周麗彬　周劍濤　丁海峰

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低密度粒細胞在自身免疫性疾病中的病理生理作用

周麗彬1周劍濤2★丁海峰2

［摘要］疾病期增強活化異常的中性粒細胞可能導致組織損傷和異常免疫應答。最近報道了一種中性粒細胞亞群，即從系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）患者的外周血單核細胞部分分離出的低密度粒細胞（low-density granulocytes，LDGs）。LDGs的表型和功能不同于循環(huán)中性粒細胞，其具有促炎性和致病性功能，包括內(nèi)皮細胞毒性和合成干擾素-I的能力。此外，LDGs容易形成中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)（low-density granulocytes，NETs），NETs促進自身抗原外顯與器官損傷。闡明LDGs的的致病作用，有可能為SLE和其他自身免疫性疾病設(shè)計新的治療策略。

［關(guān)鍵詞］低密度粒細胞；中性粒細胞；自身免疫性疾?。恢行粤＜毎庹T捕網(wǎng)；I型干擾素

作者單位：1．湖北省羅田縣皮膚病醫(yī)院檢驗科，湖北，羅田438600

2．黃岡職業(yè)技術(shù)學院醫(yī)藥衛(wèi)生學院，湖北，黃岡438000

注：周麗彬和周劍濤為并列第一作者

1986年，Hacbarth等［1］首先采用Ficoll-Hypaque密度梯度制備技術(shù)，從系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）成人患者的外周血單核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）制備物中發(fā)現(xiàn)“低浮力密度粒細胞”（low buoyant density granulocytes），這種低浮力密度粒細胞與SLE病情活動性相關(guān)。2003年，Bennett等［2］對SLE小兒患者的PBMCs進行微陣列分析，發(fā)現(xiàn)其高度表達中性粒細胞特異性基因，并認為該現(xiàn)象是患者PBMCs部分所存在的未成熟中性粒細胞表達的結(jié)果。2008年，Nakou等［3］分析SLE成人患者骨髓基因微陣列，證實上調(diào)粒細胞生成基因與疾病活動性有關(guān)，其中幾個上調(diào)基因出現(xiàn)在中性粒細胞早期發(fā)育階段。2010年，Denny等［4］采用負性選擇技術(shù)從SLE患者PBMCs得到高純化的低密度中性粒細胞，并將此稱之為“低密度粒細胞”（low density granulocytes，LDGs）。本文圍繞SLE闡述LDGs的形態(tài)學與病理生理特征。

1　從PBMCs中分辨LDGs

研究者最初在SLE成人患者血液中證實LDGs的存在［1］。目前已知人、鼠和豬的血液中能分離出LDGs［5］?；趩魏思毎椭行粤＜毎磉_標記物分化抗原簇（cluster of differentiation，CD）14與CD15的差異，采用流式細胞分析技術(shù)［4］，可從PBMCs中分辨單核細胞和LDGs。單核細胞為CD14＋／CD15lo（“l(fā)o”表示“低”），而LDGs為CD14lo／CD15＋。有學者通過CD14／CD15標志物，檢測了SLE患者PBMCs中LDGs水平［4］。65份SLE樣本中，12份（19%，12／65）SLE患者PBMCs的LDGs 占PBMCs總數(shù)的25%以上，并發(fā)現(xiàn)LDGs水平升高的SLE患者伴有皮膚并發(fā)癥（包括血管炎）和／或滑膜炎。相比之下，其PBMCs譜與健康對照組相當?shù)腟LE患者沒有觀察到這些臨床并發(fā)癥。不僅SLE患者的PBMCs中能分離出CD15＋中性粒細胞，在創(chuàng)傷［6］、人類免疫缺陷病毒感染［7］、內(nèi)臟型利什曼蟲?。?］、類風濕關(guān)節(jié)炎［9］、牛皮癬［10］、癌癥［11］和正常妊娠期［12］的PBMCs中也能分離出CD15＋中性粒細胞。

除了CD14／CD15標志物，還可以基于單核細胞表達主要組織相容性復合體Ⅱ（major histocompatibility complexⅡ，MHCⅡ）和輔刺激分子CD86，而不表達膜肽酶CD10進一步分辨出LDGs。相比之下，LDGs表達CD10，但缺乏MHCⅡ和CD86。分析CD86／CD16顯示幾種亞群。大多數(shù)健康對照單核細胞顯示CD86＋CD16－靜止表型，SLE單核細胞顯示CD86＋CD16＋激活表型，而LDGs顯示CD16hi／CD86－（“hi”表示“高”）［4］。

