趙世君孫保亮李月春王寶軍徐寧

·綜述·

脈絡叢上皮細胞及其神經(jīng)保護作用

趙世君1孫保亮2李月春1王寶軍1徐寧3

將神經(jīng)營養(yǎng)因子和生長因子注射到腦損傷區(qū)域治療神經(jīng)系統(tǒng)變性病和急性腦損傷被證實有效，因此向腦損傷區(qū)域移植能夠持續(xù)釋放治療因子的細胞可能成為一種新興的治療腦損傷的方法。脈絡叢上皮細胞（CPECs）是構(gòu)成脈絡叢的主要結(jié)構(gòu)成分，不僅參與合成腦脊液和構(gòu)成血腦脊液屏障，而且能夠分泌多種生物活性肽，包括神經(jīng)營養(yǎng)因子，生長因子以及轉(zhuǎn)運蛋白等。因此移植CPECs可能成為神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有前景的治療方法。大量的文獻已經(jīng)證實，不管是體外研究還是在體水平，CPECs治療能夠促進神經(jīng)元生長和增殖，對多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病產(chǎn)生療效，具有神經(jīng)保護作用。本文將對CPECs的神經(jīng)保護作用做一綜述，便于今后更好開展工作。

脈絡叢； 上皮細胞； 神經(jīng)生長因子類； 移植

臨床實踐中神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有難治性的特點，不論是急性發(fā)作的腦血管病，還是神經(jīng)系統(tǒng)慢性變性疾病，有效的治療方法捉襟見肘。這是因為中樞神經(jīng)系統(tǒng)本身結(jié)構(gòu)特殊，與血液等體液環(huán)境之間存在屏障結(jié)構(gòu)，處于相對隔離的區(qū)域，因此一般藥物難以通過血腦屏障進入中樞系統(tǒng)而達到治療作用；而且構(gòu)成中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元再生能力差，使得神經(jīng)功能的重建更加困難。因此建立一種有效的治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的方法，一直是科學家努力的方向。神經(jīng)修復學是近年興起的一門新興學科，以中樞神經(jīng)可修復理論為基礎(chǔ)[1]，而細胞移植治療可能成為該學科的核心的技術(shù)，2016年發(fā)表了《中國神經(jīng)修復細胞治療臨床應用指南》，為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的細胞治療提出臨床上的理論指導[2]，細胞移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病成為極具前景的治療方法。

脈絡叢是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一部分，位于腦室，居于整個系統(tǒng)的中心位置。脈絡叢上皮細胞（choroid plexus epithelial cells，CPECs）是脈絡叢主要的結(jié)構(gòu)和功能成分，發(fā)揮多種生理功能，且可能參與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理過程[3-7]。因此隨著對脈絡叢及其上皮細胞研究的深入，CPECs替代治療或補償治療成為可能，現(xiàn)將CPECs與神經(jīng)保護方面的研究做一回顧，期望能為今后更好地開展這

方面工作提供幫助。

一、CPECs概述

（一）脈絡叢上皮的基本結(jié)構(gòu)

在腦室系統(tǒng)內(nèi)室管膜上皮細胞，微血管和間質(zhì)共同構(gòu)成脈絡組織，然后反復分支成叢突入腦室，簇集形成脈絡叢[8]。構(gòu)成脈絡叢的室管膜上皮細胞與腦室壁的室管膜上皮細胞在結(jié)構(gòu)與功能上存在差異，因此這部分室管膜上皮細胞稱為CPECs。CPECs是脈絡叢的主要結(jié)構(gòu)成分，此外還含有富含有窗毛細血管的基質(zhì)[9]（圖1）。CPECs具有多種轉(zhuǎn)運通道因此具有轉(zhuǎn)運功能，而且富含線粒體及吞飲小泡。上皮細胞頂端具有微絨毛，主要的功能是分泌腦脊液。相鄰上皮細胞的頂端形成緊密連接，是血腦脊液屏障的主要結(jié)構(gòu)，僅可通過分子量較小的物質(zhì)。（圖2）

