杜偉斌全仁夫鄭宣李強(qiáng)曹國平莊偉邵榮學(xué)楊迪生

·論著·

毛囊干細(xì)胞體外誘導(dǎo)成血管內(nèi)皮細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究

杜偉斌1全仁夫1鄭宣1李強(qiáng)1曹國平1莊偉1邵榮學(xué)2楊迪生3

目的 建立簡單、可靠的毛囊干細(xì)胞體外定向分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的方法。方法 無菌條件下切取1周齡SD大鼠觸須部皮膚，Dispase酶和Ⅳ型膠原酶混合液消化，顯微鏡下分離毛囊隆突部，改良的組織塊貼壁法培養(yǎng)rHFSCs，差速貼壁法純化，流式細(xì)胞儀檢測及細(xì)胞免疫熒光染色聯(lián)合鑒定。用含10 ng/ml和20 ng/ml VEGF165作為主要誘導(dǎo)因子將細(xì)胞分為兩種濃度組別，不傳代的情況下分別在1、2、3周內(nèi)觀察誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)；通過流式細(xì)胞和細(xì)胞免疫熒光染色檢測分化效率；選取最佳誘導(dǎo)因子濃度和工作時(shí)間，對(duì)誘導(dǎo)后的細(xì)胞進(jìn)行體外官腔形成實(shí)驗(yàn)，并在透射電鏡下觀察W-P小體。流式細(xì)胞術(shù)檢測分化效率實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析及獨(dú)立t檢驗(yàn)。結(jié)果 分離、培養(yǎng)、純化的rHFSCs克隆能力好，活力強(qiáng)，生長曲線呈S型。流式細(xì)胞及免疫熒光染色聯(lián)合檢測β1（98.9﹪）、α6整合素（97.9﹪），CK15（68.1﹪）、P63（98.5﹪）呈高表達(dá)，陰性表達(dá)CD31（13.6﹪）、VE-cadherin（17.9﹪）。在誘導(dǎo)液的作用下，兩組細(xì)胞從1周到3周后，均由扁平鋪路石樣改變到完全被長梭形樣細(xì)胞占據(jù)。流式細(xì)胞及免疫熒光染色檢測CD31和VE-cadherin顯示，CD31在誘導(dǎo)1周時(shí)表達(dá)最強(qiáng)，兩種誘導(dǎo)因子比較無差異[（65.27±0.57﹪）vs（66.13±0.60）﹪，t = -1.812，P = 0.145]。而VE-cadherin在誘導(dǎo)1周時(shí)表達(dá)也最強(qiáng)，10 ng/ml要優(yōu)于20 ng/ml VEGF165的誘導(dǎo)作用[（95.57±0.85）﹪ vs（78.10±1.25）﹪，t = 19.977，P = 0.001]。10 ng/ml VEGF165誘導(dǎo)1周后的細(xì)胞體外管腔形成實(shí)驗(yàn)陽性，在透射電鏡下可以觀察到內(nèi)皮細(xì)胞特有結(jié)構(gòu)W-P小體。結(jié)論 毛囊干細(xì)胞體外在10ng/ml VEGF165的誘導(dǎo)下，1周后可成功得到性能良好的血管內(nèi)皮細(xì)胞?？蔀榻M織工程血管、細(xì)胞移植治療缺血性疾病等提供理想的種子細(xì)胞。

毛囊； 干細(xì)胞； 血管內(nèi)皮細(xì)胞； 誘導(dǎo)因子； 組織工程

創(chuàng)傷愈合、再生性循環(huán)及腫瘤形成等一系列生理病理的過程都有賴于血管新生和形成。而血管內(nèi)皮細(xì)胞作為構(gòu)建血管組織間屏障的重要成分，積極參與了這兩個(gè)過程的發(fā)生，所以其也逐漸成為構(gòu)建組織工程化血管主要的種子細(xì)胞[1-2]。但是，內(nèi)皮細(xì)胞自體取材來源有限，極易引起橋血管的狹窄、閉塞而加重對(duì)患者的損傷。且原代分離培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞周期短，增殖能力有限，又極易老化[3-6]。干細(xì)胞可能為解決該問題帶來關(guān)鍵性飛躍。利用干細(xì)胞誘導(dǎo)分化潛能，將其高效定向分化為目的細(xì)胞，成為再生醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)之一[7-8]。毛囊干細(xì)胞（hair follicle stem cells，HFSCs）作為一種具有未分化性、自我更新和體外增殖能力強(qiáng)等特點(diǎn)的干細(xì)胞，存在于毛囊外根鞘隆突部。具有形成心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、黑色素細(xì)胞和表皮層細(xì)胞，血管平滑肌細(xì)胞及結(jié)締組織等多向分化潛能[9-13]。其來源廣，數(shù)量多，自體取材方便，又無嚴(yán)重并發(fā)癥[14-15]。VEGF165是VEGF的5種亞型之一，活性最強(qiáng)，分布范圍最廣，在血管新生、形成及內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化中有重要作用[16-17]。因此，本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用改良的大鼠毛囊干細(xì)胞體外培養(yǎng)方法獲取種子細(xì)胞，利用誘導(dǎo)因子VEGF165進(jìn)行體外定向誘導(dǎo)，并尋求VEGF165的最佳工作濃度和作用時(shí)間。以建立簡單、可靠的毛囊干細(xì)胞定向分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的方法，為組織工程血管、細(xì)胞移植治療缺血性疾病等提供理想的種子細(xì)胞。