2　LDGs的形態(tài)學特征

獨特的多形核與粒細胞顆粒是中性粒細胞的2個典型形態(tài)學特征。中性粒細胞在發(fā)育成熟期獲得細胞顆粒物，存在于細胞顆粒內(nèi)的各種蛋白質(zhì)合成時限不同，根據(jù)細胞分化的特定階段形成具有不同肽類的不同細胞顆粒。在原始粒細胞發(fā)育至核分葉階段，中性粒細胞的細胞顆粒異質(zhì)性增加。正常情況下，未端分化的中性粒細胞才從骨髓釋放。

在Ficoll密度梯度分離程序中，成熟中性粒細胞與紅細胞位于同一沉降區(qū)，而LDGs則位于PMBCs沉降區(qū)。采用鑒別染色法觀察LDGs的細胞核形態(tài)［2］，顯示出分葉狀、帶狀或者中幼粒細胞樣細胞特征。使用透射電子顯微鏡觀察純化的SLE-LDG超微結(jié)構(gòu)特征［5］，結(jié)果顯示LDGs相對于正常密度中性粒細胞分葉核更少，清晰地顯現(xiàn)出稠密的異染色質(zhì)與去致密的常染色質(zhì)，在其細胞質(zhì)中可識別出各種細胞顆粒。超微結(jié)構(gòu)分析，細胞核形態(tài)表現(xiàn)為更大程度的未成熟狀態(tài)，如帶狀／幼稚形。這些觀察證明：（1）LDGs并不是已釋放出顆粒的激活態(tài)中性粒細胞的亞群；（2）LDGs的細胞質(zhì)未經(jīng)歷液泡化或者細胞凋亡。LDGs的發(fā)育狀態(tài)及其形成機制目前尚不十分清楚。

3　LDGs的病理生理作用

3．1LDGs的促炎作用

中性粒細胞作為第一線免疫細胞，除了吞噬作用和脫粒作用之外，還具有另一種抗微生物機制，即釋放細胞外誘捕網(wǎng)（neutrophil extracellular traps，NETs）用以捕獲與殺滅入侵的病原體。NETs是中性粒細胞DNA與組蛋白、細胞質(zhì)內(nèi)顆粒（源性）蛋白質(zhì)形成的胞外網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，形成NETs的過程是一種細胞死亡通路［13］。中性粒細胞釋放NETs的死亡通路被描述為“NETosis”。Villanueva報道［14］，SLE患者的致敏中性粒細胞形成NETs，特別是LDGs形成NETs的能力顯著增強。在感染部位募集的中性粒細胞通過脫粒作用和／或NETosis釋放出蛋白酶，以及合成促炎細胞因子和類花生酸類。中性粒細胞在粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子作用下有能力合成各種炎性因子mRNAs，包括腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）mRNA。LDGs分泌TNF-α的水平高于正常密度中性粒細胞［4］。在未激活狀態(tài)，LDGs、SLE正常密度中性粒細胞（SLE組）與正常密度中性粒細胞對照組（Control組）的TNF-α實驗測定值［平均熒光強度（mean fluorescence intensity，MFI）±標準平均誤差（standard error of mean，SEM）］分別為70±25、39．3±80和38±0．1。在激活狀態(tài)，LDGs、SLE組與Control組的TNF-α實驗測定值（MFI±SEM）分別為2688±960、62．6±18和50±0．2。由此可知，LDGs有可能代表SLE疾病狀態(tài)TNF-α的來源之一。

LDGs合成白介素（interleukin，IL）-8和IL-6的水平高于自體狼瘡中性粒細胞和對照中性粒細胞［4］，例如，在未激活狀態(tài)，LDGs、SLE組與Control組的IL-8實驗測定值（MFI±SEM）分別為33±13．2、29± 9．2和27±11．7。在激活狀態(tài)，LDGs、SLE組與Control組的IL-8實驗測定值（MFI±SEM）分別為42± 10．9、40±3．46和34±7。這些炎性細胞因子增高可能導致SLE炎癥反應和組織損傷增強。

