都雯玥，王鳴剛，梁劍平，陸錫宏，李雪虎

（1蘭州理工大學生命科學與工程學院，蘭州730000；2中國科學院近代物理研究所，蘭州 730000）

截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌原生質(zhì)體的制備條件優(yōu)化及再生＊

都雯玥1,2，王鳴剛1，梁劍平2，陸錫宏2，李雪虎2

（1蘭州理工大學生命科學與工程學院，蘭州730000；2中國科學院近代物理研究所，蘭州 730000）

以截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌Clitopilus pinsitus為材料，通過單因素和正交實驗，研究菌齡、酶系、酶濃度、酶解時間、溫度及穩(wěn)滲劑對C.pinsitus原生質(zhì)體制備和再生的影響。實驗結(jié)果表明，制備原生質(zhì)體的最佳條件為：5d菌齡，0.4mol/L甘露醇穩(wěn)滲劑，2.0%蝸牛酶和2.0%纖維素酶混合酶，25℃酶解1.5h，原生質(zhì)體產(chǎn)量5.9×107個/mL，其再生率為1.2‰。實驗為截短側(cè)耳素高產(chǎn)菌株原生質(zhì)體誘變育種奠定基礎(chǔ)。

微生物；斜蓋菇屬；原生質(zhì)體；單因素實驗；正交實驗；優(yōu)化

自1951年Kavanagh發(fā)現(xiàn)斜蓋菇屬中個別菌株能夠生產(chǎn)抗生素截短側(cè)耳素以來，研究者進一步發(fā)現(xiàn)還有大約8種斜蓋菇屬的菌種具有產(chǎn)生截短側(cè)耳素的能力，如Clitopiluspinsitus[1，2]。截短側(cè)耳素是二萜類抗生素，研究表明它對青霉素及鏈霉素抗性葡萄球菌具有較高的抗菌作用，而且截短側(cè)耳素經(jīng)過化學基團修飾后，其衍生物具有更強的抗菌性[3，4]。由于截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌發(fā)酵生長較慢，截短側(cè)耳素產(chǎn)量偏低，越來越難以滿足日漸提高的市場需求[5]，所以要求通過工業(yè)誘變育種的方法獲得截短側(cè)耳素高產(chǎn)菌株。

原生質(zhì)體對誘變劑敏感，原生質(zhì)體誘變技術(shù)與常規(guī)誘變相比有較高的突變率并在抗生素、維生素、氨基酸等高產(chǎn)菌株選育中均取得較好的進展[6]。李艷麗對刺芹側(cè)耳原生質(zhì)體進行紫外誘變，選育出多糖和漆酶高產(chǎn)菌株[7]。Stewart使用5%諾瓦酶234在25℃水解2h獲得C.pinsitus原生質(zhì)體并進行常規(guī)誘變處理，選育出截短側(cè)耳素高產(chǎn)菌株[8]。因此，原生質(zhì)體誘變育種是一種工業(yè)育種的重要手段。原生質(zhì)體制備則是原生質(zhì)體誘變育種的基礎(chǔ)，提高原生質(zhì)體產(chǎn)量是該育種技術(shù)成功應用的重要前提[9]。

原生質(zhì)體產(chǎn)量受酶系、菌齡、穩(wěn)滲劑等多個條件的影響。張萍使用纖維素酶、蝸牛酶、溶菌酶對黑曲霉、冬菇、平菇等多種絲狀真菌進行酶解法制備原生質(zhì)體[10]。李江研究菌齡、酶解時間對毛栓菌原生質(zhì)體制備的影響，其制備率為5.0×106個/mL[11]。李春麗優(yōu)化蛹蟲草原生質(zhì)制備溫度、穩(wěn)滲劑等條件，原生質(zhì)體產(chǎn)量為9.2×106個/mL[12]。實驗以C.pinsitus為材料，通過設計單因素實驗和正交實驗，優(yōu)化影響制備C.pinsitus原生質(zhì)體的條件，如破壁酶系、穩(wěn)滲劑、酶解溫度等，為截短側(cè)耳素高產(chǎn)菌原生質(zhì)體誘變育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1）供試菌株。截短側(cè)耳素生產(chǎn)菌Clitopiluspinsitus由山東東藥藥業(yè)股份有限公司提供。