材料與方法

一、主要材料及試劑

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：清潔級(jí)1周齡SD大鼠6只，雌雄不拘，體重（24±4）g，由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（浙）2014-0001。

2.主要試劑：DMEM/F12（1:1）培養(yǎng)基、KSR血清替代物、Ⅳ型膠原酶、Dispase酶、Coating Matrix Kit試劑盒、TrypLETMSelect（1X）胰蛋白酶替代酶、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、羥基乙醇（美國Gibco公司）；重組人表皮細(xì)胞生長因子（EGF）、重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）（美國R&D公司）；青-鏈霉素混合液（北京索萊寶科技有限公司）；氫化可的松、臺(tái)盼藍(lán)染色劑（上海生工生物工程有限公司）；Ⅳ型膠原（美國BD公司）；CCK-8試劑盒（杭州諾楊生物科技有限公司）；Integrin-β1抗體（美國Biolegend公司）；Integrin-α6、VE-cadherin抗體（美國Santa Cruz公司）；Keratin-15、p63、CD31抗體（英國abcam公司）；DAPI（瑞士Roche公司）；Recom binant Rat VEGF165（美國Peprotech公司）；胎牛血清（美國Gibco公司）。

二、方法

（一）rHFSCs的分離培養(yǎng)、純化鑒定

1.分離培養(yǎng)及純化：參考文獻(xiàn)方法[18-20]并對(duì)其進(jìn)行改良，1周齡SD大鼠經(jīng)處死；75﹪乙醇消毒；獲取觸須部皮膚；PBS漂洗；1﹪Ⅳ型膠原酶和1﹪Dispase酶混合液消化；Matrix膠包被；體視顯微鏡下分離、脫鞘得到隆突部；并行組織貼壁等步驟后，加入1 ml完全培養(yǎng)基（869 μl/ml DMEM/ F12、100 μl/ml KSR、10 μl/ ml青、鏈霉素混合液、10 μl/ml L-谷氨酰胺、10 μl/ml非必需氨基酸、20 ng/ml EGF、10 ng/ mlbFGF、1 μl/ml羥基乙醇、10 ng/ml氫化可的松）。37℃、5﹪CO2條件下培養(yǎng)1 h，再緩緩加入2 ml完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3 h，待組織基本貼壁后繼續(xù)緩慢加入3 ml完全培養(yǎng)基，之后每2 ~ 3 d換液。培養(yǎng)8 ~ 10 d后用胰蛋白酶（0.25﹪Trypsin + 0.02﹪EDTA）-PBS稀釋液（1:3）漂洗3次，再用TrypLETMSelect（1X）胰蛋白酶替代酶37℃、5﹪CO2培養(yǎng)箱中消化約8 min，并對(duì)呂國忠等[21-22]研究加以改良，用Ⅳ型膠原差速貼壁法，使Ⅳ型膠原室溫預(yù)包被1 h，利用15 ~ 20 min貼壁時(shí)間差，對(duì)

此時(shí)間內(nèi)貼壁的細(xì)胞繼續(xù)用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，達(dá)到篩選純化目的，之后每2 ~ 3 d換液1次；第2代細(xì)胞再純化1次。倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

2.流式及免疫熒光鑒定：收集第3代細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1.0×106個(gè)/ml，PBS離心洗2次。80﹪甲醇將細(xì)胞室溫固定5 min，0.1﹪ PBST將細(xì)胞室溫靜置20 min，5﹪BSA-PBS上搖床封閉30 min；PBS各洗1次。每管流式管100 μl（1X annexin-binding buffer），1×106cell。分別加入Integrin β1-PE；Integrin α6、CK15、P63、CD31、VE-cadherin抗體避光孵育30 min。加入熒光素標(biāo)記羊抗鼠、兔抗鼠二抗避光孵育30 min，PBS洗1次。PBS每管流式管500 μl單懸，上機(jī)流式檢測。同時(shí)每管樣品設(shè)立同型陰性對(duì)照。

