彭慧湃，趙紅艷，雷 超，王慶恒,，焦 鈺,，李俊輝

（1.廣東海洋大學水產學院，廣東 湛江 524088；2.湖北醫(yī)藥學院基礎學院，湖北 十堰 442000；3.廣東省珍珠養(yǎng)殖與加工工程技術研究中心，廣東 湛江 524088）

馬氏珠母貝細胞周期分裂基因CDC45基因特征、表達量與性狀相關分析

彭慧湃1，趙紅艷2，雷 超1，王慶恒1,3，焦 鈺1,3，李俊輝1

（1.廣東海洋大學水產學院，廣東 湛江 524088；2.湖北醫(yī)藥學院基礎學院，湖北 十堰 442000；3.廣東省珍珠養(yǎng)殖與加工工程技術研究中心，廣東 湛江 524088）

采用RACE技術克隆了馬氏珠母貝細胞周期分裂基因45（Pm-CDC45）全長序列，利用熒光定量PCR檢測該基因在閉殼肌、鰓、性腺與外套膜組織的表達量，并估計基因表達量與金黃殼色第3代選育群體殼高性狀的相關性。結果表明：Pm-CDC45基因序列全長為2 091 bp，5′非編碼區(qū)（5′UTR）為157 bp，3′非編碼區(qū)（3′UTR）為34 bp，其中開放閱讀框為1 967 bp，編碼655個氨基酸；Pm-CDC45在各組織的相對表達量存在顯著差異（P ＜0.05），其中閉殼肌表達量最高，鰓和性腺為其次，外套膜最低；Pm-CDC45基因相對表達量與選育群體殼高性狀與存在顯著的正相關（r=0.531，P＜0.05）；馬氏珠母貝Pm-CDC45為影響殼高性狀基因。

馬氏珠母貝；CDC45基因；基因表達量；殼高性狀；相關分析

細胞周期分裂基因45（cell division cycle gene 45，CDC45）是調控DNA復制起始的一個基因。CDC45在真核生物DNA復制和延伸中發(fā)揮重要功能，在DNA復制時CDC45對于激活起始DNA的復制具有至關重要的作用，CDC45可作為連接復制前復合體，CDC45參與細胞的表達調控，如腫瘤細胞中CDC6、CDC45的表達比正常細胞高[1]。在植物中CDC45基因參與減數分裂染色體的形成與分離及減數分裂細胞周期進程中所需的蛋白水解反應等過程[2]。CDC45基因在細胞周期的S期中都有明顯的變化[3-4]。

馬氏珠母貝Pinctada fuctada martensii是我國生產海水有核珍珠的主要貝類。近年來，由于養(yǎng)殖群體性狀退化及海區(qū)環(huán)境的污染，我國的海水珍珠產量與質量均明顯下滑，2015年我國海水珍珠產量不到4 t[5]。通過遺傳育種培育適合海區(qū)養(yǎng)殖的新品種是解決目前產業(yè)困境的關鍵途徑之一，目前利用家系選擇與群體選擇技術培育了馬氏珠母貝“海優(yōu)1號”與“海選1號”等養(yǎng)殖新品種，這些品種均表現(xiàn)出優(yōu)良育珠性能，在相同養(yǎng)殖條件下與對照群體比較，2齡“海選1號”的殼寬和殼長分別提高 21.2%和 20.8%，育珠期間母貝的留核率、珠層厚度和珍珠產量分別提高22.3%、22.2%和24.7%[6]。

馬氏珠母貝1.5～2.0齡達到性腺成熟，按照常規(guī)育種技術需要8～10 a才能培育一個養(yǎng)殖新品種。借鑒家禽育種實踐，可以通過篩選與性狀緊密連鎖的分子標記輔助育種，能有效縮短育種周期。目前已有馬氏珠母貝分子輔助育種研究報道[7-8]，利用關聯(lián)分析篩選生長性狀緊密連鎖的分子標記，獲得馬氏珠母貝影響生長性狀相關基因?；谇捌诨A，筆者擬研究馬氏珠母貝Pm-CDC45基因序列特征，估計基因表達量與生長性狀的相關性，以期為馬氏珠母貝分子標記輔助育種提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料來源