2）培養(yǎng)基及試劑。斜面培養(yǎng)基：麥芽提取物1.9%、葡萄糖0.4%、酵母浸粉0.4%、棉籽粉0.3%、瓊脂2.0%、pH自然。

液體培養(yǎng)基：麥芽提取物1.9%、葡萄糖0.4%、酵母浸粉0.4%、棉籽粉0.3%、硝酸鈣0.05%、碳酸鈣0.05%、pH6.2。

甘露醇穩(wěn)滲劑：按實驗設計濃度，稱取甘露醇溶于去離子水中，高壓滅菌備用。

蔗糖穩(wěn)滲劑：按實驗設計濃度，稱取蔗糖溶于去離子水中，高壓滅菌備用。

硫酸鎂穩(wěn)滲劑：按實驗設計濃度，稱取MgSO4? 7H2O溶于去離子水中，0.22μm濾膜過濾除菌備用

氯化鉀穩(wěn)滲劑：按實驗設計濃度，稱取氯化鉀

溶于去離子水中，高壓滅菌備用。

酶解液：按實驗設計的濃度要求精確稱取溶壁酶（上海索寶生物科技有限公司）、蝸牛酶（上海索寶生物科技有限公司）、纖維素酶溶解于相應穩(wěn)滲劑中，0.22μm濾膜過濾除菌備用。

1.2 方法

1）菌絲培養(yǎng)及收集從斜面培養(yǎng)基鏟取約5mm2大小菌塊，加5mL0.9%NaCl并用研磨器研磨后，菌液接入250mL錐形瓶中，溫度25℃，濕度40%～50%，靜置培養(yǎng)至實驗設計要求的時間[9]。

培養(yǎng)至時間要求的菌絲移入離心管，在15mL離心管中加入5mL0.9%NaCl，振蕩混勻，2000r/min離心10min，棄上清液，重復兩次。加入實驗設計要求的穩(wěn)滲液，2000r/min離心10min，棄上清液，獲得菌絲。稱量記錄菌絲濕重。

2）原生質(zhì)體制備及計數(shù)按照每克菌絲加入5mL酶解液的比例，15mL離心管中加入酶解液，振蕩混勻后放入水浴鍋，按實驗設計要求的溫度、時間酶解，每隔30min振蕩一次。酶解終止后，四層滅菌擦鏡紙過濾酶解混合液[13]。收集濾液，2000r/min離心10min，棄上清液，除去酶解液。沉淀中加入5mL穩(wěn)滲劑，輕微振蕩混勻，2000r/min離心10min，棄上清液，洗去殘余酶解液，重復兩次。最后加入1mL穩(wěn)滲劑，得到原生質(zhì)體懸浮液。血球計數(shù)板計數(shù)。

1.2.3 單因素試驗

1)酶系種類優(yōu)化實驗 選取溶壁酶、蝸牛酶、纖維素酶、溶壁酶蝸牛酶復合酶、溶壁酶纖維素酶復合酶、蝸牛酶纖維素酶復合酶總計6種酶系進行酶解破壁。酶解液濃度2%，0.6mol/L甘露醇穩(wěn)滲劑，25℃酶解2h制備的原生質(zhì)體懸浮液用血球計數(shù)板計數(shù)，以原生質(zhì)體產(chǎn)量最高為指標，篩選最佳制備酶。

2)穩(wěn)滲劑種類優(yōu)化實驗選取甘露醇、蔗糖、硫酸鎂、氯化鉀4中穩(wěn)滲劑制備原生質(zhì)體。確定穩(wěn)滲劑濃度為0.6mol/L,2%溶壁酶，25℃酶解2h制備的原生質(zhì)體懸浮液用血球計數(shù)板計數(shù)，以原生質(zhì)體產(chǎn)量最高為指標，篩選最佳制備穩(wěn)滲劑。

3)酶解時間優(yōu)化實驗 設定0.5h，1.0h，1.5h，2.0h，2.5h，3.0h6個酶解時長。2%溶壁酶，0.6mol/L甘露醇穩(wěn)滲劑，25℃酶解制備的原生質(zhì)體懸浮液用血球計數(shù)板計數(shù)，以原生質(zhì)體產(chǎn)量最高為指標，篩選最佳制備時間。

