楊帆 陳卓 龐洪全

·論著·

胃癌組織中干細(xì)胞標(biāo)志物性別決定相關(guān)基因簇2以及外周血樹突細(xì)胞功能對胃癌預(yù)后的影響

楊帆 陳卓 龐洪全

目的 分析胃癌組織中干細(xì)胞標(biāo)志物性別決定相關(guān)基因簇2（Sox2）以及外周血樹突細(xì)胞（DC）功能對預(yù)后的影響，為胃癌患者預(yù)后的早期評估提供參考依據(jù)。方法 選取70例胃癌患者及50名健康受試者，使用實(shí)時(shí)熒光定量多重聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測胃癌組織、正常胃黏膜Sox2表達(dá)，并對其外周血DC進(jìn)行檢測。比較兩組受試者及不同病理指標(biāo)胃癌患者間上述指標(biāo)間差異，應(yīng)用受試者工作特征曲線（ROC）分析Sox2及DC對患者預(yù)后的診斷價(jià)值。應(yīng)用t檢驗(yàn)和ROC曲線分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果 胃癌組織Sox2 mRNA相對表達(dá)量顯著低于正常胃黏膜組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P = 0.002）；患者組外周血DC/PBMC顯著低于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P = 0.013）。不同TNM分期、細(xì)胞分化程度、腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)胃癌患者腫瘤組織Sox2、DC計(jì)數(shù)、DC/PBMC表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P = 0.006，0.011，0.007，0.000）。Sox2 mRNA表達(dá)和DC計(jì)數(shù)降低預(yù)測患者3年病死的AUC分別為0.877、0.935，P = 0.000，0.000，均可有效預(yù)測患者預(yù)后。結(jié)論 胃癌組織中Sox2表達(dá)、DC計(jì)數(shù)降低是胃癌患者預(yù)后不良的預(yù)測因子。

胃腫瘤； 干細(xì)胞； 生物學(xué)標(biāo)記； 多基因族； 樹突細(xì)胞； 預(yù)后

胃癌是我國常見的消化道惡性腫瘤之一，但我國胃癌的早期診斷率卻處于較低水平，約有60﹪~ 80﹪的患者確診時(shí)已處于中晚期，預(yù)后較差、病死率較高[1]。腫瘤侵襲周圍組織是導(dǎo)致胃癌患者預(yù)后較差的主要原因，因此，及早明確腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移狀態(tài)，是評估患者預(yù)后、指導(dǎo)干預(yù)策略、改善患者生存質(zhì)量的關(guān)鍵[2]。作為一種胃發(fā)育特異性轉(zhuǎn)錄因子，性別決定相關(guān)基因簇2（sex determining region Y-box 2，Sox2）在胃器官發(fā)展的全過程中均扮演了重要角色，其異常表達(dá)可能導(dǎo)致胃黏膜上皮細(xì)胞分化穩(wěn)態(tài)喪失、腫瘤發(fā)生；樹突細(xì)胞（dendritic cell，DC）是機(jī)體唯一可激活初始型T淋巴細(xì)胞的抗原提呈細(xì)胞，在腫瘤免疫中亦占據(jù)了重要地位[3]。為明確上述2項(xiàng)指標(biāo)對胃癌患者預(yù)后的影響，本文就達(dá)州市中心醫(yī)院消化內(nèi)科2015年1月至2015年12月診治的70例胃癌患者及50名健康受試者進(jìn)行了對照研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

資料與方法

一、一般資料

選取2015年1月至2015年12月診治的70例胃癌患者，納入患者組。男41例，女29例，年齡41 ~ 73歲，中位年齡（63±4）歲，正常組男30例，女20例，年齡39 ~ 71歲，中位年齡（63±4）歲，兩組受試者性別、年齡等一般臨床資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），具有可比性。選取標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)病理學(xué)檢查確診胃癌[4]；（2）接受手術(shù)治療，術(shù)后留取病理標(biāo)本及正常胃黏膜組織；（3）隨訪及生存時(shí)間統(tǒng)計(jì)完整。排除合并糖尿病、自身免疫性疾病、造血系統(tǒng)疾病、其他惡性腫瘤或有惡性腫瘤病史者。并選取同期50名健康體檢患者，均經(jīng)病史檢查、體格檢查、影像學(xué)檢查明確身體狀況良好，納入正常組。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，受試者均知情同意并簽字確認(rèn)。

試劑與設(shè)備：組織總DNA提取試劑盒（美國Ambion公司），Revert First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（加拿大Fermentas公司），SYBR Green/ROX qPCR Master Mix（2×）熒光定量PCR試劑盒（加拿大Fermentas公司），ABI 7500熒光定量PCR儀（美國ABI公司），兔抗人Sox2多克隆抗體、兔抗人OCT4單克隆抗體（美國Abcan公司）。