同樣以第3代細(xì)胞做爬片。37℃、5﹪CO2培養(yǎng)2 d后，吸去培養(yǎng)液。加入4﹪ PFA-PBS固定10 min，5﹪BSA-PBS室溫封閉，PBS各洗3次×5 min。分別加入一抗Integrin β1、Integrin α6、CK15、P63、CD31抗體（1:100）及VE-cadherin抗體（1:50）。陰性對(duì)照組以PBST代替一抗，排除非特異性二抗的結(jié)合。然后4℃孵育過夜，PBST洗滌后，加入熒光素標(biāo)記羊抗鼠、兔抗鼠二抗避光30 min；加 DAPI（1:2000）染核10 min，避光晾干封片。激光共聚焦顯微鏡下拍照。

（二）VEGF165為主誘導(dǎo)分化rHFSCs

1.向血管內(nèi)皮細(xì)胞的誘導(dǎo)及形態(tài)學(xué)觀察：將VEGF165稀釋成終工作濃度為10 ng/ml 和20 ng/ml，并以此設(shè)置為兩個(gè)誘導(dǎo)濃度組別。將原先培養(yǎng)基中的KSR更換成FBS。其余培養(yǎng)基組分不變。取純化后的第3代rHFSCs，待貼壁細(xì)胞達(dá)到約60﹪融合，逐進(jìn)行體外誘導(dǎo)。誘導(dǎo)時(shí)吸去原培養(yǎng)基，分別加入不同VEGF165濃度的誘導(dǎo)培養(yǎng)基到各自的組別，37℃、5﹪CO2條件下培養(yǎng)，之后每2天換液1次。倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，分別在1、2、3周拍照記錄。

2.流式及免疫熒光檢測CD31和VE-cadherin的表達(dá)：分別在1、2、3周收集兩組誘導(dǎo)后的細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測和細(xì)胞免疫熒光檢測的具體操作步驟如前，分別送檢上機(jī)檢測。

3.體外管腔形成實(shí)驗(yàn)：從-20℃冰箱中取出Matrigel膠放在4℃冰箱中過夜，使之成為液態(tài)。實(shí)驗(yàn)前將移液槍頭、24孔板等器材也置于4℃冰箱中預(yù)冷30 min。實(shí)驗(yàn)過程在冰上操作：按50 μl/cm2濃度Matrigel膠加入到24孔板的一孔中，輕輕晃動(dòng)使之均勻分布，然后放入37℃、5﹪CO2培養(yǎng)箱中30 min，使其成膠。對(duì)最佳誘導(dǎo)因子濃度和工作時(shí)間所誘導(dǎo)的細(xì)胞進(jìn)行收集，按每孔2×105/500 μl接種于Matrigel包被的24孔中。設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，分別繼續(xù)培養(yǎng)2、4、6 h后，在熒光顯微鏡下拍照。

4.透射電鏡觀察W-P結(jié)構(gòu)：取最佳誘導(dǎo)因子濃度和工作時(shí)間所誘導(dǎo)的細(xì)胞，2.5﹪戊二酸PBS沖液固定4 h，經(jīng)過0.1 mol/L PBS漂洗，1﹪鋨酸固定，dd H2O漂洗，2﹪醋酸鈾固定/染色，50﹪、70﹪、90﹪、100﹪乙醇及100﹪丙酮梯度脫水，并通過滲透、包埋、聚合三個(gè)過程。最后超薄切片，醋酸鈾-檸檬酸鉛染色，透射電鏡下觀察誘導(dǎo)后細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。流式細(xì)胞術(shù)檢測分化效率實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用x ± s表示，比較采用單因素方差分析及獨(dú)立t檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、rHFSCs的分離培養(yǎng)和純化

倒置相差顯微鏡觀察到，經(jīng)改良后組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)，毛囊隆突部約2 ~ 3 d開始爬出細(xì)胞，6 ~ 7 d細(xì)胞數(shù)量增加。細(xì)胞排列緊密，呈鋪路石狀分布。用差速貼壁法純化后的P3代細(xì)胞與原代細(xì)胞形態(tài)一致，且呈典型的鋪路石狀，折光度好、克隆性強(qiáng)，具有典型的干細(xì)胞生物學(xué)特性。（圖1）

圖1 倒置相差顯微鏡下觀察rHFSCs（×100）

二、流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果

對(duì)rHFSCs的特征性標(biāo)志物進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測，結(jié)果顯示：rHFSCs特征性標(biāo)志物integrin

β1、integrin α6、P63高表達(dá)，中等表達(dá)CK15，低弱陽性表達(dá)CD31、VE-cadherin。符合rHFSCs標(biāo)記鑒定。（圖2）

三、免疫熒光鑒定結(jié)果

對(duì)rHFSCs進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果顯示：標(biāo)志物integrin β1、integrin α6、CK15、P63均陽性表達(dá)、陰性表達(dá)CD31、VE-cadherin。通過標(biāo)志物的檢測，證明該細(xì)胞是rHFSCs。（圖3）

