郭奕斌　梁宇靜　郭東煒

?

單基因遺傳病基因診斷技術(shù)研究進(jìn)展

郭奕斌1★梁宇靜2郭東煒3

［摘要］單基因遺傳?。ê?jiǎn)稱單基因病）種類、分型繁多，常規(guī)診斷難以確診，而基因診斷技術(shù)在遺傳病特別是單基因病的確診、分型等方面都發(fā)揮著不可或缺的作用。近一、二十年來，基因診斷技術(shù)進(jìn)展迅猛，各種檢測(cè)方法層出不窮。本文重點(diǎn)圍繞基因診斷技術(shù)的最新進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期對(duì)臨床診斷和預(yù)防工作提供一些有益的啟示。

［關(guān)鍵詞］單基因?。换蛟\斷；技術(shù)方法

作者單位：1．中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室，廣東，廣州510080

2．中山大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳室業(yè)余科研小組／2011級(jí)臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)，廣東，廣州510080

3．廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院2014級(jí)臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)，福建，廈門361102

在5大類遺傳?。郯▎位蜻z傳?。ê?jiǎn)稱單基因?。?、多基因病、染色體病、線粒體病和體細(xì)胞遺傳?。葜?，病種最多的當(dāng)屬單基因?。?－3］。據(jù)在線人類孟德爾遺傳最新報(bào)道，已被美國國家生物技術(shù)信息中心正式收錄的就有22 000多種［3］。

對(duì)于基因病，基因診斷被公認(rèn)是確診該類疾病最準(zhǔn)確、最可靠的診斷技術(shù)和金標(biāo)準(zhǔn)，它可以在分子水平甚至在單個(gè)堿基發(fā)生改變的情況下作出明確診斷。基因診斷是繼形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)和免疫診斷學(xué)之后的第四代診斷技術(shù)，是診斷學(xué)領(lǐng)域的一次革命［4］。它打破常規(guī)診斷的方式，不以疾病的表型為主要依據(jù)，而是采用分子生物學(xué)的技術(shù)和方法，直接檢測(cè)被檢者某一特定基因的結(jié)構(gòu)或者功能是否異常，從而對(duì)疾病作出診斷。相對(duì)于常規(guī)診斷，基因診斷更注重個(gè)體基因狀態(tài)，不僅可以對(duì)患者所患疾病做出判斷，還可以對(duì)表型正常的攜帶者或者遺傳易感者做出前瞻性診斷［4－5］?；蛟\斷具有高特異性、高靈敏性、早期診斷性和應(yīng)用廣泛性等特點(diǎn)，因此日益得到普及和推廣。近一、二十年來，基因診斷技術(shù)取得了前所未有的進(jìn)步。隨著該技術(shù)在臨床檢測(cè)中的推廣、應(yīng)用，其已為早期診斷單基因病、多基因病以及腫瘤遺傳病、線粒體遺傳病等帶來了曙光。回顧基因診斷的發(fā)展歷程，不難看出，它經(jīng)歷了從間接診斷到直接診斷，從簡(jiǎn)單到復(fù)雜再回歸簡(jiǎn)單，從單一技術(shù)到整合技術(shù)，從時(shí)間長、成本高、通量低、需手工操作到快速、廉價(jià)、高通量、自動(dòng)化，從多細(xì)胞到單分子，從用量多到用量少的過程［6］。下面重點(diǎn)對(duì)單基因病的最新基因診斷技術(shù)做一概述。

1　基因診斷技術(shù)分類

基因診斷通常在基因定位、基因克隆、基因序列、蛋白結(jié)構(gòu)已經(jīng)弄清或雖未弄清但與其他遺傳標(biāo)記的連鎖關(guān)系已經(jīng)明確的情況下進(jìn)行，大致分為間接診斷和直接診斷2大類。

從發(fā)展歷程和診斷策略來看，基因診斷技術(shù)包括：（1）連鎖分析類：限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)（variable number of tandem repeat，VNTR）、短串聯(lián)重復(fù)（short tandem repeat，STR）、簡(jiǎn)單序列長度多態(tài)性（simple sequence length polymorphism，SSLP）、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，Amp－FLP）、單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNP）；（2）分子雜交類：Southern印跡雜交（Southern blot）、斑點(diǎn)雜交（dot blot）、反向點(diǎn)雜交（reverse dot blot，RDB）、Northern印跡雜交（northern blot）、蛋白質(zhì)印跡雜交（western blot）、抑制性消減雜交（suppression subtractive hybridization，SSH）；（3）PCR及其衍生技術(shù)類：聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）、不對(duì)稱PCR（asymmetric PCR）、多重PCR （multiplex PCR）、多重巢式PCR（multiplex-nested PCR）、長片段PCR（long PCR）、三引物PCR（triprimer PCR，TP-PCR）、逆轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real time quantitative PCR，RTQ-PCR或qPCR）、數(shù)字PCR技術(shù)（digital PCR，dPCR）、PCR寡核苷酸探針雜交（sequence-specific oligonucleotide primed PCR，PCR-SSO）、擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng)（amplification refractory mutation system，ARMS）［即等位基因特異性擴(kuò)增（allele-specific amplification，ASA）］、高分辨熔解曲線分析（high-resolution melting curve analysis，HRM）、多重連接探針擴(kuò)增（multiplex ligationdependent probe amplification，MLPA）、變性高效液相色譜分析（denaturing high-performance liquid chromatograph，DHPLC）、DNA生物傳感器檢測(cè)法（DNA biosensors）；（4）基因芯片（DNA chip）技術(shù)：cDNA芯片、寡核苷酸芯片等；（5）基因序列分析類：Sanger法測(cè)序、高通量測(cè)序技術(shù)（high-throughput sequencing）［即下一代測(cè)序技術(shù)（next-generation sequencing，NGS）］、基因組擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄同步測(cè)序法（genomic amplification with transcript sequencing，GAWTS）、全外顯子測(cè)序（whole-exome sequencing，WES）［即外顯子組測(cè)序（exome sequencing）］、全基因組測(cè)序（whole-genome sequencing，WGS）、第三代測(cè)序技術(shù)等數(shù)十種。隨著科學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，基因診斷和各種組學(xué)的新技術(shù)新方法也在不斷涌現(xiàn)并日益在臨床醫(yī)學(xué)中發(fā)揮著重要的作用。