二、方法

（一）標(biāo)本采集

1.組織標(biāo)本：70例胃癌患者均接受手術(shù)治療，將術(shù)中切除的胃癌標(biāo)本于離體30 min內(nèi)，在嚴(yán)格無菌條件下取其腫瘤邊緣5 cm處正常胃黏膜組織，并留取未壞死的癌組織，將其置于1.5 ml EP管中（EP管不含DNA或RNA酶），置入液氮中，而后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱中，統(tǒng)一保存，待測。

2.血液標(biāo)本：于受試者入組次日清晨，抽取其空腹肘靜脈血5 ml，置于EDTA抗凝管中，而后轉(zhuǎn)入4℃冰箱中，統(tǒng)一保存，待測。

（二）標(biāo)本檢測

1. Sox2檢測[5]：設(shè)計(jì)Sox2基因特異性引物，引物序列（退火溫度為56℃）：Sox2基因上游引物：5'-CGAGATAAACATGGCAATCAAT-3'，下游引物：5'-ATTCAGCAAGAAGCCTCTCCTT-3'，產(chǎn)物：85bp；內(nèi)參為GAPDH基因，上游引物：5'-GTGGAC CTGACCTGCGTCT-3'，下游引物：5'-GGAGGAGT GGGTGTCGCTGT-3'，產(chǎn)物：151 bp。提取胃癌組織及正常胃黏膜組織總RNA，應(yīng)用紫外分光光度計(jì)測量其260 nm、280 nm吸光度（A）值，若A（260）/A（280）低于1.8則提示提取物中存在蛋白，需應(yīng)用氯仿重新提純。將提純完畢的RNA樣品置于-70℃冰箱中保存，使用SYBR Green嵌合熒光法對目的基因、內(nèi)參基因?qū)嵤U(kuò)增，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄——實(shí)時(shí)熒光定量多重聚合酶反應(yīng)（RT-qPCR）檢測組織Sox2表達(dá)，反應(yīng)體系及反應(yīng)條件參照試劑盒說明書設(shè)置。Sox2檢測結(jié)果分析[6]：使用2-△△Ct處理PCR數(shù)據(jù)，其中Ct為各反應(yīng)管內(nèi)熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，樣本量表達(dá)水平與閾值呈負(fù)相關(guān)，故Ct值增加提示樣本量表達(dá)水平降低?！鰿t=CtSox2-CtGADPH內(nèi)參基因上游引物，△△Ct=患者組△Ct-正常組△Ct，以2-△△Ct表示觀察組相對與對照組的Sox2信使RNA（messenger RNA，mRNA）表達(dá)倍數(shù)。

2.外周血DC檢測[7]：以小鼠同型IgG染色為陰性對照，參照文獻(xiàn)方法對兩組受試者外周血DC水平進(jìn)行檢測，并取100 μl血樣，運(yùn)用Ficoll對外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，

PBMC）進(jìn)行分離，獲取DC計(jì)數(shù)并計(jì)算DC/PBMC比值。

（三）分析指標(biāo)

比較胃癌組織與正常胃黏膜Sox2表達(dá)差異、患者組與正常組受試者外周血DC計(jì)數(shù)差異，并比較不同病理特點(diǎn)胃癌患者胃癌組織Sox2表達(dá)、DC計(jì)數(shù)差異，應(yīng)用受試者工作特征曲線（ROC）及曲線下面積（AUC）分析Sox2表達(dá)、DC計(jì)數(shù)預(yù)測患者3年病死的臨床價(jià)值。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

采用SPSS18.0進(jìn)行分析，Sox2 mRNA表達(dá)、DC計(jì)數(shù)等以± s表示，滿足正態(tài)分布且方差齊性則采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，若方差不齊，則采用校正t檢驗(yàn)，若不滿足正態(tài)分布則以M（Q1，Q3）表示，并采用Wilconx秩和檢驗(yàn)，繪制ROC分析Sox2表達(dá)、DC計(jì)數(shù)預(yù)測患者預(yù)后的價(jià)值，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、Sox2、DC計(jì)數(shù)差異

胃癌組織△Ct為10.91±0.75，其Sox2 mRNA相對表達(dá)量顯著低于正常胃黏膜組織△Ct為9.58±0.57，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；患者組外周血DC/PBMC為0.55±0.17，顯著低于正常組的0.77±0.24，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。

二、不同病理特點(diǎn)患者Sox2表達(dá)差異

不同腫瘤分期系統(tǒng)（TNM）、細(xì)胞分化程度、腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)胃癌患者腫瘤組織Sox2表達(dá)、外周血DC計(jì)數(shù)、DC/PBMC比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05，表1、表2）。