Ⅰ型干擾素（type I interferons，IFN-I）是有效抗病毒和抗細胞增殖的細胞因子。持續(xù)產(chǎn)生IFN-I 是SLE患者的特征之一［15］。SLE患者長期固有地激活類漿細胞樣樹突狀細胞（plasmacytoid dendritic cells，pDCs）分泌IFN-I是引發(fā)自身免疫的關(guān)鍵早期事件［16］。IFN-I可以促進成熟中性粒細胞產(chǎn)生NETs，這可能會導致一個自我實現(xiàn)的循環(huán)，即細胞因子激活粒細胞NETosis而死亡，反過來又導致pDCs合成更多的IFN-I。此外，LDGs形成NETs有能力在狼瘡巨噬細胞激活Nod樣受體蛋白3 （Nod-like receptor protein 3，NLRP3）炎性體，增加IL-1β和IL-18產(chǎn)生，依次進一步促進炎性反應和NETosis，形成潛在的惡性炎性循環(huán)［17］。

3．2LDGs合成IFN-I與內(nèi)皮細胞損傷

研究表明［18］，IFN-I在SLE的內(nèi)皮細胞損傷，進而導致動脈粥樣硬化形成的病理過程中發(fā)揮重要作用。SLE患者的內(nèi)皮細胞損傷和修復嚴重失衡，其特點是內(nèi)皮細胞凋亡加快，以及血管生成的關(guān)鍵細胞，如骨髓內(nèi)皮祖細胞（bone marrow-derived endothelial progenitor cells，EPCs）與髓循環(huán)血管生成細胞（myeloid circulating angiogenic cells，CACs）的表型和功能異常。當去除狼瘡EPCs／CACs中IFN-I信號傳導，可導致正常表型恢復，表明IFN-I對降低血管修復功能具有重要作用。研究報道［19］，使用細胞形成檢測法計數(shù)EPCs，SLE患者的EPC細胞形成單位較對照組顯著降低，對照組EPC細胞形成單位中位數(shù)為28．5／mL外周血（四分位距14．7～47．3），SLE患者為5．7／mL外周血（四分位距1．9～12．8），而對于IFN-I水平升高的SLE患者EPCs減少更加顯著，進一步證實IFN-I水平升高引起EPCs減少與SLE患者的內(nèi)皮功能障礙和心血管風險增加相關(guān)。Denny等［4］指出，培養(yǎng)的LDGs合成足夠量IFN-I，干擾內(nèi)皮祖細胞分化為成熟內(nèi)皮細胞的能力，這一現(xiàn)象與SLE患者過早地形成動脈粥樣硬化有關(guān)。

LDGs對內(nèi)皮細胞的細胞毒性效應似乎與LDGs形成NETs的能力有關(guān)，因為當有核酸酶存在，分解NETs時，血管細胞死亡現(xiàn)象消失［14］。更高數(shù)量的LDGs可能與狼瘡并發(fā)癥有關(guān)，如皮膚病和血管炎［4］。此外，在伴有皮膚病和腎臟并發(fā)癥的SLE患者的皮膚和腎臟中，觀察到誘捕網(wǎng)樣中性粒細胞的浸潤［14］。然而，這些細胞是否代表LDGs或正常密度中性粒細胞尚不清楚，目前，在組織水平尚沒有可以區(qū)分這兩類中性粒細胞的細胞標記物。

4　展望

LDGs代表激活中性粒細胞的一種亞群，具有與成熟的正常密度的中性粒細胞不同的表型和功能。流式細胞術(shù)和電鏡技術(shù)已證明LDGs存在于SLE患者外周血中，并與其病理過程相關(guān)。未來的研究應探討其他的自身免疫性疾病是否也存在LDGs，以及LDGs是否與這些疾病和器官損傷的發(fā)生有關(guān)。進一步系統(tǒng)地研究評估LDGs的起源、分化成熟狀態(tài)及其病理生理作用，有可能為SLE和其他自身免疫性疾病設(shè)計新的治療策略。

參考文獻

[1]Hacbarth E, Kajdacsy-Balla A. Low density neutrophils in patients with systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, and acute rheumatic fever [J]. Arthritis Rheum, 1986, 29(11):1334-1342.

[2]Bennett L, Palucka AK, Arce E, et al. Interferon and granulopoiesis signatures in systemic lupus erythematosus blood [J]. J Exp Med, 2003,197(6):711-723.

[3]Nakou M, Knowlton N, Frank MB, et al. Gene expression in systemic lupus erythematosus: bone marrow analysis differentiates active from inactive disease and reveals apoptosis and granulopoiesis signatures [J]. Arthritis Rheum, 2008,58(11):3541-3549.

[4]Denny MF, Yalavarthi S, Zhao W, et al. A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs [J]. J Immunol, 2010, 184(6):3284-3297.

[5]Carmona-Rivera C, Kaplan MJ. Low-density granulocytes: a distinct class of neutrophils in systemic autoimmunity[J]. Semin Immunopathol, 2013,35(4):455-463.