4）正交實驗設計L(45)正交實驗優(yōu)化菌齡、酶濃度、穩(wěn)滲劑濃度、和酶解溫度條件（見表1）。制備的原生質(zhì)體懸浮液用血球計數(shù)板計數(shù)，以原生質(zhì)體產(chǎn)量最高為指標，篩選最佳制備條件。

表1 原生質(zhì)體制備及再生條件因素水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 原生質(zhì)體制備酶系種類優(yōu)化

如圖1所示，使用2%蝸牛酶＋2%纖維素酶復合酶制備出的原生質(zhì)體產(chǎn)量較高，為1.6×107個/mL。2%纖維素酶，2%溶壁酶＋2%纖維素酶復合酶，以及2%溶壁酶＋2%蝸牛酶復合酶較低，為106個/mL。纖維素酶單酶原生質(zhì)體產(chǎn)量最低。實驗確定使用2%蝸牛酶＋2%纖維素酶復合酶為最優(yōu)酶系。

圖1 不同酶系對原生質(zhì)體制備的影響

2.2 原生質(zhì)體制備穩(wěn)滲劑種類優(yōu)化

有機穩(wěn)滲劑更有利于制備原生質(zhì)體。甘露醇是制備原生質(zhì)體的最優(yōu)穩(wěn)滲劑（如圖2所示）。使用甘露醇穩(wěn)滲劑，原生質(zhì)體產(chǎn)量達到3.9×107個/mL，而使用無機穩(wěn)滲劑，如硫酸鎂穩(wěn)滲劑，其原生質(zhì)體產(chǎn)量僅為5.0×106個/mL。

2.3 原生質(zhì)體制備酶解時間優(yōu)化

根據(jù)圖3所示，隨時間的增加，破壁酶分解細胞壁，使原生質(zhì)體不斷釋放，在酶解1.5h后原生質(zhì)體產(chǎn)

量為9.8×107個/mL。之后原生質(zhì)體產(chǎn)量成平緩下降的趨勢。實驗確定1.5h為最優(yōu)酶解時長。

圖2 不同穩(wěn)滲劑對原生質(zhì)體制備的影響

圖3 酶解時間對原生質(zhì)體制備的影響

2.4 原生質(zhì)體制備其他條件優(yōu)化及再生

正交實驗結(jié)果直觀分析表明（見表2），菌齡對原生質(zhì)體制備有顯著影響（見表3），也是影響原生質(zhì)體再生的主要因素。5d菌齡的菌絲體其原生質(zhì)體產(chǎn)量最高，3d菌齡或9d菌齡的產(chǎn)量偏低，而且5d菌齡的原生質(zhì)體再生率也高于其他的菌齡。溫度對原生質(zhì)體制備影響最低，但是對原生質(zhì)體的再生有較大影響，故為保證原生質(zhì)體再生率較高，實驗選取25℃作為酶解溫度。穩(wěn)滲劑濃度對原生質(zhì)體制備的影響次之，確保原生質(zhì)體生物活性，最有利于原生質(zhì)體產(chǎn)量的穩(wěn)滲劑濃度為0.2mol/L，但實驗表明最適合原生質(zhì)體再生的穩(wěn)滲劑濃度為0.4mol/L，為確保原生質(zhì)體不會脹破，實驗選定0.4mol/L甘露醇為最優(yōu)穩(wěn)滲劑。酶濃度對原生質(zhì)體的制備與再生沒有顯著影響（見表3，表4）。實驗表明2.5%蝸牛酶+2.5%纖維素酶混合酶使原生質(zhì)體質(zhì)量最高，是最佳制備酶濃度，但1.5%蝸牛酶+1.5%纖維素酶混合酶更有利于原生質(zhì)體的再生。

最終確定最佳制備及再生條件為5d菌齡，2.0%蝸牛酶+2.0%纖維素酶復合酶，0.4mol/L甘露醇，酶解1.5h。該條件重復試驗3次，原生質(zhì)體制備量為5.9×107個/mL，其再生率為1.20‰。