表1 70例不同病理胃癌患者Sox2表達(dá)差異（± s）

表1 70例不同病理胃癌患者Sox2表達(dá)差異（± s）

注：*與細(xì)胞分化程度低分化比較；Sox2：性別決定相關(guān)基因簇2；mRNA：信使RNA；TNM：腫瘤分期系統(tǒng)

病理特點(diǎn)例數(shù)Sox2 mRNA（△Ct）Sox2 mRNA（2-△△Ct）P值性別男4112.25±0.911.100.0664女2912.80±1.55年齡＜60歲4310.84±0.711.030.7855≥60歲2710.90±1.13 TNM分期I期/II期22 8.09±0.712.750.0000 III期/IV期4811.69±0.68細(xì)胞分化程度高17 7.25±0.94 3.39*中22 8.44±1.50 2.94*0.0000低3111.80±0.58腫瘤浸潤深度T1/T220 8.22±1.142.560.0000 T3/T45011.95±0.73淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性49 8.48±1.532.700.0000陽性2110.76±0.65

三、Sox2、DC

ROC曲線示，Sox2 mRNA、DC計(jì)數(shù)水平降低預(yù)測患者3年病死的AUC分別為0.877、0.935，均可有效預(yù)測患者預(yù)后（P < 0.05，表3，圖1）。

表3 70例胃癌患者Sox2、外周血DC對3年病死的預(yù)測價(jià)值

圖1 胃癌組織Sox2、外周血DC預(yù)測患者3年病死價(jià)值的ROC曲線

表2 70例不同病理胃癌患者DC計(jì)數(shù)差異（± s）

表2 70例不同病理胃癌患者DC計(jì)數(shù)差異（± s）

注：*與細(xì)胞分化程度低分化比較；DC：樹突細(xì)胞；PBMC：外周血單個(gè)核細(xì)胞；TNM：腫瘤分期系統(tǒng)

病理特點(diǎn)例數(shù)DC（×106/L）P值DC/PBMCP值性別男415.70±1.380.8820.55±0.180.6259女295.65±1.410.57±0.15年齡＜60歲435.63±1.44 0.93010.54±0.190.8343≥60歲275.60±1.300.55±0.20 TNM分期I期/II期226.30±1.410.00010.73±0.140.0000 III期/IV期484.96±1.150.48±0.12細(xì)胞分化程度高176.15±1.320.0165 0.69±0.08*0.0000中225.03±1.17 0.47±0.19*低315.52±1.090.39±0.14腫瘤浸潤深度T1/T2206.12±1.380.00230.61±0.130.0000 T3/T4505.04±1.250.42±0.10淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性496.04±1.140.00380.68±0.130.0000陽性215.17±1.050.49±0.11

討 論

胃癌是嚴(yán)重威脅人類健康的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率高居各類惡性腫瘤的第四位，病死率位居第二，且多數(shù)患者集中于亞洲地區(qū)[8]。隨著胃癌一級(jí)、二級(jí)防治工作的開展，近年來我國胃癌早期檢出率得到了明顯提高，但多數(shù)患者確診時(shí)已處于進(jìn)展期，此時(shí)明確其病理狀態(tài)、預(yù)后轉(zhuǎn)歸特點(diǎn)方為實(shí)施針對性治療的關(guān)鍵[9]。

大量研究表明，惡性腫瘤中少許具有無限增殖能力及多重分化能力的細(xì)胞是導(dǎo)致腫瘤耐藥、浸潤、轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵，該類細(xì)胞被稱為腫瘤干細(xì)胞[10]。作為一種干細(xì)胞標(biāo)志物，Sox2屬Sox基因家族B亞型，是決定胃黏膜上皮分化的重要轉(zhuǎn)錄因子，在早期胚胎發(fā)育和分子調(diào)控中亦扮演著重要角色。有學(xué)者將外源性Sox2基因?qū)胛赣郎?xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期出現(xiàn)明顯停滯、細(xì)胞凋亡增加，提示Sox2在抑制細(xì)胞異常增殖方面具有一定作用[11]。本研究結(jié)果示，胃癌組織Sox2 mRNA表達(dá)顯著低于正常胃黏膜組織，說明Sox2基因表達(dá)缺失可能是造成胃上皮細(xì)胞分化過程異常、無限增殖及癌變的重要原因。此外，亦有學(xué)者指出，Sox2還具有胃分化標(biāo)志物黏蛋白5AC、胃蛋白酶原A表達(dá)作用，并通過多種細(xì)胞表面抗原的相互作用控制胃黏膜上皮細(xì)胞定向分化，而Sox2表達(dá)水平的改變可引發(fā)上皮細(xì)胞分化穩(wěn)態(tài)喪失，導(dǎo)致胃癌惡性演變[12]。故本研究隨著患者TNM分期、細(xì)胞分化程度、腫瘤浸潤深度的加劇及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)，其Sox2 mRNA表達(dá)水平逐漸下降，提示預(yù)后不良。

