朱翔　浦春　武其文

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單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的方法原理及應(yīng)用

朱翔浦春★武其文

［摘要］常規(guī)的轉(zhuǎn)錄組分析方法通常需要103個(gè)細(xì)胞，所以無法揭示單個(gè)細(xì)胞之間基因表達(dá)的異質(zhì)性，也難以對(duì)諸如早期胚胎及異質(zhì)性的組織干細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞等極少量細(xì)胞進(jìn)行分析，而單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)為此提供了有效的研究工具。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)是在單細(xì)胞水平對(duì)全轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行擴(kuò)增與測(cè)序的一項(xiàng)新技術(shù)。本文主要就單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的操作方法、應(yīng)用成果以及進(jìn)展作一綜述。

［關(guān)鍵詞］轉(zhuǎn)錄組；單細(xì)胞分離；高通量測(cè)序；全基因組擴(kuò)增

作者單位：皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，安徽，蕪湖241001

Principle and application of single cell transcriptome analysis

ZHU Xiang, PU Chun★, WU Qiwen
(Department of Clinical Laboratory, the First Affiliated Hospital, Wannan Medical College, Wuhu, Anhui, China, 241001)

［ABSTRACT］The conventional transcriptome analysis requires minimally 103cells, which makes it hard to identify the heterogeneity of gene expression among individual cells, or difficult to evaluate the specimens with very limited number of cells, such as early embryos, heterogeneous tissue specific stem cells and tumor stem cells. However, the emerging of single cell transcriptome analysis provides an efficient tool to achieve such research purposes. The single cell transcriptome sequencing technique is a new strategy to amplify and sequence the whole transcriptome in single cell. In this article, we review the development, relevant operating procedures, and applications of single cell transcriptome sequencing technique.

［KEY WORDS］Transcriptome; Single cell isolation; High-throughput sequencing; Whole genome amplification

在過去的二三十年里，基因組測(cè)序技術(shù)快速發(fā)展，人類千人基因組計(jì)劃和癌癥基因組計(jì)劃等大型測(cè)序項(xiàng)目相繼開展。這些測(cè)序所使用的材料均為數(shù)百萬個(gè)細(xì)胞的混合樣本，雖能夠得到為全基因組序列信息，但其結(jié)果顯示的只是一群細(xì)胞中信號(hào)的平均值，或只代表其中占優(yōu)勢(shì)數(shù)量的細(xì)胞信息，對(duì)單個(gè)細(xì)胞間的差異卻被忽視。對(duì)同一組織眾多細(xì)胞的測(cè)序會(huì)生成多重?cái)?shù)據(jù)，不利于追蹤細(xì)胞病變過程和細(xì)胞間狀態(tài)差異。

對(duì)臨床上諸如循環(huán)腫瘤細(xì)胞、早期發(fā)育的胚胎細(xì)胞等含量稀少的細(xì)胞而言，混合細(xì)胞群樣本的測(cè)序方法也已不再適用。2006年，Zhang在“Nature Biotechnology”上發(fā)表文章最先提出單細(xì)胞基因組測(cè)序技術(shù)［1］，即在單個(gè)細(xì)胞水平對(duì)全基因組或轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行擴(kuò)增與測(cè)序的一項(xiàng)新技術(shù)，這在近年取得突飛猛進(jìn)的發(fā)展。本文就單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的技術(shù)原理及應(yīng)用進(jìn)展作一綜述。

1　單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)

1．1單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序概述

轉(zhuǎn)錄組是指在某一特定階段，由細(xì)胞轉(zhuǎn)錄出來的全部RNA，包括mRNA和非編碼RNA［2－3］。轉(zhuǎn)錄組學(xué)就是從RNA水平研究基因的表達(dá)情況，在整體水平上研究細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)錄的情況及轉(zhuǎn)錄調(diào)控的規(guī)律。與基因組不同，轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究包含了時(shí)間和空間的限定。同一細(xì)胞在不同的生長(zhǎng)時(shí)期及生長(zhǎng)環(huán)境下，其基因表達(dá)情況是不完全相同的。近幾年興起的單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)可以在單細(xì)胞水平對(duì)全轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行擴(kuò)增與測(cè)序，其原理是將分離的單個(gè)細(xì)胞的微量全轉(zhuǎn)錄組RNA進(jìn)行擴(kuò)增后進(jìn)行高通量測(cè)序。利用該技術(shù)能夠揭示單個(gè)細(xì)胞內(nèi)整體水平的基因表達(dá)狀態(tài)和基因結(jié)構(gòu)信息，準(zhǔn)確反映細(xì)胞間的異質(zhì)性，深入理解其基因型和表型之間的相互關(guān)系。單細(xì)胞基因組技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用到多個(gè)領(lǐng)域，如植物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞（包括人體細(xì)胞）和微生物等。但是，單細(xì)胞基因組測(cè)序技術(shù)仍有3個(gè)關(guān)鍵技術(shù)點(diǎn)：第一，單細(xì)胞分離技術(shù)；第二，單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增技術(shù)；第三，高通量測(cè)序技術(shù)。