2　間接診斷

間接診斷是指當(dāng)致病基因本身尚屬未知或致病基因雖然已知但其突變尚屬未知時(shí)，可以通過對(duì)患者及其家系成員進(jìn)行連鎖分析或單倍型分析，從而推斷受檢者是否帶有致病基因的一種診斷方法。

連鎖分析是基于緊密連鎖的基因或遺傳標(biāo)記通常會(huì)一起傳遞給子代，因而考察相鄰DNA是否傳遞給了子代，即可間接地判斷致病基因是否傳遞給子代。連鎖分析多使用基因組中廣泛存在的各種DNA多態(tài)性位點(diǎn)，特別是基因突變部位或緊鄰的多態(tài)性位點(diǎn)作為遺傳標(biāo)記。RFLP、SSLP、STR、SNP等均可用于連鎖分析。通過多位點(diǎn)的連鎖分析，還可進(jìn)行親子鑒定等。通常，RFLP被認(rèn)為是第一代遺傳標(biāo)記，SSLP／STR是第二代遺傳標(biāo)記，SNP是第三代遺傳標(biāo)記［7］。

3　直接診斷

對(duì)于基因序列、結(jié)構(gòu)、功能、突變類型都清楚的、且發(fā)生于候選基因內(nèi)的突變的檢測(cè)，可以采用直接診斷的方法。直接診斷是指直接檢查目的基因本身有無異常。它通常是用基因本身或緊鄰的DNA序列作為探針，或通過PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，以探查基因有無突變、缺失等異常并闡明突變的性質(zhì)和突變的類型等。直接診斷適用于已知基因異常的疾病。下面分別介紹。

3．1分子雜交及相關(guān)技術(shù)

互補(bǔ)的DNA單鏈能夠在一定條件下結(jié)合成雙鏈，即所謂的分子雜交。分子雜交技術(shù)包括Southern blot、northern blot、dot blot、RDB、SSH、DNA biosensors、western blot等。其中，Southern blot、northern blot和dot blot、RDB、SSH、DNA biosensors也稱核酸的分子雜交，用于檢測(cè)特定的DNA、RNA；western blot又稱免疫學(xué)測(cè)定，用于檢測(cè)特定的蛋白質(zhì)。核酸分子雜交是基因診斷的最基本的方法之一，其中，SSH技術(shù)、DNA生物傳感器檢測(cè)法比較新穎，本節(jié)重點(diǎn)介紹它們。

3．1．1SSH技術(shù)

SSH技術(shù)是一種鑒定、分離組織細(xì)胞中選擇性表達(dá)基因的技術(shù)，是一種以抑制性PCR（利用鏈內(nèi)退火優(yōu)于鏈間退火，使非目的序列片段兩端的長反向重復(fù)序列在退火時(shí)產(chǎn)生“鍋柄樣”結(jié)構(gòu)，無法與引物配對(duì)，從而選擇性抑制非目的序列片段擴(kuò)增）反應(yīng)為基礎(chǔ)，將標(biāo)準(zhǔn)化測(cè)試cDNA單鏈步驟和消減雜交步驟合為一體的技術(shù)。它是建立在抑制性雜交和選擇性PCR基礎(chǔ)上的差異表達(dá)基因篩選手段。通過合成2個(gè)不同的接頭，接于經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化后的測(cè)試cDNA片段的5′末端，將測(cè)試和驅(qū)動(dòng)進(jìn)行兩輪雜交［8－9］。

該技術(shù)具有篩選高效、假陽性率低的優(yōu)點(diǎn)，因而廣泛應(yīng)用在動(dòng)物、植物、人類及癌癥等研究領(lǐng)域［5］。在高血糖發(fā)病的研究中，研究者利用SSH方法發(fā)現(xiàn)丙酮酸羧激酶和膽固醇O-乙酰基轉(zhuǎn)移酶2個(gè)基因與葡萄糖激酶代謝緊密相關(guān)，并利用RTQPCR對(duì)其進(jìn)行了驗(yàn)證［10］；在進(jìn)行葡萄糖激酶對(duì)腎臟功能影響研究時(shí)篩選到谷胱甘肽過氧化物酶3 （glutathione peroxidase-3，GPX3）基因表達(dá)發(fā)生改變，并且GPX3可作為腎臟損傷初期的標(biāo)記物［11］。Ren等［12］利用SSH方法鑒定出旋毛蟲肌肉期幼蟲與腸道期幼蟲的9個(gè)差異表達(dá)基因（Ts7、Ts8、Ts11、Ts17、Ts19、Ts22、Ts23、Ts26、Ts33），對(duì)旋毛蟲肌肉期幼蟲轉(zhuǎn)變成腸道期幼蟲的相關(guān)機(jī)理進(jìn)行了闡述。曹振龍等［9］利用SSH方法對(duì)小鼠MOE內(nèi)受AC3調(diào)控的差異表達(dá)基因進(jìn)行了篩選，獲得了kcnk3、mapk7、megf11、c-mip、skp1a、mlycd、tmem88b、trappc5、ppat、ssr3等差異表達(dá)基因，并證實(shí)這些基因分別與K＋通道、胞外信號(hào)調(diào)控、胞內(nèi)蛋白泛素化因子、胞內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)膜與運(yùn)輸?shù)壬飳W(xué)功能相關(guān)。SSH法所需實(shí)驗(yàn)材料是通過PCR擴(kuò)增獲得，整個(gè)過程包括多次酚：氯仿抽提，這些過程可能會(huì)使部分基因丟失，此為其不足之處。

3．1．2DNA biosensors技術(shù)

3．2PCR及其衍生技術(shù)