四、誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)的變化

在誘導(dǎo)液的作用下，兩組細(xì)胞總趨勢變化為：1周后細(xì)胞扁平發(fā)展，核內(nèi)染色質(zhì)增加而顯得更明顯，鋪路石樣轉(zhuǎn)變更顯著。2周后細(xì)胞出現(xiàn)梭形樣改變，并且高濃度誘導(dǎo)因子組早于低濃度組。3周后，細(xì)胞完全被長梭形樣細(xì)胞演變占據(jù)，內(nèi)皮樣形態(tài)消失。（圖4）

五、兩組誘導(dǎo)細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果

圖2 流式細(xì)胞術(shù)對(duì)rHFSCs特征性標(biāo)志物的檢測

圖3 共聚焦熒光顯微鏡下觀察rHFSCs特征性標(biāo)志物（免疫熒光染色×63）

分別在1、2、3周，對(duì)誘導(dǎo)后的兩組細(xì)胞，進(jìn)行血管內(nèi)皮細(xì)胞特征性標(biāo)志物流式細(xì)胞術(shù)檢測，結(jié)果顯示：兩組誘導(dǎo)因子濃度在各自不同時(shí)間點(diǎn)，CD31和VE-cadherin的陽性率隨時(shí)間增加而遞減，且高濃度組隨著時(shí)間的增加，兩個(gè)標(biāo)志物表達(dá)陽性率下降更明顯?？傏厔荼憩F(xiàn)為1周中高表達(dá)，2周低表達(dá)，3周陰性表達(dá)。其中CD31在10 ng/ml和20 ng/ml VEGF165作用下組內(nèi)均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F = 7724.55，P <0.001；F = 17150.570，P <0.001）。而兩

組組間在1、2周比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[（65.27± 0.57）﹪vs（66.13±0.60）﹪，t = -1.812，P = 0.145；（12.87±0.75）﹪vs（11.50±0.66）﹪，t = 2.375，P = 0.076）]，在3周時(shí)雖然比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[（6.57±0.57）﹪ vs（2.43±0.95）﹪，t = 6.49，P = 0.003]，但是陽性率已非常低。又VE-cadherin兩組組內(nèi)亦均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F = 6336.192，P < 0.001；F = 9423.430，P <0.001）。且1、2、3周兩組組間比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[（95.57±0.85）﹪vs（78.10±1.25）﹪，t = 19.977, P = 0.000；（19.07± 0.42）﹪ vs（7.93±0.35）﹪，t = 35.404，P < 0.001；13.30±0.46）﹪ vs（1.03±0.21）﹪，t = 42.212，P < 0.001）。所以CD31在誘導(dǎo)1周時(shí)表達(dá)最強(qiáng)，兩種誘導(dǎo)因子濃度無差異。而VE-cadherin在誘導(dǎo)1周時(shí)表達(dá)也最強(qiáng)，10 ng/ml要優(yōu)于20 ng/ml的誘導(dǎo)作用。（表1、2）

圖4 倒置相差顯微鏡下觀察兩組誘導(dǎo)細(xì)胞（形態(tài)學(xué)變化總趨勢 （×100）

表1 流式細(xì)胞術(shù)檢測誘導(dǎo)后細(xì)胞CD31陽性率（﹪，± s）

表1 流式細(xì)胞術(shù)檢測誘導(dǎo)后細(xì)胞CD31陽性率（﹪，± s）

組別重復(fù)次數(shù)7 d14 d21 dF值P值10 ng/ml365.27±0.5712.87±0.756.57±0.57 7724.5500.000 20 ng/ml366.13±0.6011.50±0.662.43±0.9517150.5700.000 t 值-1.8122.3756.490 P值 0.1450.0760.003

表2 流式細(xì)胞術(shù)檢測誘導(dǎo)后細(xì)胞VE-cadherin陽性率（﹪± s）

表2 流式細(xì)胞術(shù)檢測誘導(dǎo)后細(xì)胞VE-cadherin陽性率（﹪± s）

組別重復(fù)次數(shù)7 d14 d21 dF值P值10 ng/ml395.57±0.85 19.07±0.42 13.30±0.466336.1920.000 20 ng/ml378.10±1.25 7.93±0.35 1.03±0.219423.4300.000 t 值19.97735.40442.212 P值 0.000 0.000 0.000

六、免疫熒光鑒定結(jié)果

對(duì)兩組誘導(dǎo)后細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色結(jié)果顯示：血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31、VE-cadherin在1周均陽性表達(dá)，2周時(shí)表達(dá)減弱明顯，到三周時(shí)均陰性表達(dá)。（圖5）

七、體外官腔形成實(shí)驗(yàn)測試

在流式及免疫熒光染色聯(lián)合鑒定下，得出1周時(shí)成血管內(nèi)皮細(xì)胞效率最高，且兩組濃度的誘導(dǎo)效果無明顯差異，因此選取VEGF165濃度為10 ng/ml的誘導(dǎo)后細(xì)胞進(jìn)行官腔形成實(shí)驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)在

