陳曉敏，劉建勇，張嘉晨，袁瑞鵬，錢佳慧

（廣東海洋大學水產學院，廣東 湛江 524025）

凡納濱對蝦過氧化氫酶基因單核苷酸多態(tài)性及其與耐低溶氧性狀的相關性

陳曉敏，劉建勇，張嘉晨，袁瑞鵬，錢佳慧

（廣東海洋大學水產學院，廣東 湛江 524025）

采用直接測序法研究凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei) 過氧化氫酶（CAT）基因的單核苷酸多態(tài)性（SNP），并分析得到的基因型與凡納濱對蝦低溶氧耐受性狀的關聯(lián)性，尋找與凡納濱對蝦耐低溶氧性狀相關的SNP標記。結果顯示：在CAT基因外顯子1第155堿基處發(fā)現(xiàn)1個SNP位點，為A→G顛換，表現(xiàn)為同義突變。在凡納濱對蝦群體中該位點等位基因A和G的頻率分別為0.146和0.854，多態(tài)信息含量PⅠC值為0.218，屬于低度多態(tài)性，群體在該基因座上符合哈溫（Hardy-Weinberg）平衡(P＞0.05)。關聯(lián)分析表明，CAT基因SNP位點不同基因型與低溶氧耐受性狀關聯(lián)性有統(tǒng)計學意義（χ2=9.277，P=0.002），其中AG 型在應激耐受組中占優(yōu)勢地位（52.17%）。CAT基因多態(tài)性與凡納濱對蝦低溶氧耐受性相關，可作為影響凡納濱對蝦耐低溶氧性狀的候選基因，為凡納濱對蝦選育提供分子遺傳標記。

凡納濱對蝦；過氧化氫酶基因；單核苷酸多態(tài)性；耐低溶氧性狀

凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）也稱南美白對蝦，隸屬于甲殼綱（Crustacea），十足目（Decapoda），對蝦科（Penaeidae），濱對蝦屬（Litopenaeus），為廣溫廣鹽性熱帶蝦類[1]。凡納濱對蝦有生長速度快、抗病能力強、適應高密度養(yǎng)殖等優(yōu)點，是我國主要的對蝦養(yǎng)殖對象[2]。近年來，凡納濱對蝦高密度養(yǎng)殖模式得到廣泛推廣；然而，因受季節(jié)性溫度、鹽度變化、水體生物呼吸代謝、有機物分解腐爛等影響，高密度養(yǎng)殖水體溶解氧（DO）降低，極易出現(xiàn)缺氧現(xiàn)象[3-5]，進而影響對蝦消化力、免疫力，易出現(xiàn)對細菌和病毒的敏感性高、生長緩慢、死亡率高等現(xiàn)象[6-7]。因此，利用遺傳育種技術培育耐低溶氧的凡納濱對蝦新品種尤為重要。

動物遺傳育種時可通過在動物功能基因中尋找一些可靠而有效的遺傳標記來提高育種效率，對動物功能基因多態(tài)性的研究不僅有助于了解功能基因的作用機制，還可獲得與經濟性狀相關聯(lián)的分子遺傳標記，運用于后續(xù)的遺傳育種實踐[8-9]。單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphisms，SNP）是指基因組序列中某一位置上堿基的變異，包括轉換、顛換、插入、缺失等，可發(fā)生在DNA任意位置上[10]。與以擴增片段長度多態(tài)性（AFLP）為代表的第1代分子標記和以簡單重復序列（SSR）為代表的第 2代分子標記相比，SNP作為第3代分子標記，具有數量巨大、分布廣泛、遺傳穩(wěn)定性高、適用于大樣本量檢測分析、與基因功能相關等諸多優(yōu)點，在分子標記輔助育種中應用更為廣泛[11]。而分子標記輔助育種工作的前提是獲得與經濟性狀相關基因的SNP位點[10,12]。在凡納濱對蝦分子標記輔助育種的研究中，不少學者利用SNP分子標記技術篩查到重要功能基因的SNPs。彭敏等[13]研究了2個不同品種凡納濱對蝦AMY基因的SNPs，共發(fā)現(xiàn)9個SNP位點。馬寧等[14]在凡納濱對蝦組織蛋白酶 (CTSL) 基因多態(tài)性研究中，共篩選出20個SNP位點。Zeng等[15]研究了凡納濱對蝦Hsp70基因SNPs與抗病毒特性的相關性，發(fā)現(xiàn)Hsp70基因不同基因型對凡納濱對蝦的抗病性有顯著影響。以上研究多集中于凡納濱對蝦生長、抗病等相關基因的多態(tài)性，未見與凡納濱對蝦耐低溶氧性狀相關基因SNPs的研究報道。