對(duì)于基因突變的檢測(cè)，在1985以前主要是利用Southern印跡法，它可以檢出基因的缺失、插入、重組等突變形式，而點(diǎn)突變、微缺失、微插入則很難檢出，只能應(yīng)用PCR結(jié)合其他方法完成。PCR技術(shù)是突變研究中的重大進(jìn)展，目前幾乎所有的基因突變檢測(cè)技術(shù)都是建立在PCR基礎(chǔ)之上，并且由PCR衍生出許多新方法，目前已達(dá)20余種，自動(dòng)化程度也越來越高，分析時(shí)間也大大縮短，分析結(jié)果的準(zhǔn)確性也有很大提高。這是因?yàn)镻CR技術(shù)可以使特定的基因或DNA片段在短短的1．5 h～3 h內(nèi)體外擴(kuò)增數(shù)十萬至百萬倍。擴(kuò)增的片段可以直接通過電泳觀察，也可用于進(jìn)一步的分析。這樣，少量的單拷貝基因不需通過同位素來提高其敏感性，而通過擴(kuò)增至百萬倍后直接觀察到，而且原先需要一、二周才能作出的診斷現(xiàn)可以縮短至數(shù)小時(shí)甚至1 h～2 h。

PCR技術(shù)目前有許多新的發(fā)展，用途日益擴(kuò)大。本小節(jié)重點(diǎn)介紹TP-PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、數(shù)字PCR這幾種。

3．2．1TP-PCR技術(shù)

TP-PCR是一種不需要限制性內(nèi)切酶和連接酶的重組DNA的方法?？捎糜谄唇尤诤匣颍荒康幕蛑袎A基的定點(diǎn)突變；目的基因中某些功能結(jié)構(gòu)域的人工缺失研究；在目的基因中的任何位置插入外源基因片段，進(jìn)行重組基因的研究。

該法的原理是：TP-PCR反應(yīng)體系中有2種模板和3種引物，可以在同一個(gè)反應(yīng)體系中產(chǎn)生一個(gè)重組DNA分子。設(shè)計(jì)合理的中間引物是保證TPPCR反應(yīng)成功的關(guān)鍵。只有中間引物設(shè)計(jì)合理才能保證2種DNA片段在融合位點(diǎn)正確連接。3條引物的濃度比例是另一個(gè)關(guān)鍵因素。要適當(dāng)調(diào)節(jié)中間引物的比例使得TP-PCR反應(yīng)獲得最理想的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，合適的比例范圍可有效增加目的片段的擴(kuò)增，同時(shí)減少非特異產(chǎn)物的擴(kuò)增，一般來說在1／1 000～1／100范圍內(nèi)比較合適。除此之外，為了保證PCR產(chǎn)物的高忠實(shí)性，需用高忠實(shí)的DNA聚合酶來代替Taq聚合酶［14－15］。

TP-PCR法簡(jiǎn)便、快捷、經(jīng)濟(jì)，可以在所期望的任何位點(diǎn)將2種DNA片段連接起來，而無需知道DNA片段的限制位點(diǎn)。通過TP-PCR進(jìn)行重組操作，可以在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)于一個(gè)PCR反應(yīng)體系中完成，無需高檔設(shè)備儀器和試劑盒，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)所研究的目的基因的改造。鄧朝陽等［14］用這種方法構(gòu)建融合蛋白基因——SCK基因獲得成功。朱艷等［15］用該法構(gòu)建抗人CD28嵌合抗體雙啟動(dòng)子昆蟲桿狀病毒重組轉(zhuǎn)移載體也獲得圓滿成功。該法的突出優(yōu)點(diǎn)在于無需設(shè)計(jì)外源的DNA序列，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)目的基因的任何常規(guī)性改造，從而避免在原有基因中引入冗余的酶切位點(diǎn)的堿基序列［14－16］。

另外，品牌建設(shè)是當(dāng)前農(nóng)產(chǎn)品附加值提升的一個(gè)重要影響因素，品牌建設(shè)不可忽視。企業(yè)應(yīng)該加大資金投入，增強(qiáng)湖北特色農(nóng)產(chǎn)品品牌營銷與推廣力度，創(chuàng)新品牌建設(shè)方式，與時(shí)俱進(jìn)，進(jìn)行多形式的營銷推廣活動(dòng)，擴(kuò)大品牌在國內(nèi)國際的影響力，提高企業(yè)知名度，發(fā)揮品牌效應(yīng)，以品牌帶動(dòng)消費(fèi)，擴(kuò)大市場(chǎng)；以市場(chǎng)需求促進(jìn)產(chǎn)品價(jià)格提升，形成良性循環(huán)。

3．2．2RT-PCR，RTQ-PCR和多重巢式RT-PCR技術(shù)

RT-PCR為逆轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription PCR）的縮寫。逆轉(zhuǎn)錄PCR是PCR的一種衍生技術(shù)。在逆轉(zhuǎn)錄PCR中，一條RNA鏈被逆轉(zhuǎn)錄成為cDNA，再以此為模板通過PCR進(jìn)行DNA擴(kuò)增。RT-PCR的指數(shù)擴(kuò)增是一種很靈敏的技術(shù)，可以檢測(cè)很低拷貝數(shù)的RNA。RT-PCR廣泛應(yīng)用于遺傳病的診斷，并且可以用于定量檢測(cè)某種RNA的含量。

RT-PCR有時(shí)候也會(huì)指代實(shí)時(shí)PCR（real time PCR）。為了與逆轉(zhuǎn)錄PCR相區(qū)別，通常被寫作實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real time quantitative PCR，RTQPCR）［17］。實(shí)時(shí)PCR，屬于定量PCR的一種，以一定時(shí)間內(nèi)DNA的增幅量為基礎(chǔ)進(jìn)行DNA的定量分析。

多重巢式RT-PCR的原理同多重巢式PCR，不同之處在于所用的模板是cDNA而不是DNA。逆轉(zhuǎn)錄PCR可在RNA水平檢測(cè)基因的突變類型和突變效應(yīng)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR具有靈敏、特異、技術(shù)成熟和操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)于臨床上明確診斷、具體分型、動(dòng)態(tài)觀測(cè)腫瘤負(fù)荷、選擇合適治療方案、評(píng)估治療效果和預(yù)后都有較大價(jià)值。在產(chǎn)前監(jiān)測(cè)和產(chǎn)前基因診斷也具有重要意義。

逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）和多重巢式RT-PCR有一個(gè)共同的缺點(diǎn)就是所提的RNA易降解且操作較繁瑣。

3．2．3dPCR技術(shù)

dPCR技術(shù)是一種新的核酸檢測(cè)和定量技術(shù)，與傳統(tǒng)qPCR（即RTQ-PCR）技術(shù)不同，dPCR采用絕對(duì)定量的方式，不依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線和參照樣本，直接檢測(cè)目標(biāo)序列的拷貝數(shù)。由于這種檢測(cè)方式具有比qPCR更加出色的靈敏度和特異性、精確性，故得到廣泛的應(yīng)用。這項(xiàng)技術(shù)在極微量核酸樣本檢測(cè)、復(fù)雜背景下稀有突變檢測(cè)和表達(dá)量微小差異鑒定方面都具有諸多優(yōu)勢(shì)，其在基因表達(dá)研究、microRNA研究、基因組拷貝數(shù)鑒定、癌癥標(biāo)志物稀有突變檢測(cè)、致病微生物鑒定、轉(zhuǎn)基因成分鑒定、NGS測(cè)序文庫精確定量和結(jié)果驗(yàn)證等諸多方面也具有廣闊的應(yīng)用前景。

該技術(shù)是采用“分而治之”（divide and conquer）的策略，將一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)分配到大量微小的反應(yīng)器中，在每個(gè)反應(yīng)器中包含或不包含一個(gè)或多個(gè)拷貝的目標(biāo)分子（DNA模板），實(shí)現(xiàn)“單分子模板PCR擴(kuò)增”，擴(kuò)增結(jié)束后，通過陽性反應(yīng)器的數(shù)目“數(shù)出”目標(biāo)序列的拷貝數(shù)。

dPCR是PCR領(lǐng)域最激動(dòng)人心的創(chuàng)新之一，該技術(shù)可應(yīng)用于單細(xì)胞分析、罕見腫瘤等位基因檢測(cè)、產(chǎn)前診斷以及血液中游離腫瘤DNA、表觀遺傳學(xué)直接相關(guān)的DNA甲基化定量檢測(cè)、ChIP定量鑒定等眾多領(lǐng)域［18－32］。如果將PCR技術(shù)進(jìn)行分代的話，那么第一代PCR技術(shù)就是我們目前最常用的常規(guī)PCR了，它可通過凝膠電泳獲得定性結(jié)果。而曾經(jīng)風(fēng)靡全球的RTQ-PCR可稱為第二代PCR技術(shù)，它利用熒光試劑監(jiān)控?cái)U(kuò)增，來實(shí)現(xiàn)相對(duì)定量，在開展基因表達(dá)分析時(shí)，需要標(biāo)準(zhǔn)曲線或參考基因來協(xié)助定量。而dPCR則可謂是第三代PCR技術(shù)，它不再依賴Cq值或內(nèi)參基因，即可確定低至單拷貝的待檢靶分子的絕對(duì)數(shù)目，它是一種核酸分子絕對(duì)定量技術(shù)，主要采用當(dāng)前分析化學(xué)熱門研究領(lǐng)域的微流控或微滴化方法，將大量稀釋后的核酸溶液分散至芯片的微反應(yīng)器或微滴中，每個(gè)反應(yīng)器的核酸模板數(shù)少于或者等于一個(gè)。這樣經(jīng)過PCR循環(huán)之后，有一個(gè)核酸分子模板的反應(yīng)器就會(huì)給出熒光信號(hào)，沒有模板的反應(yīng)器就沒有熒光信號(hào)。根據(jù)相對(duì)比例和反應(yīng)器的體積，就可以推算出原始溶液的核酸濃度。它比RTQ-PCR更加靈敏、特異、精確，故日益得到廣泛的應(yīng)用。可應(yīng)用于：癌癥生物標(biāo)志物研究和拷貝數(shù)變異分析；病原體檢測(cè)；與NGS無縫對(duì)接，對(duì)二代測(cè)序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證；miRNA表達(dá)分析；單細(xì)胞基因表達(dá)分析；環(huán)境監(jiān)測(cè)；食品檢測(cè)［18－32］。Floren等［28］用dPCR法成功對(duì)肉類及肉制品進(jìn)行了品種鑒定和量化。日本科學(xué)家Miyake等［33］2013年對(duì)一對(duì)患有雷特氏綜合癥（rett syndrome，RTT）的同卵雙生雙胞胎進(jìn)行了基因組學(xué)以及表觀遺傳學(xué)的研究。文章對(duì)該雙胞胎姐妹（其中一個(gè)為非典型RTT，另一個(gè)為典型RTT）采用了第一代毛細(xì)管測(cè)序，二代測(cè)序、SNP 和CNV芯片、基因組DNA甲基化芯片、RTQ-PCR以及dPCR等分析方法，得出結(jié)論：是表觀遺傳學(xué)水平上而非基因組水平上的差異，導(dǎo)致了兩姐妹不同的臨床表現(xiàn)。表觀遺傳學(xué)上的差異也許主要源自X染色體失活。在對(duì)雙胞胎姐妹的CNV位點(diǎn)是否相同進(jìn)行確認(rèn)時(shí)，Miyake等首先采用CNV芯片的方法刪除8 195個(gè)位點(diǎn)的不同；然后采用NGS進(jìn)一步確認(rèn)，發(fā)現(xiàn)其中僅有29個(gè)CNV位點(diǎn)可能存在差異；使用更加準(zhǔn)確的dPCR平臺(tái)后，發(fā)現(xiàn)在這對(duì)姐妹中沒有存在CNV位點(diǎn)的差異，就遺傳背景而言兩者完全一致。在討論部分中，作者特別指出：需要對(duì)采用芯片或NGS得到的SNP／CNV位點(diǎn)的相關(guān)數(shù)據(jù)采用進(jìn)一步定量的分析。這篇文章正是采用了dPCR法進(jìn)行驗(yàn)證，并進(jìn)一步糾正了NGS的錯(cuò)誤數(shù)據(jù)。

3．3PCR基礎(chǔ)上的基因突變檢測(cè)技術(shù)