Matrigel膠上2 h開始出現(xiàn)線狀結(jié)構(gòu)，4 h線狀結(jié)構(gòu)增多，官腔逐漸形成，6 h后基本形成完好的管狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。（圖6）

圖5 共聚焦熒光顯微鏡下觀察血管內(nèi)皮細(xì)胞特征性標(biāo)志物 （免疫熒光染色 ×63）

圖6 倒置相差顯微鏡下觀察誘導(dǎo)后的細(xì)胞官腔形成情況 （×40）

八、透射電鏡觀察W-P小體

透射電鏡下，×5 900倍鏡可見細(xì)胞核扁平，核內(nèi)染色質(zhì)較豐富，核仁明顯，胞漿內(nèi)多線粒體、高爾基體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。×17 000倍鏡黑色棒狀結(jié)構(gòu)-W-P小體明顯（黑色箭頭所指），符合內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)特征（圖7）。

討 論

雖然目前大口徑人工血管普遍運(yùn)用，療效可靠。但是小口徑人造血管由于張力高，阻力大，血流速度緩慢，易導(dǎo)致管管堵塞，中遠(yuǎn)期的療效不容肯定[23-25]。因此，利用干細(xì)胞作為種子細(xì)胞將其誘導(dǎo)分化，構(gòu)建組織工程血管越來越有必要去研究并運(yùn)用。

目前研究最多的干細(xì)胞，如胚胎干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞等，都具有多向分化的潛

能和增殖能力強(qiáng)等特點(diǎn)。但是也存在著各自的缺點(diǎn)：如倫理道德觀念的限制，取材不便、易傷供體，來源及數(shù)量有限，異體移植免疫排斥反應(yīng)大等，這勢必延緩了組織工程研究快速發(fā)展的腳步[26-29]。

圖7 透射電鏡下觀察誘導(dǎo)后細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu) （× 5 900）及W-P小體 （× 17 000）

而毛囊干細(xì)胞作為較為新興的種子細(xì)胞研究對(duì)象，存在的先天優(yōu)勢，克服了上述干細(xì)胞的缺點(diǎn)。當(dāng)前對(duì)毛囊干細(xì)胞的鑒定尚無一種確切可靠的特異性標(biāo)志物，所以現(xiàn)階段普遍認(rèn)同運(yùn)用兩種或以上的標(biāo)志物對(duì)其進(jìn)行聯(lián)合鑒定。已有研究表明，整合素家族表達(dá)率越高，目的細(xì)胞的干性越強(qiáng)，分化程度越低。integrin α6、integrin β1都是公認(rèn)的HFSCs表面標(biāo)志物，并常和其他標(biāo)志物用來聯(lián)合鑒定毛囊干細(xì)胞[30-32]。而也有學(xué)者[33]發(fā)現(xiàn)角蛋白K15比K19表達(dá)減少更早，因此逐漸被認(rèn)為K15是較為特異性的HFSCs標(biāo)志物，更有鑒別意義。P63是腫瘤抑制因子之一，也是表皮干細(xì)胞的一種特異性標(biāo)志物，因毛囊隆突部也存在表皮干細(xì)胞，P63也被認(rèn)為是鑒定HFSCs一種有效的標(biāo)志物[34]。本實(shí)驗(yàn)通過改良的大鼠毛囊干細(xì)胞培養(yǎng)、擴(kuò)增、純化、鑒定體系，得到了高效價(jià)的毛囊干細(xì)胞。

干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的方法，作為當(dāng)前干細(xì)胞領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一，常規(guī)可以通過以下不同的途徑來實(shí)現(xiàn)：（1）化學(xué)試劑、誘導(dǎo)液誘導(dǎo)分化；（2）外源性細(xì)胞因子、蛋白誘導(dǎo)分化；（3）轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)分化；（4）通過將干細(xì)胞與其他細(xì)胞共培養(yǎng)的方式誘導(dǎo)干細(xì)胞分化等。而各種誘導(dǎo)所產(chǎn)生的成熟細(xì)胞數(shù)量、純度、成熟度、細(xì)胞移植治療成活率各有不同[35-38]?；谶@些理論，本研究設(shè)計(jì)了將活性最強(qiáng)的VEGF165作為誘導(dǎo)因子，對(duì)毛囊干細(xì)胞進(jìn)行定向分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的探究。

