林碧璇何惠芳吳蔚苗

（1.佛山市順德區(qū)第一人民醫(yī)院藥劑科佛山528300；2.佛山市順德區(qū)中醫(yī)院藥劑科佛山528300）

中藥制劑中農(nóng)藥高通量監(jiān)測的技術(shù)研究△

林碧璇1何惠芳1吳蔚苗2

（1.佛山市順德區(qū)第一人民醫(yī)院藥劑科佛山528300；2.佛山市順德區(qū)中醫(yī)院藥劑科佛山528300）

本文基于2015版《中國藥典》（通則2341）中就農(nóng)藥殘留量測定法的要求，分析美、日、歐洲等國外藥典中對植物藥農(nóng)藥殘留量的限量規(guī)定，提出實現(xiàn)中藥制劑農(nóng)殘高通量篩查必要性的同時，聚焦“樣品前處理”與“檢測手段選擇”關(guān)鍵技術(shù)研究進展，為快速、靈敏、簡便的中藥制劑農(nóng)殘分析平臺的建立提供參考。

中藥制劑 農(nóng)藥殘留 高通量分析

隨著中成藥需求的日益增長，野生藥材資源告急，采用人工種植的藥材已成為中藥制劑原料的重要來源。盡管國家藥品監(jiān)督管理局制定了中藥材生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（GAP），對中藥材生產(chǎn)基地的選定、品種栽培、采收加工、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)作出了規(guī)定，但在實施過程中，部分種植戶為防止病、蟲、草害不合理噴用農(nóng)藥，或在藥材加工、儲存過程中不科學(xué)施用農(nóng)藥的現(xiàn)象常有發(fā)生。過度用藥后殘留的有機農(nóng)藥很可能通過中草藥經(jīng)加工積蓄到由其制成的中成藥，對藥品使用者的健康造成威脅?？梢?，中藥材與中藥制劑的農(nóng)藥殘留問題已成為我國藥物安全性評價系統(tǒng)中迫切需要解決的難題。

在全球中草藥市場中，農(nóng)藥殘留問題是我國中藥出口的瓶頸之一，使其銷售量仍然處于低端徘徊狀態(tài)[1]，2015版《中國藥典》對中藥農(nóng)藥殘留的規(guī)定遠遠低于歐美發(fā)達國家的標(biāo)準(zhǔn)。為此，筆者擬對我國藥典與美、日、歐洲等國外標(biāo)準(zhǔn)中關(guān)于植物藥農(nóng)藥殘留量的限量規(guī)定進行對比分析，并就中成藥農(nóng)藥殘留分析過程中的核心環(huán)節(jié)——“樣品前處理”與“檢測手段選擇”的研究現(xiàn)狀作一綜述，旨在為建立快速、靈敏、簡便的中藥制劑中農(nóng)藥多殘留高通量篩查平臺提供參考。

1　國內(nèi)外施行標(biāo)準(zhǔn)差異

市售有機農(nóng)藥按化學(xué)結(jié)構(gòu)分類，主要為有機氯類、有機磷類、氨基甲酸酯類以及擬除蟲菊酯類[1，2]。其中有機氯類農(nóng)藥化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，禁用多年后仍可在水域、土壤內(nèi)測出較高的殘留量，由外界環(huán)境的殘留引起的植物體內(nèi)蓄積，很可能引起中藥制劑不同程度的污染。有報道[3，4]參照藥典9種有機氯類農(nóng)藥殘留量測定法評價臨床常用的幾種成藥制劑的安全性，結(jié)果部分樣品檢出含有六六六與滴滴涕，所幸其殘留量低于0.01mg/kg。亦有報道[1，5]檢出部分中藥制劑中含有有機磷、擬除蟲菊酯類農(nóng)藥。

2015版《中國藥典》僅對人參（人參莖葉總皂苷、人參總皂苷）、甘草、西洋參、黃芪藥材品種中有機氯類農(nóng)藥殘留量有所規(guī)定，未涉及中藥制劑中農(nóng)藥殘留量的測定，標(biāo)準(zhǔn)相對滯后[6]。盡管藥典四部“通則2341農(nóng)藥殘留量測定法”中除常用的第一法（9種有機氯類農(nóng)藥殘留量測定法、22種有機磷類農(nóng)藥殘留量測定法）外，尚有第二法（機磷類農(nóng)藥殘留量測定法-色譜法）、第三法（擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留量測定法-色譜法）與第四法（農(nóng)藥多殘留量測定法-質(zhì)譜法）的表述[7]，但在藥典一部中成藥制劑下的檢查項未有農(nóng)藥殘留量的限量要求。相比之下，其他國家與地區(qū)已對植物藥和植物提取物的農(nóng)藥殘留有嚴格的規(guī)定。