3．3．1擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng)／限制性核酸內(nèi)切酶（amplification refractory mutation system／restriction endonuclease，ARMS／RE）技術(shù)

ARMS／RE雙重鑒定法特別適用于種植前基因診斷（preimplantation genetic diagnosis，PGD）等需快速特異、準(zhǔn)確靈敏檢測(cè)的項(xiàng)目。此法是將ARMS［34－35］與RE巧妙結(jié)合，在設(shè)計(jì)3′端錯(cuò)配堿基的特異引物的同時(shí)引入酶切位點(diǎn)。有時(shí)一個(gè)堿基的錯(cuò)配不一定含有酶切位點(diǎn)，這時(shí)可根據(jù)限制酶的識(shí)別序列，人為設(shè)計(jì)成雙錯(cuò)配甚至三錯(cuò)配。

ARMS／RE將ARMS法和RE法合二為一，具有雙重鑒定的效能，即首先用ARMS法鑒定一次，然后再用RE法鑒定一次，故可大大提高鑒定的準(zhǔn)確率。中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室曾用該法用于軟骨發(fā)育不全的PGD研究并獲得成功［36］。但該法也有不足，其不足是往往需要花費(fèi)很多時(shí)間人為錯(cuò)配堿基才能找到酶切位點(diǎn)，且所用的內(nèi)切酶多數(shù)較罕見，成本較高，且酶易失活，保存期有限。

3．3．2DHPLC技術(shù)

DHPLC是一種高通量篩選DNA序列變異的技術(shù)，主要用來分析異質(zhì)性雙鏈結(jié)構(gòu)：（1）在不變性的溫度條件下，檢測(cè)并分離分子量不同的雙鏈DNA分子或分析具有長度多態(tài)性的片段；（2）在完全變性溫度條件下，可以區(qū)分單鏈DNA或RNA分子，適用于寡核苷酸探針合成純度分析和質(zhì)量控制；（3）在部分變性的溫度條件下，變異型和野生型的PCR產(chǎn)物經(jīng)過變性復(fù)性過程，不僅分別形成同源雙鏈，同時(shí)也錯(cuò)配形成異源雙鏈，根據(jù)柱子保留時(shí)間的不同將同源雙鏈和異源雙鏈分離，從而識(shí)別變異型［37－38］。

該技術(shù)可進(jìn)行基因突變檢測(cè)、SNP分析等方面的研究；可檢測(cè)出含有單個(gè)堿基的置換、插入或缺失的異源雙鏈片段；快速高效無毒經(jīng)濟(jì)；除了檢測(cè)已知突變還能檢測(cè)未知突變；自動(dòng)化程度高；其敏感性和特異性可達(dá)90%以上，明顯高于單鏈構(gòu)象多態(tài)性（single strand conformation polymorphism，SSCP）檢測(cè)技術(shù)。但該技術(shù)不能檢測(cè)純合突變，檢測(cè)純合突變需在PCR產(chǎn)物中加入野生型擴(kuò)增產(chǎn)物；不能確定突變的具體位點(diǎn)，也不能確定是哪種突變類型；儀器價(jià)格高，分離柱有一定的使用壽命，需定時(shí)更換；目前僅用于檢測(cè)200 bp～500 bp大小的DNA片段；引物二聚體、非特異擴(kuò)增產(chǎn)物以及與樣品堿基數(shù)類似的污染產(chǎn)物將會(huì)影響分析，需通過優(yōu)化PCR去除之；PCR產(chǎn)物濃度必須足夠大，否則會(huì)導(dǎo)致信噪比下降，分析結(jié)果的可靠性也會(huì)隨之下降［37－38］。

3．3．3HRM技術(shù)

HRM主要用于未知突變篩查。根據(jù)目標(biāo)DNA序列的長度、GC含量及堿基的互補(bǔ)性差異，利用HRM對(duì)樣品的基因型進(jìn)行分析，其分辨精度可達(dá)單個(gè)堿基的差異。由于每一段DNA都有其獨(dú)特的序列，因而在加熱變性時(shí)就會(huì)有獨(dú)特的溶解曲線形狀，它可以通過DNA分子緩慢升溫過程中飽和熒光染料熒光值的變化而得到具體顯現(xiàn)。如同DNA指紋圖譜一樣，具有很高的特異性、穩(wěn)定性和可重復(fù)性。根據(jù)它們獨(dú)特的溶解曲線，即突變片段與野生型片段熔解曲線的形狀和位置存在差異，就可以對(duì)不同的核酸片段進(jìn)行區(qū)分［39］。

該法在突變篩查中其便捷性、靈敏性與特異性均優(yōu)于DHPLC，并且檢測(cè)成本較低，耗時(shí)較少，是近年來發(fā)展起來的核酸分析技術(shù)。靈敏快速無毒高效，對(duì)已知和未知的突變都可檢測(cè)。但和DHPLC一樣，不能準(zhǔn)確檢測(cè)具體突變［39］。

3．3．4MLPA技術(shù)

針對(duì)基因內(nèi)每個(gè)待檢區(qū)域設(shè)計(jì)一對(duì)DNA探針。每個(gè)MLPA探針包括2個(gè)熒光標(biāo)記的寡核苷酸片段，一段引物序列和一段特異性雜交序列。在MLPA反應(yīng)中，2個(gè)寡核苷酸片段都與靶序列進(jìn)行雜交，之后使用連接酶連接2部分探針。連接反應(yīng)高度特異，只有當(dāng)2個(gè)探針與靶序列特異性序列完全互補(bǔ)，連接酶才能將2段探針連接成一條完整的核酸單鏈；反之，如果靶序列與探針序列不完全互補(bǔ)，即使只有一個(gè)堿基的差別，連接反應(yīng)也無法進(jìn)行。連接反應(yīng)完成后，用一對(duì)通用引物擴(kuò)增連接好的探針，每個(gè)探針擴(kuò)增產(chǎn)物的長度都是唯一的，范圍在130 bp～480 bp。最后，通過毛細(xì)管電泳分離擴(kuò)增產(chǎn)物，收集數(shù)據(jù)，軟件分析，得出結(jié)論。只有當(dāng)連接反應(yīng)完成，才能進(jìn)行隨后PCR擴(kuò)增并收集到相應(yīng)探針的擴(kuò)增峰，如果檢測(cè)的靶序列發(fā)生點(diǎn)突變或缺失、重復(fù)突變，那么相應(yīng)探針擴(kuò)增峰便會(huì)缺失、降低或增加，根據(jù)擴(kuò)增峰的改變就可判斷靶序列是否有拷貝數(shù)的異?；螯c(diǎn)突變存在［40－41］。