過氧化氫酶 (Catalase，CAT) 在動物抗氧化防御中起關鍵作用，不僅可催化H2O2生成水和氧氣，參與細胞內活性氧代謝，還可增強吞噬細胞的防御能力以及機體的免疫功能，并有效抑制脂質的過氧化作用，保護機體免受損害[16]。筆者采用直接測序法研究凡納濱對蝦低溶氧敏感組和耐受組CAT基因的多態(tài)性，旨在尋找與凡納濱對蝦耐低溶氧性狀相關的SNPs，為凡納濱對蝦遺傳育種提供分子依據。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用對蝦為廣東海洋大學海洋生物研究基地養(yǎng)殖的第4代凡納濱對蝦，運至實驗室暫養(yǎng)7 d以適應環(huán)境。耐低氧實驗在注入60 L經沉淀、消毒自然海水的玻璃纖維桶中進行。隨機挑取規(guī)格[體質量 (11.5±0.92) g ]、活力相同的對蝦48尾，分別設計2個平行組，每組對蝦24尾。因預實驗得對蝦低溶氧脅迫96 h的半致死濃度為0.9mg/L，將海水DO控制在0.80～1.00mg/L，每2 h測1次DO，每6 h統(tǒng)計凡納濱對蝦死亡數，直至脅迫96 h。將經 96 h低溶氧脅迫實驗后死亡蝦歸入低溶氧應激敏感組，存活蝦歸入低溶氧應激耐受組，其中應激敏感組對蝦為25尾，應激耐受組對蝦為23尾。

1.2 基因組DNA提取

依動物基因組DNA抽提試劑盒說明書（上海生工生物公司）提取對蝦基因組DNA，用10mg/mL瓊脂糖凝膠電泳檢測提取結果，用核酸定量儀測定DNA濃度和純度，于–

20

℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 CAT基因的PCR擴增

利用Primer premier 5.0軟件根據GenBank中凡納濱對蝦CAT基因序列（登錄號JX162772.1）設計特異性引物（CAT-F：CCCGATAACCTGACC ACG；CAT-R：TTCCCAATCTCACTGAACAAAG），進行PCR擴增，擴增片段長度為530 bp。反應體系：10×PCR Buffer (Mg2+Plus) 5μL，dNTPs（2.5 mmol/L）5μL，上、下游引物 (10 μmol/L 各4μL，Taq酶 (TaKaRa公司) 0.5 u，基因組DNA模板2μL，補雙蒸水至總體積為 50μL。擴增程序：95℃ 5min；95℃ 30 s，59℃ 30 s，72℃ 1min，40個循環(huán)；72℃ 10min；4℃下保存。

1.4 SNP位點的篩選

隨機挑取低溶氧應激敏感組和應激耐受組各6尾凡納濱對蝦的基因組DNA作為模板進行PCR擴增，PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送往上海生工生物公司進行雙向測序。利用 DNAMan軟件對測序結果進行序列比對，篩選CAT基因的SNP位點。篩查到SNP位點后，擴增其余36尾凡納濱對蝦基因組DNA，測產物序列。通過Chromas軟件查看測序圖譜，通過人工校對判斷每尾凡納濱對蝦SNP位點的基因型，統(tǒng)計低溶氧應激敏感組與耐受組基因型和等位基因的個體數。

1.5 數據統(tǒng)計分析

1.5.1 遺傳多樣性計算 運用POPGENE 32軟件計算SNP位點的基因型和等位基因頻率、預期雜合度He、觀測雜合度Ho、有效等位基因數Ne及Hardy-Weinberg平衡性等遺傳參數。

1.5.2 多態(tài)信息含量 按照 Botetein[17]的計算公式估計SNP位點多態(tài)信息含量。其中，當PⅠC≤0.25時為低度多態(tài)；當0.25＜PⅠC＜0.5為時中度多態(tài)；當PⅠC≥0.5時為高度多態(tài)。

1.5.3 與耐低溶氧性狀相關分析 利用 SPSS 19.0軟件的χ2檢驗分析SNP位點的基因型與低溶氧耐受性之間的相關性，P＜0.05為顯著差異。

2 結果與分析

2.1 凡納濱對蝦CAT基因PCR擴增結果

PCR擴增得約520 bp的特異性條帶，與原設計引物片段長度相符（圖1）。

圖1 CAT基因PCR擴增產物Fig.1 PCR product of CAT gene

2.2 SNPs篩查與CAT基因分型

篩查PCR擴增產物序列，在凡納濱對蝦CAT基因外顯子1第155堿基處發(fā)現(xiàn)1個A→G的點突變。將測序得到的核苷酸序列轉換成氨基酸序列后，發(fā)現(xiàn)該位點的突變并未引起編碼氨基酸的改變，為Gln→Gln同義突變。用Chromas 軟件查看測序圖譜并判斷CAT基因型，單峰為純合基因型，套峰為雜合基因型（圖2）。對兩組實驗對蝦不同基因型的個體數進行統(tǒng)計，并發(fā)現(xiàn)該SNP位點有AG、GG兩種基因型。