實驗材料為馬氏珠母貝金黃殼色第3代選育群體，貝齡2齡，殼長4.0～6.0cm，選育群體的構建方法見文獻[9]。

1.2 基因全長克隆

1.2.1 RNA提取和第一鏈 cDNA的合成 采用Trizol法提取總RNA，RNA沉淀用10～25 μL DEPC處理的超純水溶解。NanoDropND1000紫外分光光度計測A260/A280值分析濃度及純度。中間片段 cDNA 模板的合成依據 Reverse Transcriptase M-MLⅤ（RNaseH）說明書進行，模板 制 備 參 照 SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit（Clontech公司）說明書。

1.2.2 引物設計 利用 Primer Premier 5.0設計Pm-CDC45引物。先設計合成中間片段引物，再利用所得中間片段分別設計 5′RACE和 3′RACE巢式引物，用于Pm-CDC45基因的全長克??；同時設計熒光定量引物（表1）。

表1 Pm-CDC45基因克隆及熒光定量的引物序列Table 1 Primer sequence used in the cloning and real-time PCR of Pm-CDC45 gene

1.2.3 Pm-CDC45 基因克隆 利用引物ZJ-F/ZJ-R進行中間片段擴增，10 μL PCR 反應體系：Premix Taq 5 μL，模板cDNA（20ng/模板）0.4 μL，ZJ-F引物 0.4 μL，ZJ-R引物0.4 μL，ddH2O 3.8 μL。PCR反應程序為：94℃預變性 5min；94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸2min，35個循環(huán)；72℃保溫 10min；4℃保存。PCR產物經檢測證實為目的產物大小后，通過 1mg/mL瓊脂糖凝膠電泳回收目的條帶，并將純化產物連接至 pMD18-T載體后轉化至感受態(tài)細胞，于 LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)該感受態(tài)細胞，菌液涂布于LA（含氨芐青霉素Amp+）固體平板并倒置37℃培養(yǎng)，挑取陽性克隆測序即可獲得目的片段序列。

1.2.4 RACE擴增 利用3′RACE的巢式引物依次進行3′末端序列的擴增，PCR擴增體系共10 μL體系：模板cDNA（20ng/擴增）0.4 μL，Taq 5 μL，3′-1/3'-2引物 0.4 μL，Upm 0.4 μL，滅菌ddH2O 3.8 μL。PCR反應程序為：94℃預變性5min；94℃變性 30 s，65.4℃退火30 s，72℃延伸2min，35循環(huán)；72℃保溫10min；4℃保存。5′端擴增利用巢式引物5′-1與5′-2進行5′末端的巢式擴增。

1.2.5 序列分析 根據上述測序結果，將所得序列序拼接，得到基因的cDNA全序列。利用NCBⅠ（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）在線工具，將所得序列應用 BLAST程序進行序列同源性比對和相似性分析；利用NCBⅠ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi）查找開放閱讀框（ORF）的以及氨基酸序列的翻譯；運用 SignalP4.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.0/）在線分析軟件進行信號肽預測；使用NetPhos軟件對氨基酸序列的物理化學性質進行分析；http://www.predictprotein.org/在線預測蛋白質結構。

1.3 基因在組織表達量差異分析

從金黃殼色第3代選育群體取樣10個個體，解剖剪取閉殼肌、外套膜、鰓與性腺組織，放入凍存管，立即放入液氮中保存。利用 Reverse Transcriptase M-MLⅤ（RNaseH）進行反轉錄獲得所需的cDNA模板，然后進行熒光定量PCR檢測。以β-actin作為熒光定量PCR內參。

1.4 基因相對表達量與性狀相關分析

從金黃殼色第3代選育群體取樣個體20個，測量殼高性狀，剪取閉殼肌放入凍存管，并立即放入液氮中保存。利用 Reverse Transcriptase M-MLⅤ（RNaseH）進行反轉錄獲得所需的cDNA模板，然后進行實時熒光定量PCR檢測。