該法高效、特異，在一個(gè)PCR反應(yīng)中可以同時(shí)擴(kuò)增數(shù)十個(gè)探針的連接產(chǎn)物，可用40對(duì)～50對(duì)特異探針，一次性檢測(cè)40種～50種突變類型，可以檢測(cè)45個(gè)核苷酸序列拷貝數(shù)的改變，實(shí)現(xiàn)了高通量的缺失檢測(cè)。同時(shí)該技術(shù)所具有的相對(duì)定量能力還能對(duì)基因的重復(fù)進(jìn)行判斷。近年來，MLPA在技術(shù)與應(yīng)用上又有許多新的發(fā)展，如運(yùn)用化學(xué)合成法制備3′、5′探針，在基因甲基化檢測(cè)、基因表達(dá)水平分析、基因部分片段重復(fù)區(qū)域拷貝數(shù)分析及轉(zhuǎn)基因基因分型中獲得廣泛應(yīng)用，加上MLPA與基因芯片微陣列技術(shù)的結(jié)合，使得多重連接探針擴(kuò)增真正具備了高通量檢測(cè)能力［41］。但該法需要毛細(xì)管電泳裝置，試劑盒價(jià)格較高；只能檢測(cè)已知突變。

3．3．5蛋白截短測(cè)試法（protein truncation test，PTT）

本方法是從蛋白質(zhì)水平的變化來檢測(cè)基因突變，它主要檢測(cè)導(dǎo)致開放閱讀框架改變的堿基缺失或插入突變等。檢測(cè)時(shí)須提取細(xì)胞mRNA，將待測(cè)靶基因逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，所用逆轉(zhuǎn)錄引物含一段T7啟動(dòng)子和真核細(xì)胞翻譯起始序列，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在無細(xì)胞提取液中翻譯為相應(yīng)的蛋白質(zhì)。如果基因突變導(dǎo)致了開放閱讀框架的改變，那么合成的蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE分離時(shí)會(huì)出現(xiàn)比正常蛋白質(zhì)或長或短的蛋白產(chǎn)物［42－43］。

本法突變檢出率高，一次可處理大量的樣品，并可檢測(cè)4～5 kb片段的突變。但不能檢測(cè)不影響開放閱讀框架的突變，且需要抽提組織mRNA。另外，移碼突變?nèi)绻拷虻?′端或3′端，用聚丙烯酰胺凝膠電泳也無法檢測(cè)出，由差異剪切所形成的異構(gòu)體也會(huì)影響結(jié)果的分析。

3．4DNA chip技術(shù)

用于檢測(cè)已知突變，是90年代后發(fā)展的一項(xiàng)DNA分析新技術(shù)。按應(yīng)用的不同，基因芯片可分為：基因表達(dá)譜芯片和寡核苷酸芯片。按核酸探針的不同，可分為：寡核苷酸芯片和cDNA芯片。按介質(zhì)的不同，可分為：玻璃片、硅片、尼龍膜、陶瓷和微型磁珠等。按用途的不同，可分為：表達(dá)譜芯片、診斷芯片、測(cè)序芯片、毒理芯片和指紋圖譜芯片等。按點(diǎn)樣方法的不同，可分為光刻基因芯片、機(jī)械微型點(diǎn)樣基因芯片、液體噴射技術(shù)基因芯片等。按制備方法的不同，可分為：原位合成和直接點(diǎn)樣［38］。基因芯片技術(shù)集合了集成電路計(jì)算機(jī)、激光共聚焦掃描、熒光標(biāo)記探針和DNA合成等先進(jìn)技術(shù)，可用于基因定位、DNA測(cè)序、物理圖譜和遺傳圖譜的構(gòu)建等。在基因突變檢測(cè)方面也有廣闊的前景。DNA芯片技術(shù)將生物技術(shù)和信息技術(shù)有機(jī)結(jié)合，是今后基因診斷的發(fā)展方向和趨勢(shì)［44－46］。

該技術(shù)檢測(cè)信息高通量，自動(dòng)化程度高，一次可檢測(cè)眾多突變位點(diǎn)，具有很大的發(fā)展?jié)摿Γ瑢⒃诨蛲蛔儥z測(cè)中發(fā)揮非常重要的作用，可用于疾病臨床早期診斷和批量篩選，確定疾病亞型和選擇最佳治療方案；也可用于耐藥基因的篩選以及新藥的研發(fā)。PCR核酸診斷技術(shù)雖經(jīng)典，但難以滿足現(xiàn)今檢驗(yàn)、檢疫需求，而“微流控芯片技術(shù)”既含蓋微流體操作系統(tǒng)又滿足實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析功能。由于芯片“實(shí)驗(yàn)室”排污很少，故被稱作是一種“綠色”技術(shù)［45－46］。芯片技術(shù)雖然優(yōu)點(diǎn)眾多，但成本高，技術(shù)含量高，目前普及推廣還有一定難度。

3．5 DNA序列分析技術(shù)

DNA序列分析是一種非常重要的基因診斷技術(shù)，被稱為是基因診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。近10年來發(fā)展非常迅速，從第一代Sanger法測(cè)序開始，經(jīng)歷第二代的高通量測(cè)序技術(shù)，至今已發(fā)展到第三代——單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)。

關(guān)于1代～3代測(cè)序技術(shù)的原理、優(yōu)缺點(diǎn)、在基因診斷中的應(yīng)用以及3代測(cè)序技術(shù)特點(diǎn)的比較，詳見文獻(xiàn)［6］，本文不再贅述。