圖2 CAT基因PCR產物測序峰Fig.2 SNPs by PCR product sequencing

2.3 CAT基因多態(tài)位點基因頻率及遺傳結構

根據測序結果，檢測低溶解氧應激敏感組和應激耐受組凡納濱對蝦的CAT基因基因型，計算各組該多態(tài)位點的基因型頻率及等位基因頻率，結果見表1。表1可見，AG和GG基因型頻率分別為0.292、0.708，未發(fā)現(xiàn)AA基因型。等位基因A和G的頻率分別為0.146和0.854。AG基因型在應激耐受組中的頻率為0.522，高于GG基因型的頻率，而GG基因型在應激敏感組中的頻率為0.92，占絕對優(yōu)勢。

表1 CAT基因型和等位基因頻率Table 1 Genotypic and allelic frequencies for CAT gene

CAT基因SNP位點的有效等位基因數Ne、預期雜合度He、觀測雜合度 Ho、多態(tài)信息含量 PⅠC及 Hardy-Weinberg平衡性等遺傳多樣性指標見表2。其中，多態(tài)信息含量PⅠC值為0.218，處于低度多態(tài)（PⅠC≤0.25）。Hardy-Weinberg平衡性分析結果表明，在凡納濱對蝦群體中，該突變位點符合哈迪－溫伯格平衡 (HWE) (P＞0.05)。

表2 凡納濱對蝦CAT 基因多態(tài)性分析Table 2 Genetic diversity of CAT gene in Litopenaeus vannamei

2.4 CAT基因多態(tài)性與耐低溶氧性狀的相關性

分析CAT 基因SNP位點的各基因型及等位基因與低溶氧耐受性相關性，結果表明，在g.155A＞G位點中，AG和GG 2種不同基因型的分布與低溶氧耐受性關聯(lián)性有統(tǒng)計學意義（χ2=9.277，P=0.002），其中AG 型在低溶氧耐受組中頻率為52.17%，占優(yōu)勢地位，GG型則在應激敏感組中所占比例大，為92%。2種等位基因A、G也顯示出與低溶氧耐受性的關聯(lián)性（χ2=7.693，P=0.006）。由此可見，CAT基因g.155A＞G位點的多態(tài)性對凡納濱對蝦低溶氧耐受性有極顯著的影響，AG基因型個體低溶氧耐受性能優(yōu)于GG基因型。

3 討 論

3.1 凡納濱對蝦CAT基因的SNP分析

SNP廣泛存在于動植物基因中，多數SNP發(fā)生在基因的非編碼區(qū)。位于編碼區(qū)的SNP又分為兩類：一類是未引起編碼蛋白改變的同義突變，一類是由于突變導致錯誤編碼蛋白質而引起蛋白質功能改變的非同義突變。SNP位點的突變形式包括轉換、顛換、插入、缺失，其中轉換、顛換、發(fā)生的頻率較高[18-19]。本研究中，PCR產物經直接測序，在凡納濱對蝦 CAT基因序列中篩選出一個 SNP位點g.155A＞G，屬于Gln→Gln的同義突變。錢昭英等[20]在凡納濱對蝦組織蛋白酶 CTSL基因的編碼區(qū)中發(fā)現(xiàn)1個為同義突變的SNP位點，經分析該SNP位點對凡納濱對蝦的生長性狀有顯著影響。李春笑等[21]在兔（Leporidae）成纖維細胞生長因子FGF5基因的編碼區(qū)中發(fā)現(xiàn)3個SNP位點，其中有1個位點為同義突變。Lee等[22]和Liao等[23]學者均認為，SNP位點的同義突變并未改變其編碼的氨基酸序列，但堿基改變可能間接影響原基因的功能結構，從而影響基因的選擇性剪切和剪切效率，改變mRNA的折疊，影響mRNA的穩(wěn)定性以及基因的翻譯過程等。因此，可認為凡納濱對蝦CAT基因g.155A＞G位點的同義突變并未改變其編碼的氨基酸，亦未直接影響過氧化氫酶的生理功能，但可能間接影響CAT基因的功能結構，從而影響CAT酶的表達和催化。