香港中成藥注冊安全性資料技術(shù)指引把艾氏劑、狄氏劑、氯丹等9類20種有機氯類農(nóng)藥殘留列為中成藥安全性的必檢項目[8]。歐洲藥典與美國藥典為目前規(guī)定植物藥的農(nóng)藥殘留限量品種較為全面的藥典，除有機氯類農(nóng)藥還規(guī)定了有機磷類農(nóng)藥限量，涉及70余種農(nóng)藥[9]。除品種涉及面較我國藥典廣泛外，上述標(biāo)準(zhǔn)收載的方法具有較強的適用性與嚴謹性[10]：樣品前處理包括凝膠滲透色譜法GPC+固相萃取小柱（SPE）、混合固相萃取小柱（SPE）法或磺化反應(yīng)法，適用于多種農(nóng)藥的檢測；為防止實驗中外源性污染，對溶劑、試劑、玻璃器皿洗滌等作出規(guī)定，對最低檢測限、加樣回收率等有所要求；若出現(xiàn)陽性結(jié)果，要求使用不同極性的毛細管氣相色譜柱或GC-MS聯(lián)用進行驗證。顯然，我國藥典對中成藥的農(nóng)藥殘留限量暫無一品種要求的現(xiàn)狀，滯后于國際上對天然藥物中農(nóng)藥殘留的規(guī)定，建立快速、靈敏、全面的中藥制劑農(nóng)藥多殘留分析平臺已迫在眉睫。

2　分析技術(shù)現(xiàn)狀

中藥制劑所含化學(xué)成分復(fù)雜，涵蓋黃酮、生物堿、萜類、色素、油脂等，劑型復(fù)雜，而制劑中的農(nóng)藥殘留量屬痕量級（ng～pg級），使農(nóng)藥的提取、凈化難度較高，檢測方式選擇更為復(fù)雜。過去的學(xué)者們就樣品的前處理與檢測手段的選擇兩大關(guān)鍵技術(shù)積累了豐富的工作經(jīng)驗。

2.1樣品前處理技術(shù)：目前在農(nóng)殘分析中應(yīng)用較為廣泛的提取凈化方法為QuEChERS法、儀器提取法（超臨界流體萃取、加速溶劑萃取、微波萃?。?、吸附提取法（固相萃取、固相微萃取、基質(zhì)固相分散）、凝膠滲透色譜等，并逐步向免疫親和色譜、分子印跡技術(shù)等操作簡便、環(huán)境污染小的新型技術(shù)發(fā)展。

QuEChERS法集樣品萃取、凈化為一體，適合大批量樣品的分析，Xu R等[11]采用改良的QuEChERS法完成80種中草藥中15種有機氯農(nóng)藥殘留的樣品前處理，但此法去除色素及中弱極性干擾物的能力不甚理想[12]。通過柱凈化處理亦為一研究熱點，劉曉霞等[1]對比活性炭吸附+乙酸乙酯超聲提取、有機溶劑超聲提取+柱凈化處理，結(jié)果后者可除去大量雜質(zhì)；有報道[13，14]采用凝膠滲透色譜（GPC）凈化-毛細管氣相色譜完成仙靈骨葆膠囊、化痔栓中20種有機氯農(nóng)藥的測定；但此類SPE和離線GPC在進行多樣品凈化時，存在溶劑消耗量大、操作煩瑣、制樣時間長等局限性[15]。較為經(jīng)典的磺化反應(yīng)法，對樣品中的色素、油脂類干擾物質(zhì)凈化效果明顯，但不適用于對酸不穩(wěn)定的狄氏劑、異狄氏劑、五氯苯胺等農(nóng)藥測定。

針對不同提取凈化手段的屬性，Huang ZQ等[16]聯(lián)合凝膠滲透色譜與固相萃取凈化樣品，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用進行測定，成功建立了茶葉中102種農(nóng)藥殘留的檢測方法。本例的成功得益于前處理技術(shù)的優(yōu)勢互補與檢測手段的日漸成熟，提示同時測定多種農(nóng)藥殘留成為可能，該思路拓展到藥材、制劑等對象的農(nóng)藥多殘留分析，更是中藥安全性評價系統(tǒng)往后發(fā)展的重要風(fēng)向標(biāo)。

2.2樣品檢測技術(shù)：隨著農(nóng)藥殘留前處理方法的逐漸成熟，檢測技術(shù)手段多種多樣?，F(xiàn)較常用的方法有氣相色譜法、氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)、高效液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)、毛細管電泳法、免疫分析法和生物傳感器技術(shù)等。

2.2.1氣相色譜法與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)：在眾多的檢測手段中，氣相色譜法在實際農(nóng)殘檢測中使用最多，相關(guān)文獻資源豐富[4，8，17]主要適用于相對分子量小、沸點低、熱穩(wěn)定性較好的農(nóng)藥品種，其檢測器主要分為電子捕獲檢測器（ECD）、氮磷檢測器（NPD）與火焰光度檢測器（FPD）：ECD用于高電負性農(nóng)藥如擬除蟲菊酯類、有機氯類農(nóng)藥的檢測[18]；NPD用于氨基甲酸酯類和有機磷類農(nóng)藥殘留的檢測[19]；FPD為含磷、硫類化合物的特異性檢測器，用于有機磷類農(nóng)藥殘留的檢測[20]。盡管氣相色譜法的不同檢測器可滿足不同性質(zhì)的農(nóng)藥檢測，但存在：①FPD、NPD檢測器專屬性較強，只能檢測某一特定種類的農(nóng)藥；②進行復(fù)雜樣品測定時易受到背景噪音和雜質(zhì)的干擾；③多成分測定時分離度較差等問題。