4　小結(jié)與展望

隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，憑借人體基因密碼預(yù)測(cè)相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)性和發(fā)展進(jìn)程，做到早檢測(cè)、早預(yù)防、早治療，基因診斷技術(shù)在臨床的應(yīng)用將有更加廣闊的前景。展望未來，我們可以預(yù)見：（1）染色體水平與基因水平的檢測(cè)將結(jié)合得更加緊密；（2）高通量、自動(dòng)化、低成本獲得更大發(fā)展；（3）PCR技術(shù)將以優(yōu)化反應(yīng)和拓展應(yīng)用為主，隨著反應(yīng)速度、延伸范圍和檢測(cè)成本的不斷優(yōu)化，PCR技術(shù)將繼續(xù)引領(lǐng)現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展；（4）無創(chuàng)性產(chǎn)檢將相當(dāng)普及，PGD也將進(jìn)入到一個(gè)更普及的階段；（5）群體篩查的項(xiàng)目將更多，技術(shù)手段將更高、更快捷、更準(zhǔn)確；（6）隨著儀器成本的降低、小型化，試劑、試劑盒的大量研發(fā)，個(gè)體化、自主化檢測(cè)程度將更加提高；（7）臨床與基礎(chǔ)研究結(jié)合將更加密切，研究成果將更加及時(shí)應(yīng)用于臨床診防治，轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)得到充分體現(xiàn)；（8）每個(gè)人一生的生老病死有望在胚胎早期就被解讀、破譯，疾病的預(yù)防有望得到更早期、更有效的控制；（9）可以為基因治療尋找更多新的治療靶點(diǎn)，從而促進(jìn)基因治療的迅猛發(fā)展。

參考文獻(xiàn)

[1]杜傳書.醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)(第3版)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社, 2014.

[2]傅松濱.醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)(第3版)[M].北京:北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社, 2013.

[3]OMIM Entry Statistics. Gene description[EB/OL]. http:// omim.org/statistics/entry, 2015-06-15/2015-06-17.

[4]方興東.基因診斷[EB/OL]. http://www.techcn.com.cn/ index.php doc-view-113399, 2009-04-06/2015-06-17.

[5]百度百科.基因診斷[EB/OL]. http://baike.baidu.com/ view/94960.htm func=retitle, 2015-03-11/2015-06-17.

[6]郭奕斌.基因診斷中測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用及優(yōu)缺點(diǎn)[J].遺傳, 2014,36(11):1121-1130.

[7]百度百科.復(fù)雜基因[EB/OL]. http://hanyu.iciba.com/ wiki/150455.shtml, 2014-05-24/2015-06-17.

[8]Liu D, Li J, Cao L, et al. Analysis of differentially expressed genes in two immunologically distinct strains of Eimeria maxima using suppression subtractive hybridization and dot-blot hybridization[J]. Parasit Vectors, 2014,7(1):259.

[9]曹振龍,郝江葉,周艷芬,等.利用SSH方法篩選與鑒定AC3基因缺失小鼠主要嗅覺表皮內(nèi)的差異表達(dá)基因[J].遺傳, 2014,36(6):574-583.

[10]Xu W, Li H, Wang R, et al. Differential expression of genes associated with the progression of renal disease in the kidneys of liver-specific glucokinase gene knockout mice[J]. Int J Mol Sci, 2013,14(3):6467-6486.

[11]Wang R, Gao H, Xu W, et al. Differential expression of genes and changes in glucose metabolism in the liver of liver-specific glucokinase gene knockout mice[J]. Gene, 2013,516(2):248-254.

[12]Ren HJ, Cui J, Yang W, et al. Identification of differentially expressed genes of yrichinella spiralis larvae after exposure to host intestine milieu[J]. Plos One, 2013,8(6): e67570.

[13]Jung J, Kim SJ, Lee KW, et al. Approaches to label-free flexible DNA biosensors using low-temperature solutionprocessed InZnO thin-film transistors [J]. Biosens Bioelectron, 2014,55:99-105.

[14]鄧朝陽,宋貴生,徐軍望,等.一種簡(jiǎn)單易行的重組方法——三引物PCR法[J].科學(xué)通報(bào), 2002,47(16):1247-1249.

[15]朱艷,陳永井,邱玉華,等. TP_PCR法構(gòu)建抗人CD28嵌合抗體雙啟動(dòng)子昆蟲桿狀病毒重組轉(zhuǎn)移載體[J].生物工程學(xué)報(bào), 2005,21(5):832-836.

[16]Chen YX, Liu H, Zhang WB, et al. A novel tri-primer PCR method (TP-PCR) for rapid construction of fpg gene[J]. Journal of Microbiological Methods, 2004, 56 (3):359-364.

[17]嚴(yán)昕,王均永,吳小末,等.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)原發(fā)性肝癌中hNTKL-BP1基因的表達(dá)[J].復(fù)旦學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2007,3:411-416.

[18]Baker M. Digital PCR hits its stride[J]. Nature Methods, 2012,9(6):541-544.

[19]Marx V. PCR: paths to sensitivity[J]. Nature Methods, 2014,11(3):241-245.

[20]Miotke L, Lau BT, Rumma RT, et al. High sensitive detection and quantitation of DNA copy number and single nucleotide variants with single colordroplet digital PCR [J]. Anal Chem, 2014,86(5):2618-2624.

[21]Coudray-Meunier C, Fraisse A, Martin-Latil S, et al. A comparative study of digital RT-PCR and RT-PCR for quantification of hepatitis a virus and norovirus inlettuce and water samples[J]. Int J Food Microbiol, 2015,201: 17-26.

[22]Kinugasa H, Nouso K, Tanaka T, et al. Droplet digital PCR measurement of HER2 in patients with gastric cancer[J]. Br J Cancer, 2015,112(10):1652-1625.

[23]Doi H, Takahara T, Minamoto T, et al. Droplet digital polymerase chain reaction (PCR) outperforms real-time PCR in the detection of environmental DNA from an invasive fish species[J]. Environ Sci Technol, 2015,49(9): 5601-5618.

[24]Zhu G, Ye X, Dong Z, et al. Highly sensitive droplet digital PCR method for detection of EGFR-activating mutations in plasma cell-free DNA from patients with advanced non-amall cell lung cancer [J]. J Mol Diagn, 2015,17(3):265-272.