在鑒定毛囊干細(xì)胞是否誘導(dǎo)為血管內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)，本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用流式細(xì)胞技術(shù)、免疫熒光染色、體外官腔形成實(shí)驗(yàn)、透射電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)這四種手段聯(lián)合鑒定。其中，CD31即血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1，VE-cadherin即血管內(nèi)皮鈣黏蛋白，主要表達(dá)在內(nèi)皮細(xì)胞膜和胞漿中，兩者都是鑒定內(nèi)皮細(xì)胞關(guān)鍵性的特異性標(biāo)志物，都可以通過流式技術(shù)和免疫熒光法來鑒定、分選、純化。對(duì)血管內(nèi)皮再生，維持血管內(nèi)皮完整性以及調(diào)節(jié)血管張力等方面具有關(guān)鍵性作用[39-41]。經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，以10 ng/ml VEGF165濃度誘導(dǎo)一周后，流式和免疫熒光顯示CD31和VE-cadherin表達(dá)量明顯增加，效價(jià)最高。1982年，Wagner等人通過透射電鏡觀察到了W-P小體，該細(xì)胞器屬內(nèi)皮細(xì)胞特有，后來被認(rèn)定為最特征性的形態(tài)學(xué)指標(biāo)，而體外官腔的形成多是內(nèi)皮細(xì)胞、吞噬細(xì)胞及部分腫瘤干細(xì)胞的特點(diǎn)。為進(jìn)一步證實(shí)本次誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞在功能和形態(tài)結(jié)構(gòu)上的完整性，即選取效價(jià)最高的10 ng/ml VEGF165組細(xì)胞進(jìn)行體外官腔形成實(shí)驗(yàn)和透射電鏡下觀察W-P小體，結(jié)果顯示6 h后官腔形成完整，W-P小體顯現(xiàn)。運(yùn)用四種手段聯(lián)合鑒定，已證明本實(shí)驗(yàn)的誘導(dǎo)體系的誘導(dǎo)效率較高，細(xì)胞從結(jié)構(gòu)、功能、蛋白表達(dá)等方面都已轉(zhuǎn)化為內(nèi)皮細(xì)胞。

至此，研究不僅改良優(yōu)化了一套較為完整的大鼠毛囊干細(xì)胞分離培養(yǎng)和純化檢測的方法，也建立了一個(gè)較為有效的誘導(dǎo)成為內(nèi)皮細(xì)胞的體系。誘導(dǎo)后細(xì)胞能較好表達(dá)血管內(nèi)皮細(xì)胞的表型，功能和結(jié)構(gòu)也較完善。下一步，通過抑制通路的形式，初步探尋誘導(dǎo)大鼠毛囊干細(xì)胞分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用機(jī)制，并進(jìn)行裸鼠體內(nèi)成血管的實(shí)驗(yàn)，分析細(xì)胞在體內(nèi)的作用能力和效率。為進(jìn)一步進(jìn)行血管構(gòu)建、血管修復(fù)以及促進(jìn)皮膚創(chuàng)面早期血管化研究提供理論依據(jù)，也為缺血性疾病、組織工程皮膚在臨床治療中的應(yīng)用提供了新思路。

1 Sabry D, Noh O, Samir M. Comparative evaluation for potential differentiation of endothelial progenitor cells and mesenchymal stem cells into Endothelial-Like cells[J]. Int J Stem Cells, 2016, 9(1):44-52.

2 許志成, 李宏, 張群. 毛囊干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 組織工程與重建外科雜志, 2012, 8(5):241-244.

3 Choi S, Kim JA, Kim KC, et al. Isolation and in vitro culture of vascular endothelial cells from mice[J]. Korean J Physiol Pharmacol, 2015, 19(1):35-42.

4 Gurel PG, Torun KG, Hasirci V. Infl uence of co-culture on osteogenesis and angiogenesis of bone marrow mesenchymal stem cells and aortic endothelial cells[J]. Microvasc Res, 2016, 29(108):1-9.

5 Liu Y, Xue Q, Tang Q, et al. A simple method for isolating and

culturing the rat brain microvascular endothelial cells[J]. Microvasc Res, 2013, 90:199-205.

6 Gillies PJ, Bray LJ, Richardson NA, et al. Isolation of microvascular endothelial cells from cadaveric corneal limbus[J]. Exp Eye Res, 2015, 131:20-28.

7 Badylak SF, Nerem RM. Progress in tissue engineering and regenerative medicine[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2010, 107(8): 3285-3286.

8 Lasala GP, Minguell JJ. Vascular disease and stem cell therapies[J]. Br Med Bull, 2011, 98:187-197.

9 Xu ZC, Zhang Q, Li H. Differentiation of human hair follicle stem cells into endothelial cells induced by vascular endothelial and basic fi broblast growth factors[J]. Mol Med Rep, 2014, 9(1):204-210.

10 Zc X, Zhang Q, Li H. Human hair follicle stem cell differentiation into contractile smooth muscle cells is induced by transforming growth factor-p1 and platelet-derived growth factor BB[J]. Mol Med Rep, 2013, 8(6):1715-1721.

11 Yamazaki A, Yashiro M, Mii S, et al. Isoproterenol directs hair follicleassociated pluripotent (HAP) stem cells to differentiate in vitro to cardiac muscle cells which can be induced to form beating heartmuscle tissue sheets[J]. Cell Cycle, 2016, 15(5):760-765.