[6]Bryk JA, Popovic PJ, Zenati MS, et al. Nature of myeloid cells expressing arginase 1 in peripheral blood after trauma[J]. J Trauma, 2010,68(4):843-852.

[7]Cloke T, Munder M, Taylor G, et al. Characterization of a novel population of low-density granulocytes associated with disease severity in HIV-1 infection [J]. Plos One, 2012,7(11):e48939.

[8]Abebe T, Takele Y, Weldegebreal T, et al. Arginase activity-a marker of disease status in patients with visceral leishmaniasis in ethiopia[J]. Plos Negl Trop Dis, 2013,7 (3):e2134.

[9]Hoffmann MH, Bruns H, Backdahl L, et al. The cathelicidins LL-37 and rCRAMP are associated with pathogenic events of arthritis in humans and rats[J]. Ann Rheum Dis, 2013,72(7):1239-1248.

[10]Lin AM, Rubin CJ, Khandpur R, et al. Mast cells and neutrophils release IL-17 through extracellular trap formation in psoriasis[J]. J Immunol, 2011,187(1):490-500. Raber P, Ochoa AC, Rodriguez PC. Metabolism of

[11]L-arginine by myeloid-derived suppressor cells in cancer: Mechanisms of T cell suppression and therapeutic perspectives[J]. Immunol Invest, 2012,41(6-7):614-634.

[12]Ssemaganda A, Kindinger L, Bergin P, et al. Characterization of neutrophil subsets in healthy human pregnancies[J]. Plos One, 2014,9(2):e85696.

[13]周劍濤,姚振國,丁海峰.游離中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)DNA的研究進展[J].分子診斷與治療雜志, 2013,5 (2): 134-138.

[14]Villanueva E, Yalavarthi S, Berthier CC, et al. Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus[J]. J Immunol, 2011,187(1):538-552.

[15]Eshleman EM, Lenz LL. Type I interferons in bacterial infections: taming of myeloid cells and possible implications for autoimmunit[J]. Front Immunol, 2014,5:431.

[16]Lande R, Ganguly D, Facchinetti V, et al. Neutrophils activate plasmacytoid dendritic cells by releasing self-DNA-peptide complexes in systemic lupus erythematosus[J]. Sci Transl Med, 2011,3(73):73ra19.

[17]Kahlenberg JM, Carmona-Rivera C, Smith CK, et al. Neutrophil extracellular trap-associated protein activation of the NLRP3 inflammasome is enhanced in lupus macrophages[J]. J Immunol, 2013,190(3):1217-1226.

[18]Kaplan MJ, Salmon JE. How does IFN-α insult the vasculature Let me count the ways [J]. Arthritis Rheum, 2011,63(2):334-336.

[19]Lee P, Li Y, Richards H, et al. Type I interferon as a novel risk factor for endothelial progenitor cell depletion and endothelial dysfunction in systemic lupus erythematosus[J]. Arthritis Rheum, 2007,56(11):3759-3769.

Pathophysiological effect of low-density granulocytes in autoimmune diseases

ZHOU Libin1, ZHOU Jiantao2★, DING Haifeng2
(1. Laboratory Department of Skin Disease Hospital of Luotian County, Luotian, Hubei, China, 438600; 2.Medical and Health College of Huanggang Polytechnic University, Huanggang, Hubei, China, 438000)

[ABSTRACT]Tissue damage and potential aberrant immune responses could be caused by increased activation of abnormal neutrophils during the progression of autoimmune diseases．Recent studies have demonstrated a distinct subset of neutrophils isolated from the fraction of peripheral blood mononuclear cells（PBMCs）in the patients with systemic lupus erythematosus（SLE），which has been defined as low-density granulocytes（LDGs）．Compared with the circulating neutrophils in healthy individuals，LDGs show distinct phenotype and abnormal functions．They demonstrate proinflammatory activity and pathogenic effects，including injury to endothelial cells and enhanced capability to synthesize type I interferons（IFN-I）．Moreover，LDGs facilitate the formation of neutrophil extracellular traps（NETs）which plays an important role in promoting autoantigen externalization and resulting in organ damage．With elucidation of the pathogenicity of LDGs，novel therapeutic modalities may be designed for the treatment of SLE and other autoimmune diseases in the near future．

[KEY WORDS]Low-density granulocytes; Neutrophil; Autoimmune diseases; Neutrophil extracellular traps; Type I interferon

通訊作者：★周劍濤，E-mail：hgwx8＠163．com