DC在觸發(fā)初次細(xì)胞免疫應(yīng)答的關(guān)鍵因子，在腫瘤免疫過程中發(fā)揮著強(qiáng)大作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，DC計(jì)數(shù)的降低及功能的衰退可影響T細(xì)胞參與的細(xì)胞免疫過程，導(dǎo)致荷瘤機(jī)體免疫功能減弱，抗腫瘤免疫功能下降[13]。過往研究表明，1個(gè)DC激活的T細(xì)胞數(shù)量高達(dá)100 ~ 3 000個(gè)，故機(jī)體DC水平的下降可顯著影響抗原提呈功能，最終導(dǎo)致初始型T細(xì)胞增殖受限、腫瘤細(xì)胞清除能力下降[14]。在本次研究中，我們發(fā)現(xiàn)，隨著患者預(yù)后質(zhì)量的下滑，其外周血DC計(jì)數(shù)亦呈現(xiàn)下降趨勢，在印證上述結(jié)論的同時(shí)，亦表明DC功能與組織學(xué)類型存在密切關(guān)聯(lián)。此外，Kobayashi等[15]發(fā)現(xiàn)，不同分化類型、病理類型的惡性腫瘤均可能通過某種機(jī)制抑制DC分化發(fā)育，從而提升自身免疫監(jiān)視逃逸能力，導(dǎo)致患者病情進(jìn)一步惡化。

綜上所述，隨著腫瘤組織Sox2 mRNA與DC計(jì)數(shù)水平的下降，患者預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)逐漸升高，據(jù)此實(shí)施預(yù)后評估有望協(xié)助制定更為科學(xué)、合理的治療策略，為患者生存質(zhì)量的改善奠定基礎(chǔ)。本研究的局限性在于未能完全明確Sox2及DC影響胃癌患者預(yù)后的具體機(jī)制，關(guān)于Sox2及DC的具體機(jī)理仍有待進(jìn)一步研究加以明確。

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Effects of stem cell marker Sox2 level and peripheral blood dendritic cell function in gastric cancer tissue on prognosis of gastric cancer

Yang Fan, Chen Zhuo, Pang Hongquan. Department of Gastroenterology, Dazhou Central Hospital, Dazhou 635000, China

Objective To analyze the effect of gastric cancer stem cell marker sex determining region Y-box 2 (Sox2) and peripheral blood mononuclear dendritic cell (DC) function on the prognosis of gastric cancer, So as to provide a reference for the early evaluation of the prognosis of patients with gastric cancer. Methods 70 patients with gastric cancer and 50 healthy subjects were selected. Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction (PCR) was used to detect the expression of Sox2 in gastric cancer tissues and normal gastric mucosa. The peripheral blood DC function was examined. The difference between the two groups with different pathological staging was compared. The receiver operating characteristic curve (ROC) was used to analyze the diagnostic value of Sox2 and DC for the prognosis of gastric cancer. Results Relative expression of Sox2 mRNA in gastric cancer was significantly lower than that in normal gastric mucosa (P = 0.002). Peripheral blood DC/PBMC in patient group was significantly lower than that of the normal group (P = 0.013). The difference of Sox2 expression, DC count and DC/PBMC among gastric cancer patients from different TNM stages (P = 0.006), cell differentiation (P = 0.011), tumor invasion depth (P = 0.007) and lymph node metastasis status (P = 0.000) was statistically significant.The area under ROC curve (AUC) when using Sox2 mRNA expression and the decrease of DC count to predict patients'3-year mortality was respectively 0.877 and 0.935 (P < 0.05), which can forecast the

Stomach neoplasms； Stem cell； Biomarkers； Multigene family； Dendritic cell； Prognosis

2016-04-21）

（本文編輯：李少婷）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2016.05.006

635000 達(dá)州市中心醫(yī)院消化內(nèi)科

龐洪全，Email:Panghq999@163.com

prognosis of gastric cancer. Conclusion The expression of Sox2 and the decrease of DC count in gastric cancer tissue are prognostic factors of poor prognosis in patients with gastric cancer.

楊帆，陳卓，龐洪全. 胃癌組織中干細(xì)胞標(biāo)志物性別決定相關(guān)基因簇2以及外周血樹突細(xì)胞功能對胃癌預(yù)后的影響[J/ CD].中華細(xì)胞與干細(xì)胞雜志:電子版, 2016, 6(5):297-301.