12 Najafzadeh N, Esmaeilzade B, Dastan IM. Hair follicle stem cells:In vitro and in vivo neural differentiation[J]. J Invest Dermatol.World J Stem Cells, 2015, 7(5):866-872.

13 Nishimura EK. Melanocyte stem cells: a melanocyte reservoir in hair follicles for hair and skin pigmentation[J]. Pigment Cell Melanoma Res, 2011, 24(3):401-410.

14 Nath M, Offers M, Hummel M, et al. Isolation and in vitro expansion of Lgr6-positive multipotent hair follicle stem cells[J]. Cell Tissue Res, 2011, 344(3):435-444.

15 Mokos ZB, Mosler EL. Advances in a rapidly emerging fi eld of hair follicle stem cell research[J]. Coll Antropol, 2014, 38(1):373-378.

16 Ye SS, Liu XJ, Mao BY, et al. Paeonol enhances thrombus recanalization by inducing vascular endothelial growth factor 165 via ERK1/2 MAPK signaling pathway[J]. Mol Med Rep, 2016, 13(6): 4853-4858.

17 Liu Q, Zhou HC, Yang XL, et al. Embolus-carried vascular endothelial cell growth factor 165 improves angiogenesis in thromboangiitis obliterans[J]. Genet Mol Res, 2014, 13(1):1744-1752.

18 Wang Y, Liu J, Tan X, et al. Induced pluripotent stem cells from human hair follicle mesenchymal stem cells[J]. Stem Cell Rev, 2013, 9(4):451-460.

19 Yang RH, Xie JL, Shu B, et al. An improved method for the isolation and culture of rat epidermal stem cells[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2013, 6(11):2529-2534.

20 Quan R, Zheng X, Xu S, et al. Gelatin-chondroitin-6-sulfatehyaluronic acid scaffold seeded with vascular endothelial growth factor 165 modifi ed hair follicle stem cells as a three-dimensional skin substitute[J]. Stem Cell Res Ther, 2014, 5(5):118.

21 楊珂, 姜自林, 楊恬. 大鼠毛囊干細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)及增強(qiáng)型綠色熒光蛋白示蹤[J]. 中國組織工程研究與臨床康復(fù), 2008, 12(8):1481-1484.

22 呂國忠, 周紅梅, 趙朋, 等. 體外培養(yǎng)表皮干細(xì)胞復(fù)合高分子支架原位修復(fù)深度燒傷創(chuàng)面的研究[J]. 中華損傷與修復(fù)雜志, 2011, 6(1):20-32.

23 Tang GH, Pinney SP, Broumand SR, et al. Excellent outcomes with use of synthetic vascular grafts for treatment of mycotic aortic pseudoaneurysms after heart transplantation[J]. Ann Thorac Surg, 2011, 92(6):2112-2116.

24 Losi P, Lomhardi S, Briganti E, et al. Luminal surface microgeometry affects platelet adhesion in small-diameter synthetic grafts[J]. Biomaterials, 2004, 25(18):4447-4455.

25 Bznz Y, Rieben R. Endothelial cell protection in xeno transplantation: looking after a key player in rejection[J]. Xenotransplantation, 2006, 13(1):19-30.

26 趙蕊, 呂學(xué)詵. 人胚胎干細(xì)胞建系培養(yǎng)及體外誘導(dǎo)分化的研究進(jìn)展[J]. 國際遺傳學(xué)雜志, 2010, 33(1):12-15.

27 Cao L, Yang F, Liu G, et al. The promotion of cartilage defect repair using adenovirus mediated Sox9 gene transfer of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Biomaterials, 2011, 32(16):3910-3920.

28 Charruyer A, Ghadially R. What's new in dermatology: epidermal stem cells.[J]. G Ital Dermatol Venereol, 2011, 146(1):57-67.

29 魯彥瑋, 王志軍. 組織工程皮膚種子細(xì)胞和支架材料的研究現(xiàn)狀[J].中國美容整形外科雜志, 2011, 22(6):373-376.

30 Kloepper JE, Tiede S, Brinckmann J, et al. Immunophenotyping of the human Bulge region: the quest to define useful in situ markers for human epithelial hair follicle stem cells and their niche[J]. Exp Dermatol, 2008, 17(7):592-609.

31 Eckert RL, Adhikary G, Balasubramanian S, et al. Biochemistry of epidermal stem cells[J]. Biochim Biophys Acta, 2013, 1830(2):2427-2434.

32 Oh JH, Mohebi P, Farkas DL, et al. Towards expansion of human hair follicle stem cells in vitro[J]. Cell Prolif, 2011, 44(3):244-253.

33 Wang GY, Wang J, Mancianti ML, et al. Basal cell carcinomas arise from hair follicle stem cells in Ptch1(+/-) mice[J]. Cancer Cell, 2011, 19(1):114-124.

34 Leirós GJ, Kusinsky AG, Drago H, et al. Dermal papilla cells improve the wound healing process and generate hair Bud-Like structures in grafted skin substitutes using hair follicle stem cells[J]. Stem Cells Transl Med, 2014, 3(10):1209-1219.