1．2單細(xì)胞分離技術(shù)

進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序，首先要對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行分離分獲得到單細(xì)胞樣品。迄今為止，已經(jīng)有多種技術(shù)方法被用于單細(xì)胞的分離，常用的單細(xì)胞分離方法主要有連續(xù)稀釋法（serial dilution）、顯微操作法（micromanipulation）、熒光流式分選法、激光捕獲顯微切割技術(shù)以及微流控平臺(tái)（microfluidic platforms）。這些方法各有利弊，所以要根據(jù)具體的情況選擇合適的方法進(jìn)行分離。

1．2．1連續(xù)稀釋法

該技術(shù)通過將細(xì)胞進(jìn)行一系列的倍比稀釋最終使細(xì)胞處于單個(gè)狀態(tài)，已成功應(yīng)用在不同組織的干細(xì)胞、前體細(xì)胞體外克隆形成分析的研究中［1，4－5］。此方法操作簡(jiǎn)便，且不需要特殊的設(shè)備，但是依賴于梯度稀釋計(jì)算，不是直觀的單個(gè)細(xì)胞分離，容易出現(xiàn)錯(cuò)誤。

1．2．2顯微操作法

顯微操作法是指在高倍倒置顯微鏡下，利用顯微操作器（控制顯微注射針在視野中移動(dòng)的機(jī)械裝置）進(jìn)行細(xì)胞或早期胚胎等操作的一種技術(shù)方法。此技術(shù)主要應(yīng)用于目標(biāo)細(xì)胞所在的群體數(shù)量較少的樣品分離中［6］，能夠高效地控制單個(gè)細(xì)胞的吸取和釋放。

1．2．3熒光流式分選法

熒光流式分選法是一種通過流式細(xì)胞儀，根據(jù)細(xì)胞特異性分子標(biāo)志或者細(xì)胞光散射的特性，分選單個(gè)細(xì)胞或者特殊細(xì)胞群的技術(shù)［7］。此技術(shù)主要的優(yōu)勢(shì)在于能夠選擇特異和非特異的分選，并且在分離單細(xì)胞時(shí)具有很高的精度和通量［8］。

1．2．4激光捕獲顯微切割技術(shù)

激光捕獲顯微切割技術(shù)［9］是選擇性地將目標(biāo)組織切片或細(xì)胞固定在裝配有可以激光脈沖激活的熱塑膜的涂片上，其中膜包括乙烯乙酸乙烯酯膜、聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯膜和聚萘二甲酸乙二醇酯膜等，顯微鏡直視下選擇并激光切割目標(biāo)細(xì)胞。應(yīng)用此技術(shù)可以直觀地在顯微鏡下準(zhǔn)確、快速地獲取單一細(xì)胞亞群或者單個(gè)細(xì)胞，解決了組織中細(xì)胞異質(zhì)性的問題。該技術(shù)現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于結(jié)腸癌［10］、乳腺癌［11］、結(jié)核?。?2］和丙型肝炎［13］的研究中。

1．2．5微流控平臺(tái)

與其他方法比較，微流控平臺(tái)相結(jié)合單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)在降低單細(xì)胞測(cè)序的噪聲以及基因組擴(kuò)展更加均勻方面具有優(yōu)勢(shì)，顯示出了良好的應(yīng)用前景［14－16］。此外，微流體芯片的微量反應(yīng)容積還提高了擴(kuò)增的精確率和反應(yīng)效率。許多實(shí)驗(yàn)室開始設(shè)計(jì)將微流控平臺(tái)用于他們的研究對(duì)象［17－18］，并且有微流控平臺(tái)已經(jīng)商品化［19］。例如，F(xiàn)luidigm公司最近推出一款C1單細(xì)胞擴(kuò)增儀器，其原理就是在微流控芯片中進(jìn)行細(xì)胞裂解、反轉(zhuǎn)錄與cDNA擴(kuò)增，再利用轉(zhuǎn)座酶技術(shù)構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)［20－21］，顯著提升了建庫(kù)通量。

1．3單細(xì)胞全轉(zhuǎn)錄組cDNA擴(kuò)增技術(shù)