圖1 脈絡叢主要結(jié)構(gòu)

圖2 鼠脈絡叢電鏡結(jié)構(gòu)[10]

（二）CPECs的生理功能

脈絡叢的主要功能是分泌腦脊液，發(fā)揮功能的主要成分是CPECs。一般認為70﹪~ 85﹪的腦脊液由脈絡叢產(chǎn)生。CPECs的結(jié)構(gòu)特征決定血液中的離子或分子是主動運輸，水是被動運輸。腦脊液先經(jīng)過血管內(nèi)皮細胞的窗孔和細胞間隙進入基質(zhì)，再經(jīng)過CPECs側(cè)面和底面進入上皮細胞，再由胞質(zhì)內(nèi)的小泡將其送到細胞頂端的微絨毛。CPECs分泌時，微絨毛內(nèi)的吞飲小泡破裂將這些物質(zhì)排入腦室，形成腦脊液[11]。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)存在三大屏障，血-腦屏障，血-腦脊液屏障，腦脊液-腦屏障。CPECs及其緊密連接是構(gòu)成血腦脊液屏障的主要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，通過機械阻擋，異生性溶解，主動運輸機制發(fā)揮屏障作用。水，氣體，脂溶性物質(zhì)可以從血液中自由進入腦脊液，大分子物質(zhì)，離子等不能直接進入腦脊液。

近年提出腦-腦脊液神經(jīng)體液通路，是指由腦脊液中介的神經(jīng)體液通路，屬于神經(jīng)體液調(diào)節(jié)的一部分[12]。主要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是接觸腦脊液的神經(jīng)元、室管膜細胞及腦-腦脊液屏障的選擇性。CPECs屬于特化的室管膜上皮細胞，具有內(nèi)分泌功能，參與這條通路。CPECs含有多種受體[13]（表1），可以接受各種因子的調(diào)控；同時在CPECs中發(fā)現(xiàn)多種生物活性多肽[13]，包括神經(jīng)營養(yǎng)因子（表2），可以分泌到腦脊液中，對自身或鄰近的靶細胞，或通過腦脊液循環(huán)到達遠端的靶細胞產(chǎn)生作用，起到自分泌或旁分泌的生理功能。

表1 脈絡叢上皮細胞含有的受體及其配體

研究認為側(cè)腦室壁上的室管膜和室管膜下的區(qū)域是干細胞的來源[14]，CPECs作為這些結(jié)構(gòu)的延伸，同樣具有顯著的神經(jīng)再生能力。Li等[15]證明，CPECs在腦卒中鼠模型中發(fā)生增殖和分化。大鼠大腦中動脈結(jié)扎后，溴脫氧尿苷免疫反應性增加（作為神經(jīng)細胞核抗原），膠質(zhì)纖維酸性蛋白免疫反應性也增加，這些反應提示細胞發(fā)生了增生與分化。移植研究也表明，當CPECs移植到中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷區(qū)域，CPECs具有分化的能力。Kitada等[16]從綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基

因小鼠分離得到CPECs，并把它移植到同種鼠類制造的脊髓損傷模型。1周后，免疫組化提示，綠色熒光蛋白陽性移植細胞呈現(xiàn)出對神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白陽性反應。2周后，免疫電鏡顯示，綠色熒光蛋白陽性移植細胞（對神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白呈現(xiàn)出免疫組化反應陽性）包含了大量神經(jīng)絲束（一種星形膠質(zhì)細胞的形態(tài)學結(jié)構(gòu)），并與宿主細胞接觸，這個結(jié)構(gòu)和生物學特性是星形膠質(zhì)細胞所有。此外，CPECs在缺血性損傷后表現(xiàn)出自我修復的能力，因為CPECs能夠分泌多種生長因子和多肽，而且CPECs上具有的多種生長因子受體，通過旁分泌和自分泌的機制，損傷在營養(yǎng)因子的作用得到恢復[17]。