35 Preitschopf A, Schoerghofer D, Kinslechner K, et al. Rapamycin-Induced hypoxia inducible factor 2a is essential for chondrogenic differentiation of amniotic fl uid stem cells[J]. Stem Cells Transl Med, 2016, 5(5):580-590.

36 Wang YW, Xu DP, Liu Y, et al. The effect of tumor necrosis factoralpha at different concentrations on osteogenetic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells[J]. J Craniofac Surg, 2015, 26(7):2081-2085.

37 Medhekar SK, Shende VS, Chincholkar AB. Recent stem cell advances: cord blood and induced pluripotent stem cell for cardiac regeneration-a review[J]. Int J Stem Cells, 2016, 9(1):21-30.

38 Tansriratanawong K, Tamaki Y, Ishikawa HA. Co-culture with periodontal ligament stem cells enhances osteogenic gene expression in de-differentiated fat cells[J]. Hum Cell, 2014, 27(4):151-161.

39 Zhang H, Chang H, Wang LM, et al. Effect of polyelectrolyte film stiffness on endothelial cells during Endothelial-to-Mesenchymal transition[J]. Biomacromolecules, 2015, 16(11):3584-3593.

40 Vilgrain I, Sidibé A, Polena H, et al. Evidence for post-translational processing of vascular endothelial (VE)-cadherin in brain tumors: towards a candidate biomarker[J]. PLoS One, 2013, 8(12):e80056.

41 Cheung K, Ma L, Wang GS, et al. CD31 signals confer immune privilege to the vascular endothelium[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2015, 112(43):E5815-E5824.

Induction of hair follicle stem cells into endothelial cells in vitro

Du Weibin1, Quan Renfu1,Zheng Xuan1, Li Qiang1, Cao Guoping1, Zhuang Wei1, Shao Rongxue2, Yang Disheng3.1The Affiliated JiangNan Hospital of Zhejiang Chinese Medical University orthopedics, Hangzhou, 311201, China;2Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China;3The Second Affiliated Hospital, School of Medical, Zhejiang University, Hangzhou 310009, China

Objective To establish a simple, reliable method of hair follicle stem cells directional differentiation into vascular endothelial cells. Methods The tentacles of skin of 1-week SD rat were removed in aseptic condition and digested with Dispase enzyme and type Ⅳcollagenase mixture. The hair follicle bulges were picked out under a microscope. After culture, HFSCs were identified by flow cytometry and immunofluorescence staining. Cells were cultured in the presence of 10 ng/ml and 20 ng/ml VEGF165 and cell morphology were inspected at 1, 2, and 3 weeks. Differentiation efficiency was evaluated by flow cytometry and immunofluorescence staining; Formation of newspeak and W-P corpuscle was observed under transmission electron

Hair follicle； Stem cells； Vascular endothelial cells； Inducible factor； Tissue engineering

2016-04-24）

（本文編輯：蔡曉珍）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2016.05.004

浙江省科學(xué)技術(shù)廳公益技術(shù)研究社會(huì)發(fā)展項(xiàng)目（2010C33133）；杭州市蕭山區(qū)社會(huì)發(fā)展重大科技攻關(guān)項(xiàng)目（2014205）

311201 杭州，浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬江南醫(yī)院骨科1；310053 杭州，浙江中醫(yī)藥大學(xué)2；310009 杭州，浙江大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨科3

全仁夫，Email：quanrenfu@126.com

microscope. The experimental data were compared with one factor analysis of variance and t test. Results rHFSCs formed clone and positive for integrin β1（98.9﹪）, integrin α6（97.9﹪）, CK15（68.1﹪）, and P63（98.5﹪）. Expression levels of CD31（13.6﹪）and VE-cadherin（17.9﹪）were low. Under induction, spindle-shaped cells appeared after 1 week. Cells expressed high-level CD31 in the presence of both 10 ng/ml and 20 ng/ml VEGF165 after 1 week [(65.27±0.57)﹪ vs (66.13±0.60)﹪，t = -1.812，P = 0.145]. VE-cadherin was also expressed after 1 week (95.57± 0.85 vs 78.10±1.25，t = 19.977，P = 0.000）. At the presence of 10 ng/ml VEGF165, induced cells had newspeak and W-P corpuscles specific for endothelial cells. Conclusion With induced factor of 10 ng/mlVEGF165 concentration, rHFSCs can get good performance of vascular endothelial cells successfully after 1 week.which provide vascular tissue engineering, cell transplantation treatment of ischemic diseases ideal seed cells.

杜偉斌，全仁夫，鄭宣，等. 毛囊干細(xì)胞體外誘導(dǎo)成血管內(nèi)皮細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究[J/CD].中華細(xì)胞與干細(xì)胞雜志:電子版, 2016, 6(5):284-291.