全基因組擴(kuò)增是單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的關(guān)鍵步驟，對(duì)于形成足夠量的DNA片段用于測(cè)序分析起著至關(guān)重要的作用。如今已研發(fā)出多種擴(kuò)增方法，例如簡(jiǎn)并寡核苷酸引物PCR、引物延伸預(yù)擴(kuò)增PCR、連接介導(dǎo)的PCR等。尤其近年發(fā)展起來的基于多重置換擴(kuò)增和多次退火環(huán)狀循環(huán)擴(kuò)增單細(xì)胞測(cè)序，他們?cè)谌蚪M擴(kuò)增中有著較為廣泛的應(yīng)用。

1．3．1多重置換擴(kuò)增技術(shù)

多重置換擴(kuò)增技術(shù)最先由Dean等在2002年報(bào)道。多重置換擴(kuò)增技術(shù)作為一種不依賴于PCR的全基因組擴(kuò)增方法，近些年來得到廣泛應(yīng)用。該方法利用Phi29DNA聚合酶和隨機(jī)六聚體引物對(duì)人基因組進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增，首先隨機(jī)六堿基寡核苷酸作為引物在多個(gè)位點(diǎn)與基因組模板DNA退火，接下來Phi29DNA聚合酶在多個(gè)位點(diǎn)同時(shí)開始復(fù)制，沿著DNA模板合成DNA，同時(shí)取代模板的互補(bǔ)鏈。被置換的互補(bǔ)鏈又作為新的模板來進(jìn)行擴(kuò)增，形成一個(gè)級(jí)聯(lián)分支的放大系統(tǒng)，最終可獲得相對(duì)高分子質(zhì)量的DNA。該反應(yīng)在常溫下擴(kuò)增，避免了高溫下DNA降解對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物質(zhì)量的影響及GC含量不同引發(fā)的優(yōu)勢(shì)擴(kuò)增。但是此方法的擴(kuò)增均勻性不高。多重置換擴(kuò)增技術(shù)可用于單核苷酸多態(tài)性以及突變相關(guān)的研究。

1．3．2多次退火環(huán)狀循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)

2012年12月，哈佛大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)在Science上發(fā)表介紹多次退火環(huán)狀循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)的文章［22］，該技術(shù)是目前最先進(jìn)的全基因組擴(kuò)增技術(shù)。不同于以往的擴(kuò)增方法，多次退火環(huán)狀循環(huán)擴(kuò)增能夠從一個(gè)細(xì)胞的基因組中，分離出來自單細(xì)胞的DNA，然后添加特殊的引物，這些引物可與DNA的隨意部分互補(bǔ)，從而使得它們能夠附著到DNA鏈上，充當(dāng)DNA復(fù)制起點(diǎn)。這些引物由兩個(gè)部分構(gòu)成——一個(gè)包含8個(gè)核苷酸的粘性部分變化多樣，可與DNA結(jié)合，再加上一個(gè)包含27個(gè)核苷酸的共同序列。這一共同序列通過將自身摻入到新拷貝鏈，從而自身成環(huán)，防止了過度拷貝，從而大大地降低了擴(kuò)增偏倚，提高了基因組覆蓋率，可以使單細(xì)胞中93%的基因組被測(cè)序。另外，多次退火環(huán)狀循環(huán)擴(kuò)增的靈敏度較高。單細(xì)胞、單染色體或0．5 pg的基因組DNA即可進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增的均勻性也顯著優(yōu)于其它技術(shù)。該技術(shù)可用于那些樣本稀少，用常規(guī)方法無法進(jìn)行基因組或轉(zhuǎn)錄組分析或者樣本高度異質(zhì)，細(xì)胞之間存在重要差異的樣本。

1．4高通量測(cè)序技術(shù)