表2 脈絡叢上皮細胞含有多肽

此外，CPECs還具有解毒功能，中和有毒物質(zhì)，防御急性中毒損傷；還能監(jiān)視大腦的免疫和化學狀態(tài)，以及調(diào)節(jié)腦脊液與大腦之間的物質(zhì)交換，使得大腦所處的細胞外環(huán)境穩(wěn)定等功能。

二、CPECs的原代培養(yǎng)與鑒定方法

CPECs的原代培養(yǎng)始于20世紀70年代[18]。最初體外CPECs及細胞系的培養(yǎng)多應用于毒理學的研究[19-20]。目前應用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病模型的CPECs主要來源于鼠，因此本文主要介紹鼠CPECs的原代培養(yǎng)與鑒定。

（一）CPECs的原代培養(yǎng)

1.分離與培養(yǎng)：動物實驗中多選擇成年鼠采集脈絡叢組織。成年鼠脈絡叢組織發(fā)育成熟，結(jié)構(gòu)較致密，采集后需要鏈蛋白酶或胰蛋白酶進一步消化組織以分離細胞。在培養(yǎng)過程中，主要混雜的細胞有血細胞和成纖維細胞，血細胞不貼壁，經(jīng)過2次換液后，紅細胞基本消失；而成纖維細胞貼壁時間早于CPECs約6 ~ 12 h[21]，因此可以根據(jù)這種貼壁速度的差異去除成纖維細胞，但容易損失上皮細胞。去除這兩種細胞可以得到高純度的CPECs。細胞長成一般需要7到14 d。

也有文獻報道[22]選用出生1 d的新生鼠，容易得到高純度的原代細胞。首先因為新生鼠脈絡叢組織較疏松，僅需要機械分離而不需要酶消化組織，避免了細胞污染或損傷；其次，新生鼠脈絡叢組織混雜的細胞特別少，不需要特意去除成纖維細胞液就可以得到純度高的原代細胞；再次，新生鼠CPECs活性高，容易成活及增殖。但是缺點是新生鼠發(fā)育不完全，脈絡叢組織少，取材難。

2.培養(yǎng)液：目前普遍使用的培養(yǎng)液配制方案為：89﹪改良杜氏伊格爾培養(yǎng)基，加上10﹪的胎牛血清，并含有1﹪的青霉素和鏈霉素和10 mg/ml的內(nèi)皮生長因子。

（二）CPECs的鑒定

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白在CPECs特異性表達，含量特別豐富[23-25]，因此實驗中常使用甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白抗體進行免疫組織化學染色作為CPECs鑒定的方法（圖3）。此外還可以通過HE染色以及電子顯微鏡觀察CPECs形態(tài)學特點。

圖3 免疫組織化學法顯示原代培養(yǎng)的CPECs[22]

三、脈絡從上皮細胞與神經(jīng)保護

CPECs發(fā)揮多種基本的生理功能，維持神經(jīng)系統(tǒng)處于相對的穩(wěn)態(tài)，提示CPECs具有神經(jīng)保護功能。關(guān)于CPECs神經(jīng)保護的研究目前僅限于在實驗室，臨床上尚未開展。本文就CPECs與神經(jīng)保護的研究分為體外研究和在體研究兩部分進行介紹。

（一）體外實驗

體外培養(yǎng)的CPECs具有顯著的神經(jīng)保護功能。Kimura等[26]將大鼠海馬神經(jīng)元與CPECs共培養(yǎng)，觀察海馬神經(jīng)元的生長和存活情況，經(jīng)過比較得出結(jié)論，CPECs與星

