcoRⅠ+ MspⅠ反應(yīng)體系包括0.5 μg DNA，2.5μL CutSmart，1μL EcoRⅠ，1μL MspⅠ，余下體積用滅菌ddH2O補(bǔ)至25μL；EcoRⅠ + Hpa Ⅱ則將上述體系中的MspⅠ替換為Hpa Ⅱ即可。反應(yīng)條件為37℃金屬浴6 h；65℃滅活30min，而后瓊脂糖凝膠檢測(cè)酶切效果。

表1 引物序列Table 1 The Primer sequence

連接反應(yīng)：取等體積接頭引物EcoRⅠ（10 pmol）和MH（100 pmol）充分混合，而后置于94℃變性5min，4℃保存?zhèn)溆?。連接體系包括10μL酶切產(chǎn)物，3μL混合的接頭引物，8μL SolutionⅠ，4μL ddH2O。反應(yīng)條件為16℃，12 h。連接產(chǎn)物稀釋20倍后4℃保存留待預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)使用。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)可分為預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)和選擴(kuò)增反應(yīng)。其中預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系包括5μL連接產(chǎn)物，1μL Pre-EcoRⅠ，1μL Pre-MH，12.5μL PAGE-Mix，5.5μL ddH2O。反應(yīng)條件為94℃，2min；94℃，30 s；52.5℃，30 s；72℃，1min；合計(jì)25個(gè)循環(huán)，72℃，8min。瓊脂糖凝膠檢測(cè)時(shí)，泳道呈現(xiàn)彌散帶則表明反應(yīng)條件合適，將之稀釋20倍后4℃保存。

選擴(kuò)增反應(yīng)體系與預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)一致，反應(yīng)條件為94℃，2min；94℃，30 s；65℃，30 s，72℃，1min；合計(jì)13個(gè)循環(huán)；94℃，30 s；56℃，30 s；72℃，1min；合計(jì)23個(gè)循環(huán)；72℃，8min；4℃保存。瓊脂糖凝膠檢測(cè)時(shí)見泳道中具多條特異性條帶即可使用聚丙烯酰胺凝膠分離選擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.2.4 聚丙烯酰胺凝膠 使用0.06 g/mL的聚丙烯酰胺凝膠分離選擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)選擴(kuò)增產(chǎn)物在泳道上的情況，可將之分為3個(gè)不同類型[13]（圖1）。Ⅰ型為Hpa Ⅱ和MspⅠ泳道均有帶，代表非甲基化（A）；Ⅱ型為Hpa Ⅱ無(wú)帶，MspⅠ有帶，代表全甲基化（B）；Ⅲ型則是Hpa II有帶，Msp I無(wú)帶，代表半甲基化（C）。所有引物擴(kuò)增條帶數(shù)（D）：D=A + B + C；組織甲基水平=[（B+C）/D]；全甲基化水平 =（B/D）；半甲基化水平=（C/D）；非甲基化水平 =（A/D）。

各類型及組織甲基化百分比率均用平均值±方差表示；用t-檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析。

1.2.5 對(duì)特異性的甲基化修飾片段進(jìn)行回收、克隆、測(cè)序、篩選和比對(duì) 回收聚丙烯酰胺凝膠上重復(fù)、清晰，且具特異性修飾（全甲基化修飾或半甲基化修飾）位點(diǎn)，分別加入30μL ddH2O，沸水浴20min，吸取上清后輔以相應(yīng)引物及PCR條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物再次酶切后，仍為明亮單一條帶，則說明 MSAP過程中的酶切反應(yīng)完全，可用pMD-19T連接，DH5α轉(zhuǎn)化，挑取陽(yáng)性單克隆菌落送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，而后通過在線Blast網(wǎng)站和本地Blast程序?qū)y(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析。

2 結(jié)果

2.1 DNA甲基化修飾水平分析

20對(duì)引物擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳后，結(jié)果顯示引物擴(kuò)增效果好，均能獲得譜帶清晰且重復(fù)、甲基化多態(tài)性高的圖譜（圖1）。

圖1 不同個(gè)體的選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物聚丙烯酰胺凝膠檢測(cè)Fig.1 Selective amplification products were detected by agarose gel

自交家系F1和雜交家系Z1產(chǎn)生的甲基化數(shù)據(jù)信息見表2。F1在全甲基化位點(diǎn)數(shù)目和組織甲基化總數(shù)上顯著高于Z1，但二者在半甲基化位點(diǎn)數(shù)目和非甲基化位點(diǎn)數(shù)目上均沒有顯著性差異。

表2 甲基化條帶數(shù)Table 2 The data of DNA methylation

自交家系F1和雜交家系Z1的各類型甲基化位點(diǎn)比例列于表3。F1的全甲基化位點(diǎn)比例和組織甲基化水平均顯著高于雜交家系 Z1，但雜交家系 Z1的非甲基化位點(diǎn)比例卻顯著高于自交家系F1的。自交家系F1和雜交家系Z1在半甲基化位點(diǎn)比例上沒有顯著差異。