自2005年以來，以Roche公司的454技術(shù)、Illumina公司的Solexa技術(shù)和ABI公司的SOLiD （supported oligo ligation detetion）技術(shù)為標(biāo)志的高通量測(cè)序技術(shù)相繼誕生［23－24］。高通量測(cè)序技術(shù)是測(cè)序技術(shù)發(fā)展的一個(gè)里程碑，該技術(shù)可以對(duì)數(shù)百萬個(gè)DNA分子進(jìn)行同時(shí)測(cè)序，從而使得對(duì)一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行細(xì)致全貌的分析成為可能，因此也稱其為深度測(cè)序（deep sequencing）或下一代測(cè)序技術(shù)。Roche公司首先推出了基于焦磷酸測(cè)序法的超高通量基因組測(cè)序系統(tǒng)。該技術(shù)的原理是酶級(jí)聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)：首先將PCR擴(kuò)增的單鏈DNA與引物雜交，并與DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶、ATP雙磷酸酶、底物熒光素酶和5′－磷酸硫酸腺苷共同孵育。在每一輪測(cè)序反應(yīng)中只加入一種dNTP，若該dNTP與模板配對(duì)，聚合酶就可以將其摻入到引物鏈中并釋放出等摩爾數(shù)的焦磷酸。焦磷酸鹽被硫酸化酶轉(zhuǎn)化為ATP，ATP就會(huì)促使氧合熒光素的合成并釋放可見光。電荷耦合器件檢測(cè)后通過軟件轉(zhuǎn)化為一個(gè)峰值，峰值與反應(yīng)中摻入的核苷酸數(shù)目成正比［24］。隨后，Illumina公司和ABI公司也相繼推出了Solexa和SOLiD測(cè)序技術(shù)。正如高通量測(cè)序技術(shù)在基因組測(cè)序中發(fā)揮了強(qiáng)大的作用，它也極大地促進(jìn)了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的發(fā)展。將以上高通量測(cè)序技術(shù)應(yīng)用到由RNA逆轉(zhuǎn)錄生成的cDNA上，就產(chǎn)生了RNA-Seq技術(shù)［25］。

2　單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用

2．1腫瘤和循環(huán)腫瘤細(xì)胞

2011年，來自冷泉港實(shí)驗(yàn)室的Navin等［26］運(yùn)用一種單細(xì)胞測(cè)序，通過基于拷貝數(shù)變異的數(shù)據(jù)結(jié)果分析了乳腺癌的癌細(xì)胞種群結(jié)構(gòu)，指出腫瘤的進(jìn)化可能是間斷性的，挑戰(zhàn)了傳統(tǒng)的腫瘤漸進(jìn)式演化模型。2012年，深圳華大基因研究院將其自主研發(fā)的一種解析單細(xì)胞基因組的新方法應(yīng)用于原發(fā)性血小板增多癥和腎透明細(xì)胞癌的腫瘤內(nèi)部遺傳特征的研究。此方法解決了之前用組織樣本測(cè)序時(shí)無法解決的腫瘤高異質(zhì)性難題，為從單核苷酸水平深入研究癌癥發(fā)生、發(fā)展機(jī)制及其診斷、治療提供了新的研究思路并開辟了新的研究方向。為了探究腫瘤的演化及遺傳特性，研究人員對(duì)取自一例典型的JAK2基因陰性原發(fā)性血小板增多癥病人的90個(gè)單細(xì)胞進(jìn)行了全外顯子測(cè)序［27］，通過分析，研究人員揭示了此原發(fā)性血小板增多癥在腫瘤發(fā)生中遵循單克隆演化模型，并鑒定了一些與原發(fā)性血小板增多癥的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的突變基因。另外，研究人員為了更好地解析腎癌內(nèi)部的遺傳變異情況，運(yùn)用此方法對(duì)一例腎癌進(jìn)行了研究［28］。他們發(fā)現(xiàn)此例腎癌并非由常見的兩個(gè)突變基因VHL和PBRM1導(dǎo)致，說明在病人群體中所鑒定的頻發(fā)突變可能與腫瘤個(gè)體無關(guān)，同時(shí)也強(qiáng)調(diào)了在癌癥分析和診斷過程中進(jìn)行個(gè)性化治療的重要性。

循環(huán)腫瘤細(xì)胞是一種從腫瘤原發(fā)灶中脫落進(jìn)入患者血液的腫瘤細(xì)胞，數(shù)量極為稀少，但與腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)有著密切關(guān)系［29］。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?yàn)槠滢D(zhuǎn)錄組分析提供了工具。例如Daniel等［30］利用Smart-Seq技術(shù)對(duì)單個(gè)循環(huán)系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行分析，利用各個(gè)細(xì)胞類型中微量的個(gè)體細(xì)胞找到了多個(gè)基因的不同表達(dá)，成功檢測(cè)出前列腺淋巴結(jié)癌細(xì)胞中的大多數(shù)活躍基因，并發(fā)現(xiàn)了不同的基因表達(dá)模式和生物標(biāo)記物。