形膠質(zhì)細胞一樣能夠明顯促進海馬神經(jīng)元突起的生長，維持神經(jīng)元的存活。免疫組織化學分析發(fā)現(xiàn)CPECs表達層粘連蛋白和纖連蛋白，這些分子有助于海馬神經(jīng)突起的延伸；在細胞表面檢測到神經(jīng)元細胞黏附分子和神經(jīng)元鈣粘蛋白，這些分子分布于海馬神經(jīng)元突起與施萬細胞和軸突與軸突之間，有助于海馬神經(jīng)突起向CPECs細胞表面延伸而得以生長。此外，研究者發(fā)現(xiàn)海馬神經(jīng)元能夠在CPECs的條件培養(yǎng)基（CPECs被乙醇滅活）中短暫生長并存活，考慮可能是因為CPECs分泌的神經(jīng)營養(yǎng)因子及細胞膜表面的分子促進了海馬的生長。因為研究已經(jīng)證實，CPECS可以分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子[27-30]。

Kimura等[26]沒有對條件培養(yǎng)基（培養(yǎng)CPECs的上清液）做更深入的研究，因此之后有科學家做了進一步工作。Watanabe等[31]將幼鼠的海馬神經(jīng)元培育在CPECs的條件培養(yǎng)基中得到良好的生長。對培養(yǎng)基的成分經(jīng)過仔細分析，發(fā)現(xiàn)能夠促進神經(jīng)細胞存活的主要是分子量大于50 kDa的多肽或蛋白，而不是微小的化學物質(zhì)。并且鑒定出4種CPECs含有的生長因子。該研究在體外更進一步證實CPECs的神經(jīng)保護作用。

Aliaghaei等[32]的體外實驗進一步證實了CPECs強大的神經(jīng)保護作用，并探討了保護機制。以嗜鉻細胞瘤類神經(jīng)元細胞模擬神經(jīng)元并給予雙氧水造成氧化應激損傷，給予條件培養(yǎng)基干預，結(jié)果顯示可以明顯抑制氧化損傷引起的細胞凋亡。首先從細胞形態(tài)學觀察，治療組嗜鉻細胞瘤類神經(jīng)元細胞軸突明顯生長，認為是CPECs條件培養(yǎng)中含有的物質(zhì)起到主要作用，一是層粘連蛋白和纖連蛋白為軸突的延伸提供支撐作用，二是一些細胞因子如甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白[33]、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)生長因子、成纖維細胞生長因子2和血管內(nèi)皮生長因子可以起到營養(yǎng)細胞，促進細胞軸突延伸的作用，并且反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應證實在CPECs中存在上述因子mRNA的表達。其次，眾所周知核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）是細胞防御多種應激損傷的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，是誘導II相酶基因表達的必需調(diào)節(jié)因子，該研究用蛋白質(zhì)印跡（western blotting）等方法鑒定認為CPECs發(fā)揮抗氧化應激損傷的主要機制，主要是激活了Nrf2/ 抗氧化反應原件（antioxidant response elements，ARE）通路，Nrf2在應激狀態(tài)下易位進入細胞核，激活ARE相關(guān)因子，如γ谷氨酸半胱氨酸能夠?qū)够钚匝醮氐亩拘宰饔?，阻止自由基的產(chǎn)生（圖4）。同時CPECs的分泌物也增加了超氧化物氣化酶和谷胱甘肽的活力，提高了抗氧化損傷的能力。此外結(jié)合對抗凋亡因子Bcl2和促凋亡因子Bax和caspase-3的檢測結(jié)果，也證實了CPECs的抗凋亡作用。

（二）CPECs在動物模型的應用

體外實驗證實了CPECs具有神經(jīng)保護作用，因此CPECs在動物模型的應用引起科學家的興趣。在體實驗研究主要借助移植方法。同種移植應用在腦卒中，神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病等動物模型，顯示出良好的神經(jīng)保護作用。有時為了避免或減輕移植引起的免疫排斥反應，尤其在異種移植之間，可借助藻酸鹽膠囊化CPECs，實現(xiàn)異種間移植，也發(fā)揮出CPECs的神經(jīng)修復功能。