3.2 CAT基因SNP位點的遺傳結構

本研究在對CAT基因g.155A＞G位點進行基因型分型時發(fā)現(xiàn)，該位點的SNP分型為AG、GG 2種，且AG和GG的基因型頻率分別是0.292、0.708，并未檢測到AA基因型，可能是由于該實驗選擇的凡納濱對蝦樣本的遺傳多樣性不高。AG基因型在應激耐受組中的頻率為0.522，占優(yōu)勢地位，而GG基因型在應激敏感組中的頻率為0.92，占絕對優(yōu)勢。因此，在凡納濱對蝦選育過程中，理論上凡納濱對蝦CAT基因g.155A＞G位點為AG基因型的個體處于優(yōu)勢地位，而GG基因型的則處于劣勢地位。

遺傳多樣性高低直接反映物種的進化趨勢以及對環(huán)境的適應能力，遺傳多樣性越豐富則越有利于選擇育種。本研究顯示，凡納濱對蝦 CAT基因g.155A＞G位點的預期雜合度和觀測雜合度均小于0.05，表明該凡納濱對蝦群體CAT基因的變異程度較小，潛在選擇能力較低；多態(tài)信息含量PⅠC值小于 0.25，處在低度多態(tài)，表明等位基因片段多態(tài)性以及基因突變變異程度均較低。因此，可判斷該凡納濱對蝦群體的CAT基因的遺傳多樣性較小，選擇潛力較低，處在較穩(wěn)定的遺傳狀態(tài)。

3.3 與耐低溶氧性狀的關聯(lián)分析

在動物遺傳育種過程中，通過SNP標記選擇某些有重要生理功能的基因作為候選研究對象，探尋基因多態(tài)性與重要經濟性狀間的關系，以找到影響經濟性狀的主效基因或與主效基因緊密連鎖的其他候選基因，獲得與經濟性狀相關的有效分子遺傳標記，并運用于后續(xù)的遺傳育種實踐，以提高育種效率[25-26]。吉富羅非魚（Oreochromis niloticus）肌細胞生長抑制素MSTN基因中存在1個與魚體型顯著相關的 SNP位點[26]。凡納濱對蝦的蘭尼定受體基因中存在1個與溫度變化敏感性相關的SNP 位點[27]。本研究首次對凡納濱對蝦CAT基因進行SNP位點篩查，發(fā)現(xiàn)1個與耐低溶氧性狀顯著相關的多態(tài)位點g.155A＞G，該SNP位點AG基因型的個體較GG基因型低溶氧耐受性高，表明A基因為凡納濱對蝦耐低溶氧性狀的增效基因。因此，可推測CAT基因是影響凡納濱對蝦低溶氧耐受性潛在的主效基因或與主效基因連鎖的有效基因，可作為低溶氧耐受性狀的候選遺傳標記，應用于凡納濱對蝦的良種選育。

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（責任編輯：劉慶穎）

Single Nucleotide Polymorphisms in Catalase Gene and Their Association with Resistant Hypoxia Traits in Litopenaeus vannamei

CHEN Xiao-min,LⅠU Jian-yong,ZHANG Jia-chen,YUAN Rui-peng,QⅠAN Jia-hui
（Fisheries College,Guangdong Ocean University,Zhanjiang 524025,China）

The single nucleotide polymorphisms (SNP) in catalase (CAT) gene was studied between hypoxia resistant group and susceptible group of Litopenaeus vannamei by using direct sequencing technique,and the association between the polymorphisms and hypoxia tolerance traits was analyzed so as to find the SNP sites and provide the molecular basis for the genetic breeding of L.vannamei.The result shows that a SNP site is found in 155 bp of catalase gene,which is A/G transversion and synonymous with mutation.Ⅰn this population,allele frequency of A and G is 0.146 and 0.854,respectively.The SNP polymorphic information content (PⅠC) is 0.218,which in a low degree of polymorphism (PⅠC＜0.25),and the genotypes distribution fitted to the Hardy-Weinberg equilibrium (P＞ 0.05).The correlation between different genotypes and hypoxia tolerance traits of L.vannamei is analyzed by chi-square test.The results indicate that the genotypes of intron 1 are significantly associated with the hypoxia tolerance traits (χ2=9.277,P＜0.01).Among them,the AG genotype is dominant in the hypoxia tolerance (52.17%).Ⅰt is suggested that the CAT gene should be one of the candidates which significantly affect the hypoxia tolerance of L.vannamei,and can be used as themolecular genetic markers applying for L.vannamei breeding.

Litopenaeus vannamei; catalase gene; single nucleotide polymorphisms; hypoxia tolerance

Q78；Q959.223+.63

A

1673-9159（2016）06-0016-05

10.3969/j.issn.1673-9159.2016.06.003

2016-05-23

廣東省海洋漁業(yè)科技推廣專項科技攻關與研發(fā)項目（A201208B05）

陳曉敏（1990－），女，碩士研究生，研究方向為水產動物遺傳育種。E-mail:584917129@qq.com

劉建勇（1970－），男，博士，教授，研究方向為水產動物遺傳育種。E-mail:liujy70@126.com