1.5 數據分析

利用單因素方差分析比較各組織基因相對表達量的差異，計算基因相對表達量與殼高性狀的相關性，利用 SPSS15.0軟件進行所有的數據分析，顯著性水平設為0.05。

2 結果與分析

2.1 Pm-CDC45基因全長與序列特征

利用 RACE技術獲得了 Pm-CDC45基因cDNA全序列。該片段全長為2 091 bp，5′非編碼區(qū)（5′UTR）為157 bp，3′非編碼區(qū)（3′UTR）為34 bp，其中開放閱讀框為1 967 bp，編碼655個氨基酸，末端有26個腺嘌呤的ploy A尾巴。

利用 TMHMMServerv.2.0分析發(fā)現(xiàn)該氨基酸發(fā)現(xiàn)不存在跨膜區(qū)。利用NetPhos 2.0預測發(fā)現(xiàn)共有磷酸化位點36個，包括絲氨酸磷酸化位點17個、蘇氨酸磷酸化位點8個和酪氨酸磷酸化位點11個。SoftBerry-Psite程序預測，發(fā)現(xiàn)該氨基酸序列含有N-糖基化位點1個，蛋白激酶C磷酸化位點9個，酪蛋白激酶 Ⅱ磷酸化位點8個，酪氨酸激酶磷酸化位點2個，N-豆蔻酰化位點3個，酰胺化位點1個，6個CAAX box，11個微體C-末端定位信號序列，1個細胞吸附序列（圖1）。

BLAST分析發(fā)現(xiàn)Pm-CDC45基因與其他已知物種的 CDC45基因具有較高的同源性，其Pm-CDC45氨基酸序列與已公布的其他物種的CDC45氨基酸序列的同源性最高達 81%，多序列相似性比較表明 Pm-CDC45是高度保守的（圖2）。

根據不同物種的CDC45氨基酸序列構建的系統(tǒng)進化樹顯示，脊椎動物與無脊椎動物分為兩個不同的分支。 其中，馬氏珠母貝的CDC45與長牡蠣等軟體動物的CDC45親緣關系較近，聚為同一支（圖3）。

2.2 Pm-CDC45組織表達量分析

不同組織 Pm-CDC45相對表達量存在顯著差異（P＜0.05）（圖4）；閉殼?。∕u）與鰓（Gi）基因表達量顯著大于性腺（Go）與外套膜（Ma）（P＜0.05）；閉殼?。∕u）Pm-CDC45相對表達量最高，其次是鰓（Gi）和性腺（Go），外套膜（Ma）中的表達量最低。

圖1 Pm-CDC45基因cDNA序列及其編碼氨基酸序列Fig.1 The full length cDNA and amino acid sequence of Pm-CDC45

圖2 Pm-CDC45氨基酸序列多序列比對Fig.2 Multi-alignment of Pm-CDC45

續(xù)圖2Fig.2（Continued）

圖3 Pm-CDC45蛋白質聚類分析Fig.3 Cluster analysis of Pm-CDC45 protein

圖4 馬氏珠母貝不同組織Pm-CDC45基因表達量差異Fig.4 Relative expression of Pm-CDC45 in the different tissues of Pinctada fuctada martensii

2.3 基因表達量與殼高相關性分析

利用SPSS軟件統(tǒng)計了閉殼肌Pm-CDC45表達量與殼高性狀的相關性，結果表明Pm-CDC45表達量與殼高性狀存在顯著正相關（r=0.531，P=0.016＜0.05）（圖5）。

圖5 馬氏珠母貝Pm-CDC45基因表達量與殼高性狀關系Fig.5 Scatter diagram showing the relationship between shell height and relative expression of Pm-CDC45

3 討 論

高通量測序技術已應用珍珠貝的生長、礦化與免疫基因的篩選與功能驗證。Zhao等[10]利用RNA-seq技術進行馬氏珠母貝珍珠囊轉錄組分析，通過對與Nr和Swissport數據庫進行比對得到結果進行篩選，篩選出了450條與無脊椎動物免疫機制相關的同源序列，103條生物礦化相關的同源序列。為了探究Pm-CDC45在馬氏珠母貝體內的功能，本研究利用熒光定量分析檢測該基因在各組織的表達量，在閉殼肌基因表達量最高，性腺與外套膜的基因表達量相對較少，這說明了Pm-CDC45基因在各組織中具有不同功能。陳偉耀[11]研究了4個生長基因（TβR I、EGFR、GHITM和FGF18）在馬氏珠母貝體內各組織的表達情況，結果表明不同基因在各組織存在明顯差異，TβR I在鰓，足和肝胰腺中表達量最高，EGFR在足和鰓中表達量最高，GHITM在性腺中表達量最高，F(xiàn)GF18在性腺中表達量最高，這4個基因在血細胞表達量均最低。