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)彌補了氣相色譜法檢測器的缺陷，質(zhì)譜檢測器屬通用性檢測器，可通過選擇監(jiān)測離子模式降低背景噪音與雜質(zhì)干擾從而提高靈敏度，適用于中藥制劑中農(nóng)藥多殘留分析，可同時完成不同類別的百余種農(nóng)藥殘留的快速掃描、定性定量。郭青等[21]對比GC-ECD和GC-MS法測定甘草鋅顆粒及復(fù)心片中二十種有機氯農(nóng)藥，結(jié)果顯示GC-ECD在痕量分析時易受假陽性及背景干擾。謝耀軒等[22]采用GC-MS法完成安宮降壓丸、喉必清膠囊、消石靈膠囊等12種香港中成藥的20種有機氯農(nóng)藥殘留的分析。

2.2.2液相色譜法與液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)：高效液相色譜法配置紫外可見光光度檢測器、熒光檢測器、二級管陣列檢測器等檢測器后，適用于氣相色譜難以測定的沸點高、熱不穩(wěn)定的農(nóng)藥檢測[23]。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用較液相色譜法的優(yōu)勢與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用雷同，可完成大分子量的成分檢測，其種類涉及有機磷、氨基甲酸酯、擬除蟲菊酯、苯并咪唑、三唑類等[24，25]。

2.2.3其他：在農(nóng)藥殘留分析中，采用毛細管電泳技術(shù)、超臨界流體色譜-檢測器聯(lián)用、免疫分析法、生物傳感器法檢測手段的文獻報道相對較少。毛細管電泳技術(shù)具有分析速度快、選擇性強、溶劑和試樣用量極少的特點；超臨界流體色譜-檢測器聯(lián)用應(yīng)用于沸點低、熱不穩(wěn)定的農(nóng)藥檢測；免疫分析法與生物傳感器法操作簡單、特異性強，在農(nóng)藥殘留分析領(lǐng)域具有良好的發(fā)展前景。

3　結(jié)語

針對全世界農(nóng)藥使用量迅猛增長的態(tài)勢，日、韓、美等國已日漸加強天然藥物開發(fā)的法制化工作，對植物藥中農(nóng)藥殘留的法律法規(guī)規(guī)定監(jiān)測的農(nóng)藥殘留品種和有關(guān)國家藥典中的農(nóng)藥規(guī)定較為完善。而我國現(xiàn)行藥典僅對人參（人參莖葉總皂苷、人參總皂苷）、甘草、西洋參、黃芪藥材品種中有機氯類農(nóng)藥殘留量有所規(guī)定，未涉及中成藥品種的規(guī)定，標(biāo)準(zhǔn)相對滯后。為此，筆者基于學(xué)者們在中成藥農(nóng)殘分析的文獻材料，就中藥制劑的農(nóng)藥高通量監(jiān)測系統(tǒng)提出拙見：①參照2015版《中國藥典》“通則2341農(nóng)藥殘留量測定法”中第四法“農(nóng)藥多殘留量測定法-質(zhì)譜法”與農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中蔬菜水果農(nóng)藥多殘留監(jiān)測方法，嘗試建立臨床常用、服用療程長的中成藥中多種農(nóng)藥同時測定的方法；②根據(jù)成藥不同劑型中基質(zhì)、輔料的干擾，對高通量監(jiān)測方法進行適當(dāng)?shù)膬?yōu)化；③參考《殘留分析質(zhì)量控制指南》對實驗細節(jié)進一步規(guī)范，如實驗試劑的純度、玻璃器皿的洗滌方法、農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品儲備液的存放條件、陽性結(jié)果用以驗證的色譜柱類型等；④重視中藥制劑原料的溯源，登記藥材的農(nóng)藥使用情況，尤其關(guān)注其他地區(qū)和國家規(guī)定的農(nóng)藥品種；⑤重視藥品技術(shù)人員樣品提取、凈化、分析等操作的規(guī)范化。隨著人們對中藥制劑用藥安全性的關(guān)注日漸升溫，中成藥農(nóng)藥殘留問題的解決迫在眉睫，建立快速、靈敏、簡便的中藥制劑中多種農(nóng)殘高通量監(jiān)測平臺具有現(xiàn)實意義，保障患者用藥安全的同時利于出口產(chǎn)品與國際標(biāo)準(zhǔn)的接軌。

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R284.1

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1672-8351（2016）10-0156-02

△佛山市科技局立項科研課題編號：（2014AB002333），項目名稱：中藥制劑中農(nóng)藥殘留的檢測技術(shù)研究。