[25]Hayden RT, Gu Z, Sam SS, et al. Comparative evaluation of three commercial quantitative cytomegalovirus standards by use of digital and real-time PCR[J]. J Clin Microbiol, 2015,53(5):1500-1505.

[26]Tanaka H, Yamamoto S, Nakamura A, et al. Hands-off preparation of monodisperse emulsion droplets using a poly (dimethylsiloxane) microfluidic chip for droplet digital PCR[J]. Anal Chem, 2015,87(8):4134-4143.

[27]Huang H, Li S, Sun L, et al. Digital detection of multiple minority mutants and expression levels of multiple colorectal cancer-related genes using digital-PCR coupled with bead-array[J]. Plos One, 2015,10(4):e0123420.

[28]Floren C, Wiedemann I, Brenig B, et al. Species identification and quantification in meat and products using droplet digital PCR (ddPCR)[J]. Food Chem, 2015,15; 173:1054-1058.

[29]Devonshire AS, Honeyborne I, Gutteridge A, et al. Highly reproducible absolute quantification of mycobacterim tuberculosis complex by digital PCR [J]. Anal Chem, 2015,87(7):3706-3713.

[30]Zhang BO, Xu CW, Shao Y, et al. Comparison of droplet digital PCR and conventional quantitative PCR for measuring EGFR gene mutation[J]. Exp Ther Med,

[31]2015, 9(4):1383-1388. Kinz E, Leiherer A, Lang AH, et al. Accurate quantitation of JAK2 V617F allele burden by array-based digital PCR[J]. Int J Lab Hematol, 2015, 37(2):217-224.

[32]Doi H, Uchii K, Takahara T, et al. Use of dropet digital PCR for estimation of fish abundance and biomass in enviromental DNA surveys [J]. Plos One, 2015,10(3): e0122763.

[33]Miyake K, Yang C, Minakuchi Y, et al. Comparison of genomic and epigenomic expression in monozygotic twins discordant for rett syndrome[J]. Plos One, 2013, 8 (6):e66729.

[34]Liu W, Hu T, Chen Y, et al. Development and validation of a tetra-primer amplification refractory mutation aystem-polymerase chain reaction combined with melting analysis-assay for clinical JAK2 V617F mutation detection[J]. Mol Diagn Ther, 2014,18(5):579-585.

[35]Cheng C, Zhou Y, Yang C, et al. Detection of rare point mutation via allele-specific amplification in emulsion PCR[J]. BMB reports, 2013,46(5):270-275.

[36]李榮,畢博文,沈曉婷,等.軟骨發(fā)育不全植入前遺傳學(xué)診斷的方法學(xué)研究[J]分子診斷與治療雜志, 2014,6 (6):372-377.

[37]Liu W, Smith DI, Rechtzigel KJ, et al. Denaturing high performance liquid chromatography (DHPLC) used in the detection of germline and somatic mutations[J]. Nucleic Acids Res, 1998,26(6):1396-1400.

[38]新浪博客. DHPLC變性高效液相色譜原理[EB/OL]. http://blog.sina.com.cn/s/blog_4d82e72b01000axl.html. 2007-07-22/2015-06-17.

[39]Reed GH, Kent JO, Wittwer CT. High-resolution DNA melting analysis for simple and efficient molecular diagnostics[J]. Pharmacogenomics, 2007,8(6):597-608.

[40]Schouten JP, McElgunn CJ, Waaijer R, et al. Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification[J]. Nucleic Acids Res, 2002,30(12):e57.

[41]胡曉,李汶,盧光琇.多重連接依賴性探針擴(kuò)增技術(shù)及其應(yīng)用進(jìn)展.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展[J]. 2010,10(2):362-365.

[42]Necker J, Kovac M, Attenhofer M, et al. Detection of APC germ line mosaicism in patients with de novo familial adenomatous polyposis: a plea for the protein truncation test[J]. J Med Genet, 2011,48(8):526-529.

[43]新浪博客.瞬時(shí)基因表達(dá)技術(shù)[EB/OL]. http://blog.sina. com.cn/s/blog_4e0c3abb010096ph.html, 2008 -05 -09/ 2015-06-17.

[44]中華論文網(wǎng).概述基因芯片技術(shù)原理等[EB/OL]. http:// www.zhonghualw.com/xumushouyi/net20120209063854 3029.html, 2012-02-09/2015-06-17.

[45]好搜問答.基因芯片技術(shù)[EB/OL]. http://wenda.so.com/q/ 1378647361064338 src=140, 2013-09-08/2015-06-17.

[46]滕牧洲,馬文麗.走進(jìn)醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中的基因芯片技術(shù)[J].分子診斷與治療雜志, 2014,6(6):361-365.

?綜述?

Research advance in genetic diagnosis of monogenic inherited diseases

GUO Yibin1★, LIANG Yujing2, GUO Dongwei3
(1. Department of Medical Genetics, Zhongshan School of Medicine, Sun Yat-sen University, Guangzhou, Guangdong, China, 510080; 2. Amateur Team, Department of Medical Genetics, Clinical Medicine (Grade 2011), Sun Yat-sen University, Guangzhou, Guangdong, China, 510080; 3. Clinical Medicine (Grade 2014), Medical College, Xiamen University, Xiamen, Fujian, China, 361102)

［ABSTRACT］Monogenic diseases are caused by inheritance of single mutated gene, but the type of the diseases are diversified depending on the type and locus of genetic mutation inherited. While conventional laboratory methods may contribute to an initial identification, a definitive diagnosis and classification of these inherited disorders often need molecular/genetic testing. In the past twenty years, diagnostic techniques for the genetic disorders have rapidly advanced, leading to the invention of many laboratory tests for the detection of genetic disorders. In this article, we review the recent advance in the diagnostic modalities for the genetic disorders, in hope of setting light on improvement of the clinical diagnosis and prevention.

[KEY WORDS]Monogenic disease; Gene diagnosis; Technology and method

通訊作者：★郭奕斌，E-mail：aguoabin＠qq．com

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（30772069）；閩粵橫向科研基金（71010025）