表3 各甲基化類型位點(diǎn)在馬氏珠母貝各組織中的比率Table 3 The percentage of DNA methylation type in difference tissues of Pinctada martensii %

2.2 具甲基化修飾片段分析

對(duì)回收片段進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化、測(cè)序及序列比對(duì)，而后使用在線Blast網(wǎng)站和本地Blast程序進(jìn)行同源性比對(duì)：F1共獲得9條具甲基化修飾片段，其中有8條片段能夠在馬氏珠母貝基因組數(shù)據(jù)中找到對(duì)應(yīng)全長(zhǎng)序列。經(jīng)Blastn注釋為E3泛素連接酶、逆轉(zhuǎn)錄病毒多聚蛋白、神經(jīng)肽受體、交叉結(jié)點(diǎn)核酸內(nèi)切酶、磷酸糖器、苯丙氨酸解氨酶、隱花色素蛋白、脆性位點(diǎn)相關(guān)蛋白；Z1共獲得5條甲基化修飾片段，均能在馬氏珠母貝基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中找到對(duì)應(yīng)全長(zhǎng)序列。經(jīng) Blast注釋為脆性位點(diǎn)相關(guān)蛋白、神經(jīng)元乙酰膽堿受體α亞基、無(wú)調(diào)性的同源蛋白、麥芽糖酶、甲基胞嘧啶雙加氧酶。結(jié)合聚丙烯酰胺凝膠，標(biāo)出各個(gè)片段在 F1、Z1所具有的甲基化類型（表4—5）。

表4 F1回收序列比對(duì)結(jié)果Table 4 The results of comparison by Transcriptome

表5 Z1回收序列比對(duì)結(jié)果Table 5 The results of comparison by Transcriptome

結(jié)合表 5、圖2可發(fā)現(xiàn)，盡管Sequence 9和Sequence 10均屬于脆性位點(diǎn)相關(guān)蛋白，但其在F1和Z1中的片段長(zhǎng)度及類型并不一樣，F(xiàn)1中為半甲基化，Z1中為全甲基化。

3 討論

DNA甲基化作為表觀遺傳的重要組成部分，其在基因印跡[14]、染色體的維持[15]、基因表達(dá)[16]等多個(gè)生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用[17]。Xiong等[11]最早使用MSAP技術(shù)分析了水稻的甲基化水平，姜群等[8]通過F-MSAP對(duì)太平洋牡蠣的不同組織的甲基化水平進(jìn)行分析，證明了MSAP檢測(cè)結(jié)果是有效、可靠的。本實(shí)驗(yàn)通過MSAP技術(shù)分析了馬氏珠母貝近交與雜交家系的閉殼肌甲基化水平和模式，近交家系F1的組織甲基化水平顯著高于雜交家系Z1，這與櫛孔扇貝[7]、肉牛[18]、豬[19]等關(guān)于 DNA甲基化與雜交關(guān)系的結(jié)論相似：雜交子代的甲基化水平低于自交子代。通常認(rèn)為自交并沒有改變甲基化率，但雜交在保持大部分甲基化模式穩(wěn)定傳遞的同時(shí)，還進(jìn)行豐富的甲基化和去甲基化變化，并在環(huán)境的參與下形成一個(gè)綜合雙親性狀并生存的狀態(tài)，這正是導(dǎo)致近交、雜交子代的DNA甲基化修飾水平存在差異的主要原因。

研究認(rèn)為雜交子代所具有的雜種優(yōu)勢(shì)可能是組織甲基化水平降低所致[20]。一般來(lái)說，雜種優(yōu)勢(shì)的形成涉及到大量基因的表達(dá)開啟或關(guān)閉、基因間、基因與環(huán)境之間的相互作用，這是一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控過程。在這個(gè)過程中，并非所有的基因的甲基化狀態(tài)都發(fā)生改變，而是以DNA甲基化為主的協(xié)同機(jī)制確定最終的基因表達(dá)。本研究中，兩個(gè)家系共比對(duì)上14條存在DNA甲基化修飾的基因組序列，可以發(fā)現(xiàn)回收序列中有個(gè)別序列的甲基化狀態(tài)并未發(fā)生變化，如泛素連接酶、逆轉(zhuǎn)錄病毒多聚蛋白等；亦有諸如脆性位點(diǎn)相關(guān)蛋白基因，其在自交家系F1中呈現(xiàn)半甲基化修飾，但在Z1中呈現(xiàn)全甲基化修飾，并且其修飾長(zhǎng)度亦不同。一般認(rèn)為雜交是利用現(xiàn)有的基因和性狀進(jìn)行重新組合，將甲基化程度解除或重新編排，而后產(chǎn)生新的基因型和表型[21]；同時(shí)，基因的不同甲基化模式是相對(duì)應(yīng)于不同的轉(zhuǎn)錄水平和功能[22]，進(jìn)而使得基因在表達(dá)的過程中更加穩(wěn)定可控。因此，脆性位點(diǎn)相關(guān)蛋白DNA在雜交過程中被予以新的甲基化狀態(tài)，即全甲基化，推測(cè)這能夠調(diào)控基因表達(dá)，但這還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。Xiong等[11]認(rèn)為在產(chǎn)生雜種優(yōu)勢(shì)的過程中，某些位點(diǎn)的甲基化修飾降低對(duì)雜種優(yōu)勢(shì)有利，某些位點(diǎn)的甲基化修飾增強(qiáng)對(duì)雜種優(yōu)勢(shì)亦有利。熊立仲等[23]利用一套雙列雜交組合的劍葉進(jìn)行研究，也得到相同的結(jié)論?？梢姡珼NA甲基化與雜種優(yōu)勢(shì)并非是單一的線性關(guān)系，可能還有其他的表觀遺傳修飾的協(xié)調(diào)表達(dá)，因此還需要結(jié)合遺傳基礎(chǔ)、基因表達(dá)調(diào)節(jié)等學(xué)科知識(shí)方能最終揭示雜種優(yōu)勢(shì)的生物學(xué)基礎(chǔ)。