表2 正交試驗結(jié)果直觀分析表

表3 原生質(zhì)體制備正交實驗方差分析

表4 原生質(zhì)體再生正交實驗方差分析

3 討論

酶解法制備原生質(zhì)體是一種酶促反應，受酶種類、酶濃度、時間等條件的影響。酶的選取是依據(jù)細胞壁成分和菌種的不同決定的。曹文芩等使用蝸牛酶和溶壁酶的復合酶制備靈芝原生質(zhì)體,陳敏等使用溶壁酶制備杏鮑菇原生質(zhì)體，均獲得滿足實驗需求數(shù)量的原生質(zhì)體[15，16]。實驗考察6種不同酶系，結(jié)果表明適用于C.pinsitus原生質(zhì)體制備的酶系為蝸牛酶和纖維素酶復合酶。真菌細胞壁由幾丁質(zhì)和β-葡聚糖構(gòu)成，蝸牛酶和纖維素酶分別以幾丁質(zhì)和β-葡聚糖為底物分解細胞壁，促使原生質(zhì)體釋放。溶壁酶是分解幾丁質(zhì)和β-葡聚糖的復合酶[17]。實驗溶壁酶中加入蝸牛酶或纖維素酶，原生質(zhì)體產(chǎn)量反而降低，這是由于作用于細胞壁的酶濃度過高導致原生質(zhì)體破裂，結(jié)果降低了產(chǎn)量[18]。實驗酶解時間也是影響原生質(zhì)體制備的重要因素。實驗表明酶解時間不應過長，過長則降低原生質(zhì)體的產(chǎn)量。細胞壁酶解殘余物有助于原生質(zhì)體再生，過長時間的酶解破壞原生質(zhì)體細胞壁，降低其再生率，二是破壁酶降低原生質(zhì)體活性，也會影響再生率[15]。

菌齡對原生質(zhì)體制備有顯著影響。實驗發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)5d的菌絲處于對數(shù)生長期，菌絲量足，細胞壁較薄，最有利于原生質(zhì)體制備[16]。3d菌齡偏小，菌絲嬌嫩，原生質(zhì)體不穩(wěn)定，產(chǎn)量也較低，而9d菌齡偏老，細胞壁較厚，色素沉積，破壁困難[13]。

曹文芩研究發(fā)現(xiàn)有機穩(wěn)滲劑更有利于原生質(zhì)體的穩(wěn)定釋放[15]，與實驗結(jié)果相一致。穩(wěn)滲劑使細胞皺縮，一是形成質(zhì)壁分離的狀態(tài)利于細胞壁分解，二是保證原生質(zhì)體不會脹破，維持其生理活性[16]。穩(wěn)滲劑為破壁酶提供作用環(huán)境，也提供原生質(zhì)體的存在環(huán)境，對原生質(zhì)體制備十分重要。實驗表明甘露醇是最優(yōu)的有機穩(wěn)滲劑，何小慧等研究結(jié)論相符，而穩(wěn)滲劑濃度對原生質(zhì)體產(chǎn)量沒有顯著影響，為避免原生質(zhì)體脹破選擇較高的濃度[14-16]。

實驗靜置培養(yǎng)菌絲進行原生質(zhì)體制備，研究比較搖床培養(yǎng)和靜置培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)后者是最佳菌絲培養(yǎng)方式。搖床培養(yǎng)形成致密的菌絲球，不利于內(nèi)部菌絲與破壁酶接觸，而靜置培養(yǎng)形成絮狀菌絲，增加了菌絲和酶的接觸，提高了原生質(zhì)體產(chǎn)量[9、19]。

影響原生再生關(guān)鍵因素是制備的細胞是否含有細胞核。張萍等[10]觀察制得的原生質(zhì)體，發(fā)現(xiàn)有空泡或不完整的原生質(zhì)體，這些細胞最終都不能再生，所以從絲狀真菌制備原生質(zhì)體的再生率一般都很低。