圖4 Nrf2/ ARE通路

1.對脊髓損傷的保護作用及機制：Ide等[34]首次成功地將CPECs移植到脊髓損傷模型，顯示出明顯的神經(jīng)修復能力，這也是CPECs移植的首次嘗試。將CPECs移植到受損傷的脊髓后索，觀察到CPECs在損傷區(qū)域生存良好，而且損傷的脊髓細胞發(fā)生明顯的軸突生長，而且這種良性的作用能持續(xù)10個月之久。該團隊的另一個發(fā)現(xiàn)如上述提到，CPECs還具有分化成為膠質(zhì)細胞的能力，這對于脊髓功能的重建具有意義。

最近Kanekiyo等[35]將CPECs應用到脊髓挫傷模型當中，同樣觀察到CPECs移植后促進了脊髓軸突的再生，改善了脊髓功能。作者認為CPECs可能通過分泌某些分子物質(zhì)進入腦脊液，促進了損傷脊髓軸突的再生，同時也阻止了脊髓損傷后的神經(jīng)變性。

2.對缺血性腦卒中的保護作用及機制：脈絡叢在脊髓模型移植的成功，引起科學家的注意。Borlongan等[36]將鼠CPECs膠囊化后移植到鼠MCAO（大腦中動脈阻塞）模型當中，治療組梗塞面積明顯縮小，神經(jīng)功能損傷程度也小于對照組，顯示出CPECs顯著的抗缺血，腦保護作用。這是CPECs首次應用于腦卒中模型，并且取得了良好的治療作用。該團隊幾乎在同時做了另一項研究，將豬的脈絡叢細胞膠囊化后移植到鼠MCAO模型，同樣縮小了梗塞面積，改善了神經(jīng)功能，這為異種之間的移植開啟新的希望。關(guān)于腦保護的機制，作者認為脈絡叢細胞可以分泌多種具有治療作用的物質(zhì)，如神經(jīng)營養(yǎng)因子，生長因子等，具有對抗腦缺血的作用。

另一項CPECs應用在腦卒中的研究同樣證實，CPECs具有抗急性腦缺血的作用，減少了神經(jīng)元的死亡，并且對發(fā)

病機制做了更進一步的探討。借助免疫組織化學法、PCR等技術(shù)，認為CPECs移植后促進了抗凋亡因子的表達，如CREB和bcl-2水平明顯增高，并且抑制了促炎因子IL-1和TNF-α以及氧化應激因子iNOS的表達，通過以上途徑抑制神經(jīng)元凋亡，發(fā)揮腦保護作用[37]。

3.對神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病的保護作用及機制：CPECs移植對急性腦血管病顯現(xiàn)出神經(jīng)保護作用，對于神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，如阿爾茨海默病，亨廷頓病（huntington Disease，HD）等，科學家也在嘗試脈絡叢細胞在這些疾病模型中的作用。Borlongan等[38]首次將豬的CPECs膠囊化后移植到鼠HD模型，在治療組當中喹啉酸誘導的紋狀體梗塞面積明顯縮小，體重和運動功能均有改善，作者認為可能是CPECs分泌的營養(yǎng)性因子發(fā)揮了神經(jīng)保護作用，因為之前的研究顯示向HD模型投遞神經(jīng)營養(yǎng)因子具有改善HD癥狀的療效[39]。之后該團隊還做了一系列的動物實驗[40-41]將豬的脈絡叢膠囊化后移植到猴HD模型，或是將鼠的脈絡叢膠囊化后移植到鼠HD模型，同樣顯示了脈絡叢的保護作用，更進一步證明了CPECs對HD模型的神經(jīng)修復功能。