與連鎖圖譜比較，關聯(lián)分析具有不需構建作圖群體、作圖定位更精確與同時考察一個基因座的多個等位基因等優(yōu)勢[12]，該技術已應用于玉米[13]、水稻[14-15]經濟作物與鴨[16]和豬[17]等畜禽動物數量性狀基因定位研究。近年來，還報道了貝類性狀與標記關聯(lián)分析的研究[8,18-19]，鄧岳文等[19]利用馬氏珠母貝第4代選育群體的生長性狀與50對SSR標記關聯(lián)分析，獲得了與體質量、殼長、殼高與殼寬顯著相關的SSR標記，將篩選標記所對應的Unigene（來自轉錄組數據）在NCBⅠ數據庫中進行Blastx搜索進行功能注釋與驗證；趙紅艷等[8]利用馬氏珠母貝雜交家系的生長性狀和30個SSR標記的關聯(lián)分析，獲得了有7個SSR位點與生長性狀顯著，并利用篩選的SSR序列在NCBⅠ數據庫中進行Blastx搜索，發(fā)現(xiàn)與殼高性狀顯著關聯(lián)的SSR位點序列與海膽細胞分裂控制家族蛋白質 45編碼序列匹配度較高?；诤笳叩难芯拷Y果，本研究利用RACE技術分析了馬氏珠母貝Pm-CDC45的基因結構，表明Pm-CDC45基因表達量與殼高性狀存在顯著正相關，進一步證實Pm-CDC45基因是影響馬氏珠母貝殼高性狀的基因。

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（責任編輯：陳莊）

Molecular Characterization of Cell Division Cycle Gene 45 andⅠts Relationship BetweenⅠts Relative Expression and Growth Traits in Pinctada fuctada martensii

PENG Hui-pai1,ZHAO Hong-yan2,LEⅠ Chao1,WANG Qing-heng1,3,JⅠAO Yu1,3,LⅠ Jun-hui1
(1.Fisheries College，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088,China；2.Hubei University of Medicine，School of Basic Medical Sciences,Shiyan 442000,China；3.Pearl Breeding and Processing Engineering Technology Research Center of Guangdong Province，Zhanjiang 524088,China)

The full length of Pm-CDC45 was obtained by using rapid amplification of cDNA ends technology.Gene expression was detected in adductor muscle，gill，gonad and mantle.Correlation coefficient was estimated between gene expression and shell height of the third generation yellow colored selected line.The results showed that the total length of Pm-CDC45 gene length was 2 091 bp,including 1 967 bp of the open reading frame (ORF) which encodes 655 amino acids,a 5′UTR of 157 bp and a 3′ UTR of 34 bp.There existed significant differences in relative expression of Pm-CDC45 among the four tissues (P＜0.05).The highest gene relative expression was observed in adductor muscle,followed by gill,gonad and mantle.There existed a significantly positive relationship betweengene relative expression and shell height (r=0.531,P＜0.05).The present results suggest that Pm-CDC45 is an important gene that affects shell height in pearl oyster P.fuctada martensii.

Pinctada fuctada martensii；CDC45 gene；gene expression；shell height；relation analysis

S917.4

A

1673-9159（2016）06-0001-08

10.3969/j.issn.1673-9159.2016.06.001

2016-04-15

國家自然基金（31372526）；廣東省科技廳項目（2015A030302079）；廣東海洋大學“海之帆—起航計劃”大學生科技創(chuàng)新項目

彭慧湃（1995—），男，海洋生物專業(yè)2013級本科生。Email:405310372@qq.com

李俊輝（1976—），女，講師，專業(yè)方向無脊椎動物增養(yǎng)殖。Email:lijunh@21cn.com