原生質(zhì)體誘變技術(shù)是對原生質(zhì)體進行物理或化學誘變處理，經(jīng)過再生培養(yǎng)，選育突變菌株。丁曉兵用N＋輻照鈍齒棒桿菌原生質(zhì)體，選育再生菌株，獲得遺傳穩(wěn)定性較好的L-異亮氨酸高產(chǎn)菌，其產(chǎn)率比原始菌株提高43.66%。針對實驗使用的C.pinsitus這類絲狀多核體的擔子菌，特別是其在實驗室環(huán)境培養(yǎng)下不產(chǎn)生孢子這一特點[8]，采用原生質(zhì)體誘變技術(shù)既能獲得單個細胞進行誘變選育，也能拓寬突變株的變異幅度。因此，優(yōu)化截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌原生質(zhì)體制備條件為高產(chǎn)菌株誘變選育奠定了基礎(chǔ)，為微生物誘變育種提供了一種新方法。

[1]Kavanagh F,Hervby A,Robbins W.J Antibiotic Substances From Basidiomycetes.VIII.Pleurotus mutilus(FR.)SACC. AndPleurotusPasseckerianusPilat[J].PNAS,1951,37∶570-574.

[2]Hartley A.J,de Mattos-Shipley K,Collins C.M,et al.Investigating pleuromutilin-producing Clitopilus species and related basidiomycetes[J].FEMSMicrobiolLetter,2009,297∶24-30.

[3]Davidovich C,Bashan A,Auerbach-Nevo T,et al.Induced-fit tightens pleuromutilins binding to ribosomes and remote in teractions enable their selectivity[J].PNAS,2007,104(11)∶4291-4296.

[4]Tsukagoshi T,Tokiwano T,Oikawa H.Studies on the later stage of the biosynthesis of pleuromutilin[J].Biosci.Biotech nol.Biochem,2007,71(12),3116-3121.

[5]Mattos-Shipley K,Hayes R.Collins C,et al,Biobased antibiotics from basidios∶a case study on the identification and manipulation of a gene cluster involved in pleuromutilin biosyn thesis from Clitopilus passeckerianus[R].Proceedings of the 7th International Conference on Mushroom Biology and Mushroom Products,2011,section mycosourced molecules and nutritional quality∶224-231.

[6]丁曉兵,李宗偉,劉曉波等.原生質(zhì)體誘變在工業(yè)微生物育種中的應用進展[J].食品工業(yè)科技.2008,29(7)∶260-262.

[7]李艷麗.原生質(zhì)體技術(shù)篩選刺芹側(cè)耳高產(chǎn)多糖和漆酶菌株的研究[D].吉林∶吉林農(nóng)業(yè)大學,2012.

[8]Stewart K R.Amethod for preparation of protoplasts from Clitopilus pinsitus[J].Journal of Antibiotics,1986,39(10)1486-1487.

[9]朱堅,張鵬.白靈菇原生質(zhì)體制備條件的優(yōu)化[J].中國農(nóng)學通報,2011,27(25)∶153-157.

[10]張萍,馬宗孚.幾種絲狀真菌原生質(zhì)體的形成與再生[J].云南大學學報(自然科學版),1990, 12(3)∶255-261.

[11]李江,袁月祥,閆志英,劉曉風,廖銀章,李娜.毛栓菌原生質(zhì)體制備和再生及單核菌株產(chǎn)漆酶特性[J].菌物學報, 2012,31(1)∶102～109.

[12]李春麗,劉曉蘭,鄭喜群,等.蛹蟲草原生質(zhì)體紫外誘變選育胞外多糖高產(chǎn)菌株.工業(yè)微生物,2011,41(2)∶51-56.

[13]劉玉霞.側(cè)耳屬真菌原生質(zhì)體技術(shù)選育高產(chǎn)菌株研究[D].河北∶河北大學,2006.

[14]何小慧,楊民和.杏鮑菇原生質(zhì)體制備條件的研究[J].安徽農(nóng)學通報,2014,20(06)∶15-17.

[15]張鵬,龔玲鳳,莊衛(wèi)東等.杏鮑菇原生質(zhì)體制備條件初探[J].中國農(nóng)學通報,2013,29(31)∶91-95.

Q93-33

甘肅省隴藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項(Y361010SJ0)項目；甘肅省國際科技合作專項（1504WKCA098）。