阿爾茨海默病也是常見的神經(jīng)系統(tǒng)變性病，臨床上對于該疾病的治療缺乏有效的手段。Aliaghaei等[42]將CPECs移植到阿爾茨海默病模型探討對其的影響。結(jié)果顯示治療組認知功能明顯好轉(zhuǎn)，因為CPECs移植到海馬損傷區(qū)域后抑制了神經(jīng)炎性反應，提高了抗氧化應激能力，從而減少了海馬神經(jīng)元的凋亡，改善了模型的認知功能。免疫組織化學等方法鑒定神經(jīng)膠質(zhì)細胞以及其增生和遷移等反應，顯示Aβ誘導海馬損傷后神經(jīng)膠質(zhì)細胞增生反應變?nèi)?，小膠質(zhì)細胞的遷移反應變少，這提示神經(jīng)炎性反應被抑制，有利于神經(jīng)細胞的再生，因為有文獻報道CPECs分泌的生長因子如轉(zhuǎn)化生長因子-β，可以通過清除Aβ抑制膠質(zhì)細胞的增生和遷移[43]。測定氧化還原酶活性增加，提示CPECs提高了抗氧化損傷的能力，作者還認為CPECs分泌的生長因子，如NGF與Nrf2/ARE通路及其下游的因子存在相互聯(lián)系，發(fā)揮抗氧化損傷作用[44]。此外還有文獻證實腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子，VEGF，和NGF在除Nrf2之外的通路中調(diào)節(jié)氧化應激反應，發(fā)揮抗氧化損傷功能[45-47]。利用蛋白免疫印跡法同時證實，Caspase-3在治療組表達減少。對凋亡細胞的原位末端標記法鑒定也證實治療組海馬神經(jīng)元凋亡明顯減少。

目前，不論是CPECs的體外實驗，還是移植到動物模型的實驗，均能夠證實脈絡叢細胞具有神經(jīng)保護作用。但是其神經(jīng)修復的機制目前的研究還不夠充分和具體，今后應該把握目前先進的實驗室技術(shù)，對CPECs在促進神經(jīng)再生，抗凋亡，抗氧化應激，抗炎等方面的分子機制做詳細的研究。此外，關(guān)于人脈絡叢細胞研究的相關(guān)資料較少，今后也可以開展脈絡叢細胞在細胞水平或模型中的應用研究，為脈絡叢細胞的臨床應用提供基礎(chǔ)理論。相信隨著對CPECs更加細致，深入的研究，對于其在臨床的應用將成為可能，為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療帶來新的希望。

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Choroid plexus epithelial cells and its neuroprotective effects

Zhao Shijun1, Sun Baoliang2,Li Yuechun1, Wang Baojun1, Xu Ning3.1Department of Neurology,3Hematology, Baotou Central Hospital, Baotou 014040, China;2Key Lab of Cerebral Microcirculation in Universities of Shandong, Taishan Medical University, Taian 271000, China

Treatment with neurotrophins and growth factors through injection to brain lesion sites has been demonstrated effective for neurodegenerative disease and acute brain injury. Transplantation of viable neurotrophin-producing cells to the brain lesion sites represents one of the most promising strategies for brain injury due to the continuous production of therapeutic factors. Choroid plexus epithelial cells (CPECs), an important component of choroid plexus, not only involve in the cerebrospinal fluid (CSF) synthesis and blood-brain barrier constitution, but also secret a variety of bioactive peptides, such as neuropeptides, growth factors, and cytokines, which exhibit therapeutic potential against brain injury. Accumulated evidences have demonstrated that CPECs can promote the growth and proliferation of neurons in vitro and in vivo, and has neuroprotective effects on a variety of neurological diseases. Hence, we will review the neuroprotective effects of CPECs, so as to facilitate the future work.

Choroid plexus； Epithelial cells； Nerve growth factors； Transplantation

2016-08-11）

（本文編輯：蔡曉珍）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2016.05.011

014040 包頭市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科1，血液內(nèi)科3；271000泰安 泰山醫(yī)學院腦微循環(huán)實驗室2

孫保亮，Email：blsun88@163.com

趙世君，孫保亮，李月春，等. 脈絡叢上皮細胞及其神經(jīng)保護作用[J/CD].中華細胞與干細胞雜志:電子版, 2016, 6(5):321-326.