據(jù)報(bào)道，水產(chǎn)動(dòng)物的DNA甲基化水平通常在20%～50%左右。尼羅羅非魚[9]為23.74%；背角無(wú)齒蚌[24]鰓組織為 47.9%，唇瓣為 35.5%，閉殼肌為50%，外套膜為 46.3%；櫛孔扇貝、海灣扇貝、蝦夷扇貝、蝦夷扇貝海大金貝[25]分別為 32.08%、25.99%、32.88%和 34.97%等。但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示F1、Z1的組織甲基化水平遠(yuǎn)低于平均，這可能與物種或組織特異性、年齡、環(huán)境差異等有關(guān)。同時(shí)，由于 F1、Z1的全甲基化水平顯著高于半甲基化水平，因此可以判定F1、Z1的甲基化模式主要是CpG型，這與目前多數(shù)水產(chǎn)動(dòng)物的研究結(jié)果類似。

目前，關(guān)于雜種優(yōu)勢(shì)的分子機(jī)制尚未透徹，不能判定馬氏珠母貝的DNA甲基化水平降低就必然產(chǎn)生雜種優(yōu)勢(shì)，它們之間的關(guān)系需要將來(lái)更多的結(jié)果來(lái)佐證。

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（責(zé)任編輯：陳莊）

Comparison of DNA Methylation Polymorphisms BetweenⅠnbred and Hybrid Families of Pinctada fucata martensii

LUO Shao-jie1，ZHANG Peng-fei1，JⅠAO Yu1，WANG Qing-heng1,2，DU Xiao-dong1,2,DENG Yue-wen1,2
（1.Fisheries College,Guangdong Ocean University,Zhanjiang 524088,China; 2.Guangdong Technology Research Center for Pearl Aquaculture and Process,Zhanjiang 524025,China）

Methylation-sensitive amplification polymorphism（MSAP）technology was used to analyze the methylation levels of adductor muscle from the inbred family（F1）and the hybrid family（Z1）of Pinctada fucata martensii.Meanwhile，specific methylation fragments were extracted，sequenced and annotated.The results showed that，（1）（632.2 ± 22.58）and（588.60 ± 25.09）clear and repetitive DNA bands were obtained by using 20 pairs of primers from F1and Z1，respectively.The percentages of methylation levels were（9.93 ± 1.60）% in F1and（8.04 ± 1.25）% in Z1（P＜0.05）.（2）After the specific bands had been extracted and sequenced,nine methylation fragments were obtained from F1,including eight annotated sequences,such as E3 ubiquitin-protein,Retrovirus polyprotein,Neuropeptide F receptor,Crossover junction endonuclease,Sugar phosphate exchanger,Phenylalanine ammonia-lyase,Cryptochrome and Fragile site-associated protein in F1.And five methylation fragments was obtained from Z1，and were annotated as Fragile site-associated protein,Neuronal acetylcholine receptor,Proteinatonal homolog,Maltase-glucoamylase and Methylcytosine dioxygenase.These results are helpful to elucidate the function of methylation inheterosis,providing the theoretical basis for the aquaculture breeding research in pearl oyster P.fucata martensii.

Pinctada fucata martensii; inbred; hybrid; methylation-sensitive amplification polymorphism

S917.4

A

1673-9159（2016）06-0009-07

10.3969/j.issn.1673-9159.2016.06.002

2016-06-14

國(guó)家自然科學(xué)基金(31672626)；廣東省科技計(jì)劃（2015A030302079）；廣東省海洋漁業(yè)局項(xiàng)目（Z2014009）

羅少杰（1991—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)楹Ｑ笊飳W(xué)。E-mail：rogerjoke1@hotmail.com

鄧岳文，男，教授，研究方向?yàn)樨愵愡z傳育種與養(yǎng)殖。E-mail：dengyuewen@sohu.com; Tel：0759-2383346