2．2胚胎和器官發(fā)育

來自斯坦福大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)［17］從一名40歲男性體內(nèi)分離出91個(gè)精子，并首次對(duì)它們進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序。研究人員通過比較這名男性的精子基因組序列和他的二倍體細(xì)胞基因組序列，觀察到單倍體精子細(xì)胞染色體中哪些地方發(fā)生了重組。研究人員也在每個(gè)精子細(xì)胞中鑒定出25個(gè)～36個(gè)新的單核苷酸突變，這些突變?cè)谶@名男性的二倍體細(xì)胞基因組中并不存在。這些隨機(jī)突變是產(chǎn)生遺傳變異的另一種方式，但是如果它們?cè)诨蚪M特定位點(diǎn)發(fā)生，那么它們能夠產(chǎn)生有害的影響。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)在早期胚胎發(fā)育方面也有所應(yīng)用。例如Yan等［31］從植入前胚胎和單個(gè)人類胚胎干細(xì)胞中選取了124個(gè)細(xì)胞，測(cè)定了它們的基因表達(dá)，并成功檢測(cè)到22 687個(gè)表達(dá)的基因，其中包括8 701個(gè)長(zhǎng)非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）。2．3免疫系統(tǒng)

近年來，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)開始被應(yīng)用于免疫系統(tǒng)的研究當(dāng)中。免疫細(xì)胞對(duì)抗原物質(zhì)的應(yīng)答反應(yīng)具有復(fù)雜和不均一性的異質(zhì)性特點(diǎn)，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)有望在此方面揭示豐富的未知信息。最近Shalek等［32］就對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)進(jìn)行了研究。脂多糖是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁中的一種成分，能夠通過激活樹突狀細(xì)胞的Toll樣受體引發(fā)顯著的轉(zhuǎn)錄組改變。研究者利用RNA轉(zhuǎn)錄5′末端轉(zhuǎn)換機(jī)制技術(shù)對(duì)18個(gè)小鼠骨髓來源的樹突狀細(xì)胞進(jìn)行了cDNA文庫(kù)的構(gòu)建，并進(jìn)行測(cè)序分析，他們發(fā)現(xiàn)在單細(xì)胞水平上，樹突狀細(xì)胞的反應(yīng)具有高度的異質(zhì)性［32］。許多已知的炎癥反應(yīng)基因在部分細(xì)胞中被強(qiáng)烈激活，而在其他細(xì)胞中僅被低度激活或完全未被激活，并且進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)這種反應(yīng)應(yīng)答的異質(zhì)性源于兩個(gè)方面，一方面是樹突狀細(xì)胞的成熟狀態(tài)，另一方面則是基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的隨機(jī)性特征。

通過上述的實(shí)例，我們不難看出單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)在疾病研究等領(lǐng)域具有重大的應(yīng)用價(jià)值。相信隨著其技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)可以揭示更多基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)、異質(zhì)性、隨機(jī)性表達(dá)等相關(guān)信息，從而更加完善地揭示更多疾病的機(jī)理，為人類戰(zhàn)勝疾病奠定理論基礎(chǔ)。

3　展望

近年來，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)已經(jīng)取得了較為明顯的發(fā)展，被應(yīng)用于諸多領(lǐng)域，從最初的哺乳動(dòng)物早期胚胎發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄組分析，到組織器官的發(fā)育，再到免疫系統(tǒng)和腫瘤等研究領(lǐng)域都可以見到單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的身影。它的廣泛應(yīng)用為科研人員研究細(xì)胞之間的異質(zhì)性帶來了希望，使人們對(duì)各種疾病的發(fā)病機(jī)理有了更為深刻和具體的認(rèn)識(shí)。

為了使單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)能夠在未來發(fā)揮更大的作用，還應(yīng)當(dāng)將其與其他技術(shù)相結(jié)合，例如細(xì)胞成像技術(shù)等。另外，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)應(yīng)當(dāng)朝著更加高通量的方向發(fā)展，在未來實(shí)現(xiàn)不單單針對(duì)單個(gè)樣品或細(xì)胞的大規(guī)模集成化的分析，從而大大節(jié)約時(shí)間和成本。最后，由于目前的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的操作過程相對(duì)比較繁瑣，過多的依賴實(shí)驗(yàn)人員的操作技術(shù)，使得該技術(shù)的效率和穩(wěn)定性都有所欠缺，為此應(yīng)當(dāng)朝著自動(dòng)化的方向進(jìn)一步發(fā)展，爭(zhēng)取實(shí)現(xiàn)整個(gè)過程的自動(dòng)操作。

總之，相信隨著單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，各技術(shù)環(huán)節(jié)的日臻完善，其必將在醫(yī)療衛(wèi)生等領(lǐng)域取得更加豐碩的成果，成為人們治療疾病、探索生命科學(xué)的一項(xiàng)必不可少的技術(shù)。

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?綜述?

通訊作者：★浦春，E-mail：philpcpu＠163．com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（81301512）；安徽省自然科學(xué)基金（10040606Q68）